Zwei-Photonen- In vivo Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die transkranielle Bildgebung, eine fluoreszenzmarkierte synaptische Struktur in der lebenden Hirnrinde der Maus, mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen. Der erste Schritt nach der Betäubung der Maus besteht darin, eine verdünnte Schädelpräparation durchzuführen. Als nächstes wird der Kopf der Maus mit einer speziell angefertigten Halteplatte ruhiggestellt.

Dann werden Bildstapel durch den ausgedünnten Schädel mit Hilfe von Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen. Letztendlich der Umzug und die Bildgebung. Die zuvor abgebildete Region ermöglichte es, die Dynamik der dendritischen Dornen über verschiedene Zeiträume unter verschiedenen Bedingungen zu verfolgen.

Um sich auf die Operation vorzubereiten, betäuben Sie eine Maus mit Ketamin und Xylazin und führen Sie eine Zehenkneifung durch, um eine vollständige Anästhesie zu gewährleisten. Lege dann die Maus auf ein Heizkissen und rasiere den Kopf mit einer Rasierklinge. Wischen Sie die Haut mit abwechselnden Alkoholpads ab, um den rasierten Bereich zu sterilisieren und alle Reste von Haarschnitten zu entfernen.

Tragen Sie außerdem sanft Augensalbe auf beide Augen auf. Machen Sie dann einen geraden Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und bewegen Sie die Haut seitlich zu den Rändern des Schädels. Entfernen Sie dann das am Schädel befestigte Bindegewebe, um mit der Vorbereitung des ausgedünnten Schädels zu beginnen.

Identifizieren Sie zunächst die gewünschte Bildgebungsregion anhand ihrer relativen Position zur Mittellinie und zum bgma. Befeuchten Sie dann den Schädel mit Kochsalzlösung, um das Gefäßsystem zu beobachten und so zu vermeiden, dass der Schädel in einem Bereich mit großen Blutgefäßen ausgedünnt wird, da diese das Eindringen von Licht blockieren und die Bildstrukturen verwischen. Sobald ein Bereich mit einem Durchmesser von 0,5 bis einem Millimeter ausgewählt wurde, verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, um einen kreisförmigen Bereich des Schädels auszudünnen.

Bewegen Sie den Bohrer parallel zur Schädeloberfläche, anstatt ihn gegen den Schädel zu halten und nach unten zu drücken, um Schäden durch Überhitzung zu vermeiden. Vermeiden Sie einen längeren Kontakt zwischen dem Bohrer und dem Schädelbohrer, bis sowohl die äußere kompakte Knochenschicht als auch die mittlere schwammige Knochenschicht entfernt sind. Verwenden Sie anschließend eine mikrochirurgische Klinge, die in einem Winkel von etwa 45 Grad gehalten wird, um die innere kompakte Knochenschicht in der Mitte des ausgedünnten Bohrerbereichs zu verdünnen.

Den Schädel abkratzen, ohne gegen den Schädel zu drücken, bis ein gleichmäßig ausgedünnter Bereich von 200 bis 300 Mikrometern Durchmesser und einer Dicke von etwa 20 bis 30 Mikrometern entsteht. Sobald der Schädel ausreichend ausgedünnt ist, entfernen Sie vorsichtig die Knochenreste. Der nächste Schritt besteht darin, die Kopfplatte anzubringen, die aus Rasierklingen mit scharfen Kanten besteht, die mit Klebebändern bedeckt sind.

Beginnen Sie damit, einen kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber auf jede Kante der mittleren Öffnung der Kopfplatte zu geben. Zentrieren Sie dann die Kopfplatte auf dem verdünnten Bereich. Halte es fest gegen den Schädel.

Ziehe nun die Haut vorsichtig von den Seiten des Schädels bis zu den Rändern der mittleren Öffnung der Kopfplatte. Halten Sie die Kopfplatte ein bis zwei Minuten lang an Ort und Stelle. Warten Sie dann weitere acht bis neun Minuten, bis die Kopfplatte gut am Schädel befestigt ist.

Setzen Sie nach 10 Minuten die Kopfplatte auf die beiden seitlichen Blöcke der Halteplatte. Ziehen Sie anschließend die Schrauben über den Rändern der Kopfplatte fest, um die Maus auf der Halteplatte zu fixieren. Betrachten Sie den Kopf der Maus durch ein Präpariermikroskop, während Sie den Rücken der Maus sanft polstern, um sicherzustellen, dass der Kopf richtig ruhiggestellt ist.

