Name: Behavioral Phänotypisierung von murinen Krankheitsmodelle mit dem Integrated Behavioral Station (INBEST) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Lernen Sie die kontinuierliche Verhaltensphänotypisierung von Mausmodellen mit dem modularen INBEST-System. Diese Methode ermöglicht stressarme Langzeitüberwachung im Heimkäfig für zuverlässige neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Ontario Mental Health Foundation für B.S. und ein Ontario Graduate Stipendium für M.K. unterstützt.

Alle Vorgänge werden von der McMaster University Animal Care Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit Richtlinien der Canadian Council von Animal Care Set durchgeführt. 1. Allgemeine Verfahren <ol><li> Gewöhnen Mäuse für 1-2 Wochen zu einem bestehenden 12 Stunden Hell- / Dunkel-Zyklus (zB von 8.00 bis 08.00 Uhr). Führen Sie alle und Prüfung während des Nacht-Rhythmus, mit RT, Feuchtigkeit und Lichtintensität relativ konstant. </li><li> Mark oder Schwanz-Tätowierung alle Mäuse für einfache, numerische Identifikation über einen längeren Zeitraum und mit ihnen umgehen 1-2 Stunden täglich über 5-7 Tage. </li><li> Wiederholen Sie die tägliche Messungen der rektalen Temperatur, Körpergewicht und Futter- / Wasseraufnahme zu erkennen potenzielle Fieber und / oder Mangelernährung durch Alterung oder Krankheit Fortschritte induziert. Standard-Ausschlusskriterien zählen niedriges Körpergewicht durch reduzierte Futter- / Wasseraufnahme, gekrümmte Haltung mit gekräuselten Fell, Hydrocephalus, Porphyrin-Entladung um die Augen usw. </li><li> Um identify Ausfallerscheinungen, die Gesamtaktivität und Leistung verwechseln kann, führen Sie Standard sensomotorische Tests wie der hinteren Gliedmaßen umklammert Reflex 13, visuelle Platzierung Reflex 14, Geotaxis Test 15, Korb-Test 16, Strahl Gehtest 17-19, Rotarod 20 und Geruchstests 21. Hinweis: Die Ergebnisse können auch Korrelationsanalyse mit INBEST Maßnahmen, mehr sorgfältige Auswahl von anderen Verfahren (zB Morris-Wasserlabyrinth, wenn Mäuse sind blind, neuartige Objekt testen, ob Mäuse hyposmic / anosmic), Reduzierung der innerhalb der Gruppe Variabilität und helfen Ausschluss von Mäusen, die mit der Geburt Mängel oder Infektionen. </li><li> Reinigen Sie die Kunststoff- und Glasapparaturen mit Desinfektionsmittel im Urin Wanderwege zu entfernen, während die Prüfung Mäuse von Experimental- und Kontrollgruppe in abwechselnder Weise. </li></ol> 2. Integrated Behavioral Station (INBEST) Verfahren <ol><li> Start-Käfig einrichten <ol><li> Füllen Futterspenders mit 20 mg Mäusefutter Pellets. </li><li> Füllen Sie Flaschen mit Leitungswasser. Hinweis: Eine zweite Flasche mit einer Lösung von Interesse, wie Saccharose oder Saccharin-Lösung für eine Präferenztest ausgefüllt werden. </li><li> Wiegen Sie Flaschen, die Lautstärke am Ende der Sitzung verbraucht berechnen. </li><li> Legen Flaschenstutzen in die lickometers. Sicherstellen, dass die Düse nicht den Infrarot-Sensor blockieren; wenn ja, reduzieren Sie die Länge der Tülle. </li><li> Zeigen Unterstände in der ausgewählten Ecke des Home-Käfig. </li></ol></li><li> Computer einrichten Hinweis: Die Softwarebefehle in Schritten von 2,2 bis 2,11 vorgesehen sind für die Ethovision XT 8.5 Software-Paket und die Testbedingungen in unserem Labor (in der Liste der Materialien / Ausrüstung angegeben). <ol><li> Erhellen den Raum mit diffusem, Dämmerlicht, die ausreichend für Video-Tracking ist, aber nicht reflektiert die Box, Boden oder den Wänden. </li><li> Öffnen Sie ein Standard-Video-Tracking-Projekt und die Einrichtung der Experiment-Einstellungen, durch die Eingabein entsprechenden Angaben (zB Datum / Uhrzeit der Studie, Gruppenzuordnung, Raumbedingungen usw.). Anschließend wählen Sie die entsprechende Videoquelle (Picolo Diligent Grabber), Anzahl der Arenen (4) Tracking-Punkte, (Zentrum, Nasen- und Schwanzpunkt) und Maßeinheiten (Zentimeter, Sekunden und Grad). </li><li> Nach Auswahl der Registerkarte Testliste unter Setup definieren die Anzahl der Versuche durch Klicken auf die Schaltfläche Hinzufügen Trials (1). Geben Sie anschließend mit Hilfe der Variable Schaltfläche Hinzufügen unabhängigen Variablen (zB Maus ID, Geschlecht, Gruppenzugehörigkeit, Stamm). </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Settings Arena und erfassen das Hintergrundbild aus der Live-Video. Definieren Sie die Parameter der einzelnen Arena darzulegen, den äußeren Umfang mit dem entsprechenden Zeichen-Tool (wie erstellen Rechteck / Polylinie / Ellipse). </li><li> Als Nächstes fügen Sie Zonen von Interesse, indem Sie auf die Schaltfläche Gruppe hinzufügen Zone und der Darstellung der verschiedenen Zonen (zB Boden, lickometers, Futterspender, Klettergitter <em&gt; etc.) in gleicher Weise. In versteckten Zonen für die Bereiche, in denen sich die Maus nicht zu sehen ist (zB Schutz und Laufrad, Abbildung 2) indem Sie auf den Hinzufügen Versteckte Schaltfläche Zonengruppe. Stellen Sie sicher, dass ein Einreise- / Ausreise angegeben ist und zu jedem versteckten Zone verbunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 für jede Arena. Führen Arena Kalibrierung durch Hervorhebung Kalibrierung und mit dem entsprechenden Werkzeug (erstellen Kalibrierungsskala / Achsen) an Arena Breite und Länge bieten. Schließlich bestätigen Arena Einstellungen mit einem Klick auf die Schaltfläche Validate Arena Einstellungen. </li><li> Markieren Sie die Registerkarte Teststeuerungseinstellungen und geben Sie Start- / Stopp-Bedingungen und Testlänge. Stellen Sie die Startbedingung zu beginnen, wenn die Dauer der Mittelpunkt 1 s in der Arena überschreitet. Bearbeiten Sie die Testdauer durch die Erweiterung der Stoppbedingung Box und die Einstellung der Studie nach einer Verzögerung zu beenden, etwa 10 Stunden. </li><li> Auf der Registerkarte Erkennung Einstellungen, markieren Sie die entsprechenden Nachweismethoden (zB, Dynamische Subtraktion und modellbasierte). </li><li> Anschließend greifen die Referenzbild der leeren Arena, indem Sie auf die Schaltfläche Einstellungen auf der Registerkarte Erkennung und Drücken der Greifer Aktuelle Taste. </li><li> Stellen Sie den Kontrastbereich, so dass das Zentrum, Nase und Schwanz-basierten Erkennung für jede Maus zuverlässig, genau und kontinuierlich. Für Albinomäuse, anzugeben, dass die Maus ist heller als der Hintergrund und dunkler als der Hintergrund bei Verwendung eines pigmentierten Stammes. Anmerkung: Die Objektgröße und Video Abtastrate kann entsprechend dem Abstand zwischen dem Überkopfkamera und dem Objekt sowie die Verarbeitungsgeschwindigkeit des verwendeten PCs (zB 14.9 Bilder / s) verändert werden. </li><li> Stellen Sie sicher, alle Änderungen vor dem Verlassen des Erkennungseinstellungen Modul gespeichert. </li><li> Schalten der Schnittstelleneinrichtung, die zum Umwandeln von aufgezeichneten analogen Ereignisse von Eingabegeräten (beispielsweise Unterbrechung des Infrarotstrahls, der Bewegung des Laufrades usw.) in di verantwortlichgital-Protokolle. </li></ol></li><li> Datenerfassung Hinweis: Die folgenden Software-Befehle sind für die maßgeschneiderte Med PC IV-Routine (&quot;Wizard&quot;), die Schritt-für-Schritt-Eingang des Sitzungsparameter bietet (zB 10 h Versuchsdauer, Maus ID, Gruppenzuordnung etc.). <ol><li> Platzieren Sie jede Maus in die zugeordnete Feld. </li><li> Synchronisieren Video- und Event-Tracking-Pakete, indem Sie gleichzeitig die Tasten der &quot;Record&quot;. </li><li> Lassen Sie den Versuchsraum leise. </li><li> Wenn die Aufnahmezeit abgelaufen ist (zB einige Stunden, Tage oder Wochen), entfernen Sie Mäuse und bringt sie in ihre Heimatkäfige. </li><li> Messen Flaschengewichte und speichern Sie alle digitalen Aufnahmen auf digitalen Medien (Festplatte, tragbare USB-Stick, DVD). </li><li> Übertragen Sie Rohdaten in eine Tabellenkalkulation. </li><li> Speichern Sie die MPG-Dateien für nachfolgende Scoring von seltenen Verhaltens Handlungen (zB Stereotypie, Krampfanfälle). </li></ol></li></ol>

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Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels wird von Med Associates, Inc. (St. Albans, VT) gefördert.