Spülen Sie anschließend den freiliegenden Schädel mit Kochsalzlösung ab, um den nicht polymerisierten Kleber zu entfernen und die zuvor abgebildete Region zu verlagern. Machen Sie in den folgenden Bildgebungssitzungen ein Foto des Gefäßsystems des ausgedünnten Bereichs des freiliegenden Schädels, das als Karte eins bezeichnet wird. Platzieren Sie dann die Maus unter dem bildgebenden Mikroskop und lokalisieren Sie den ausgedünnten Bereich unter dem 10 x Luftobjektiv.

Verschieben Sie den dünnsten Bereich mithilfe der Epi-Fluoreszenz in die Mitte der Ansicht. Gib nun einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Oberseite des Schädels und wechsle zum 60 x Objektiv. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem die einzelnen dendritischen Stacheln entlang der Dendriten deutlich sichtbar sind.

Identifizieren und beschriften Sie die entsprechende Region auf Karte eins, indem Sie das Gefäßsystem zwischen der Epi-Fluoreszenzansicht und dem Gefäßfoto vergleichen. Stimmen Sie als Nächstes die Wellenlänge des Zwei-Photonen-Lasers entsprechend den Fluor-Vieren ab. Mit dem 60-fach-Objektiv erfassen Sie dann Bildstapel in zwei Mikrometerschritten entlang der Z-Achse, die einen Bereich von etwa 200 Mikrometern x 200 Mikrometern abdecken.

Dies wird als Karte zwei bezeichnet und wird verwendet, um das dendritische Segment des Bildes während nachfolgender Bildgebungssitzungen zu verschieben. Erfassen Sie jetzt neun Bildstapel in Karte zwei mit dem dreifachen Digitalzoom. Jeder Bildstapel deckt eine ungefähre Fläche von 70 Mikrometern x 70 Mikrometern mit 0,7 Mikrometerschritten entlang der Z-Achse ab.

Nach der Bildgebung lösen Sie die Kopfplatte vorsichtig vom Schädel. Verwenden Sie anschließend eine mikrochirurgische Klinge, um den restlichen Kleber vom Schädel zu entfernen. Spülen Sie dann den Schädel und die Haut mehrmals mit Kochsalzlösung ab und vernähen Sie die Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Nähten.

Halten Sie das Tier während der Genesung auf einem Heizkissen in einem separaten Käfig und verabreichen Sie Buprenorphin analgetisch subkutan gegen postoperative Schmerzen. Nach vollständiger Genesung bringen Sie das Tier in das Ausgangsmessgerät zurück. Um Dendriten an einem anderen Tag erneut abzubilden, betäuben Sie das Tier und legen Sie den Schädel frei. Wiederholen Sie wie zuvor die Ruhigstellung des Kopfes, indem Sie die Kopfplatte montieren und an der Halteplatte befestigen.

Lokalisieren Sie dann die zuvor abgebildete Region, indem Sie das Gefäßmuster mit Karte eins und das dendritische Astmuster mit Karte zwei vergleichen. Wenn innerhalb einer Woche eine erneute Bildgebung durchgeführt wird, kann die dünne Schicht des neu gewachsenen Knochens mit einer mikrochirurgischen Klinge entfernt werden. Wenn nach mehr als einer Woche eine erneute Bildgebung durchgeführt wird, verwenden Sie zuerst den Mikrobohrer, dann die mikrochirurgische Klinge, um den Schädel zu verdünnen.

Passen Sie nun die Position und Ausrichtung unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop an, um Bildstapel zu erhalten, die mit den zuvor aufgenommenen Bildstapeln übereinstimmen. Lassen Sie die Maus nach der Aufnahme der Bilder sich erholen und wie zuvor in ihren Käfig zurückkehren, und ein Bild des Gefäßmusters, das den dünnen Schädelbereich umgibt, der als Karte eins bezeichnet wird, wird als Referenz für alle nachfolgenden Bildgebungssitzungen verwendet. Der schwarze Kasten zeigt den Bereich, in dem zwei Photonen-in-vivo-Bilder aufgenommen wurden.

Dieses Bild der dendritischen Äste im motorischen Kortex einer einen Monat alten Maus wird als Karte zwei bezeichnet. Das weiße Feld zeigt das dendritische Segment, das für die Bildgebung ausgewählt wurde. Im Laufe der Zeit wurden zwei Photonen-Bildgebungen desselben dendritischen Segments am Tag Null, am zweiten Tag, am vierten und am achten Tag durchgeführt.

Neu gebildete Stacheln. Das heißt, Stacheln, die in der vorherigen Bildgebungssitzung nicht vorhanden waren, werden durch Pfeilspitzen dargestellt, die zwischen den Bildgebungssitzungen eliminiert wurden, werden durch die Pfeile angezeigt. Philip Podia werden durch Sterne angezeigt, sobald sie gemeistert sind.

Diese Technik kann in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.