Der Nachweis von funktionellen Wirkungen bei Tieren hängt weitgehend von der Fähigkeit des Forschers die Variabilität inhärenten Verhaltensstudien begrenzen. Daher ist es wichtig, die Kontrolle und Minimierung der potentiellen minutiös verwechselt, die die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Verhaltensdaten verringern kann. Gleichzeitig ist es wichtig, zu erkennen, dass kein Test spiegelt eine einzelne Domäne des Verhaltens ist, dass das Wissen der neurologischen Funktion zwingend, und das Verhalten ist sehr empfindlich gegenüber externen Belastungen. Wenn die oben genannten Postulate geschätzt werden, kann man schließen, dass umfassende Verhaltensanalyse sollte den zeitlichen Verlauf der Reaktion gemessen sind, als auch, betreffen grundlegende funktionale Merkmale und Paradigmen, die Hahn in spezifische Verhaltensaspekte. Viele dieser Kriterien kann mit computergestützten Beurteilung der Bewegungen und Verhaltensakte in angereicherter hausKäfigUmgebung erfüllt werden. Bisher war es emphasized, dass Verhaltens Phänotypisierung von Mausmodellen menschlicher Erkrankungen garantiert zusätzliche Überlegungen. Diese Auffassung beruht auf der Prämisse, dass funktionelle Homöostase wird durch interne und externe Stressoren während der Ausbruch der Krankheit in Frage basiert. Obwohl alle potenziellen verwechselt möglicherweise nicht durch die Einführung von automatisierten, haus Käfig Phänotypisierung beseitigt werden, sind Fragen der inkonsistenten Umwelteinstellungen, Transport Stress und wiederholtem Umgang minimiert. Diese deutliche Steigerung Konstanz und Präzision in allen Studien; sogar einer leichten Abnahme der Variabilität Nachweis der Auswirkungen von einer beginnenden Erkrankung induzierte verbessern. Tatsächlich bietet INBEST eine Fülle von Informationen, die eine genauere Beurteilung des Beginns, der Kinetik und der Schwere von Verhaltensänderungen, sowie wichtige Beziehungen zwischen verschiedenen krankheitsbedingten Verhaltensstörungen ermöglicht. Zuverlässigen Videoverfolgungs hängt von zwei Lichtverhältnissen. Zunächst wird diffuses Licht in den Testraum erforderlich, um zu verhindern,Artefakte aus dem nahe gelegenen reflektierenden Objekten. Zweitens kann eine hohe Farbkontrast, indem ein geeigneter Bodenfarbe, von der Subjektfarbe so viel wie möglich unterscheiden erreicht werden. In unserem Labor wird dies durch den Einsatz Flutlichter unter den INBEST Boxen und schwarzen Boden Schalen bei der Überwachung von Albinomäusen positioniert erreicht (weiß oder grau Hintergrund wäre es ausreichend, wenn die Prüfung pigmentierte Stämme). In Bezug auf die Ereignisaufzeichnung Aspekt INBEST die aktuelle Hardware-Einstellung (1 Piccolo-Grafikkarte mit 4 Eingängen) begrenzt 4 Boxen, gleichzeitig pro PC eingesetzt werden. Dies ist eine ziemlich kleine Anzahl von Boxen, während ein geeigneter Aufbau würde erfordern, 8 oder sogar 16 Käfige und somit 2 bzw. 4 PCs verbunden. Vorzugsweise kann INBEST kontinuierlich über 24 h als die Heimat-Käfig verwendet werden. Dies würde es Tiere in vollem Umfang in die Umgebung zu gewöhnen und zu etablieren stabile zirkadianen Verhaltensmuster, die unvoreingenommen analysiert werden kann. Computerdatenverlust durch Stromausfall, einer Dauerleistung so zu verhindernpply (oder zumindest eine unterbrechungsfreie Stromversorgung) muss gesichert sein. Schließlich, um die richtige Bewertung der täglichen Nahrungsaufnahme zu gewährleisten, ist darauf hinzuweisen, dass die Größe der Futterpellets sollte die Größe der Löcher in der Lebensmittelausgabegerät (die empfohlene Größe einer Futterpellet ist 20 mg) nicht übersteigt. Es ist nicht zu übersehen ist jedoch, dass diese Analyse auch integrieren, wie verschiedene INBEST Maßnahmen können miteinander interagieren. Zum Beispiel Mäuse, die mehr Zeit im Laufrad verbringen dürften, größere Mengen an Nahrung und Wasser aufnehmen, um ihre erhöhte kalorische Anforderungen zu erfüllen. Ebenso kann Mäuse Einnahme mehr Saccharose-Lösung ihre Nahrungsaufnahme zu verringern. Die Interpretation dieser Ergebnisse kann ferner durch die allgemeine Verbesserung der Leistung über die Zeit schwierig sein, insbesondere im Hinblick auf das Verhalten und Laufrad Aktivität Ingestiv. Angesichts ihrer Incentive-Eigenschaften können Experimentatoren auch der Zugriff auf Saccharose-Lösung und t betrachtener Laufrad, um die Wahrscheinlichkeit postingestive Effekte und übermäßiger Gewichtsverlust bzw. entgegenzuwirken. Allerdings können diese Bedenken mehr relevant in einigen Stämmen als andere, weil verschiedene Stämme von Mäusen haben unterschiedliche Verhaltensprofile. Funktioniert zwar sowohl Grundlinie und experimentelle Bestimmung Steuerungen für viele der oben genannten Probleme, müssen Experimentatoren zu erkennen, dass diese Variablen müssen bei der Interpretation INBEST Daten genommen werden. Zur gleichen Zeit können einige Aspekte des Verhaltens nicht im Heimatkäfig Umwelt untersucht werden, was es muss eine Kombination mit Standard-Tests, um die Verhaltensprofil der Patienten zu beenden. Computergesteuerte Überwachungs innerhalb standardisierte, aber flexible Umgebungen scheint der nächste logische Schritt in der heutigen Verhaltensanalyse sein. Eine solche nicht-invasive, ethologisch basierten Ansatz wird es den Forschern ermöglichen das gesamte Repertoire der Verhaltensantworten über einen längeren Zeitraum zu beobachten. Dieoretically, kann dies durch das Studium Verhalten in einem &quot;virtuellen&quot;, angereichert Umgebung, die sehr ähnlich ist einen natürlichen Lebensraum durchgeführt werden. Mehrere Arbeitsgruppen Vision-basierte Tracking-Tools, die Verhaltens Phänotypisierung von Mäusen in ihren Heimatkäfig 22-25 unterstützt beschrieben, in Dyaden 26, 27, oder im Rahmen der großen gesellschaftlichen Gruppen 28. Hohe Genauigkeit und räumliche Auflösung kann durch Integration von Video-Nachführung mit Mikrochip-Technologie zum gleichzeitigen und synchronisierten Sammlung von Verhaltensdaten in einer Gruppe von Mäusen 28 erreicht werden. Wärmebildkameras zum Aufspüren von Wärme-Signaturen können mit implantierbaren Mikrochips oder Transponder kombiniert werden, um die relative Position und grundlegenden physiologischen Funktionen von jeder Maus (zB Körpertemperatur, Herz / Atemfrequenz) zu liefern. Darüber hinaus würde eine fortgeschrittene 3D-Tracking-System genauer und quantitative Erkennung von Verhaltens Handlungen zu produzieren. Um die wiederholte Ausführung einer variety von Tests, sollte ein solches System automatisiert werden, ferngesteuert, und modular. Beispielsweise kann das räumliche Gedächtnis in größeren Umgebungen durch die Programmierung der Erscheinung des distalen Hinweise auf LCD-Wände, oder durch die Vorlage / Ausblenden Spender mit schmackhaften Speisen aus beweglichen Böden untersucht werden. In ähnlicher Weise könnte eine neuartige Gegenstände präsentiert / zu bestimmten Zeitpunkten während der Studie ausgeblendet werden. Solche computergestützten Phänotypisierung kann bei der Aufklärung der genetischen Determinanten des Verhaltens, der pathogenen Mechanismen der Krankheitsmodellen und der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Wenn ein Konsens in Bezug auf Testbedingungen, Reihenfolge der Tests, sowie die Hard- und Software erreicht ist, kann man erwarten, dass lang erwartete Standardisierung würde Reproduzierbarkeit der Verhaltensstudien zu verbessern und zu erhöhen experimentellen Psychometrie auf ein neues Niveau.

Schnelle Fortschritte in der Gentechnik in den letzten Jahrzehnten eine beispiellose Vermehrung von Tiermodellen von Krankheiten des Menschen geführt. Mäuse haben den Status der primären Versuchspersonen in den biomedizinischen Wissenschaften aus mehreren Gründen gewonnen. Vom praktischen Standpunkt aus, sie haben eine hohe Wiedergabegeschwindigkeit, sind relativ preiswert und leicht zu beherbergen. Aus konzeptioneller Sicht sind sie genetisch nah an den Menschen, genetisch relativ leicht geändert werden, und haben hochentwickelte endokrine, Immunsystem und Nervensystem. Zusätzlich zu den Veränderungen auf genetischer und zellulärer Ebene, zeitgenössische Studien von Gehirn-Erkrankungen erfordern die Demonstration replizierbar funktionelle Defizite, dass Highlight Gesicht, konstruieren oder prognostische Validität eines neuen Mausmodell ein. Die akute Infektion in einem Säuger homoeothermic oft zur fiebrige Reaktion, die zusammen mit Krankheitsverhalten, bildet eines derHauptüberlebensmechanismen 2. Akut kranke Tiere zeigen signifikante Veränderungen in Futter- / Wasseraufnahme und Leistung in Aufgaben reflektierende emotionaler Reaktivität Erkundungsverhalten und Lernen / Speicherkapazität. Diese Veränderungen weitgehend entfallen eingeschränkter sozialer / sexuelle Aktivität und die Erhaltung der Energie für defensive Immunreaktionen. Allerdings, wenn akuten Zuständen schalten chronischen (wie in vielen immunologischen, metabolischen und neurologischen Erkrankungen zu sehen ist), Verhaltensleistung kann weiter verschlechtern aufgrund struktureller Schäden verschiedener Organe, einschließlich des Gehirns 3. Mensch und Tier neurodegenerativen Erkrankungen werden häufig von einer Konstellation von neurologischen und Verhaltensdefiziten einhergeht. Daher ist ein wesentliches Ziel in Verhaltensstudien von chronisch kranken Tieren zum zentralen Effekte aus den Defiziten durch periphere Symptome induzierten unterscheiden. , Begrenzt die collect jedoch die relativ kurze Dauer der Standard-VerhaltensaufgabenIonen von Informationen über die grundlegenden Funktions Maßnahmen wie Riechen, Ruhen, Schlafen, Futter- / Wasseraufnahme, oder epileptische Anfälle. Die Einbeziehung dieser Maßnahmen verbessert Verhaltensprofilierung und ermöglicht eine bessere Interpretation der Leistung in aktivitäts anspruchsvolle Aufgaben. Ergebnis in verhaltens Phänotypisierung von erkrankten Mäusen Die Unzulänglichkeiten bei der Beurteilung der Verhaltensprofil von kranken Mäusen haben die kontinuierliche Überwachung von einzeln untergebracht Mäusen durch schnelle Verarbeitungs PCs notwendig. Obwohl diverse Verhaltens Batterien kann so gestaltet werden 4, 5, die unten aufgeführt sind die Verfahren, die verwendet wurden, um ein Tiermodell für neuropsychiatrische Lupus 6 erfolgreich zu etablieren. Diese Batterie ist wiederholt in beiden subchronischen und chronischen Krankheitsmodelle (Abbildung 1), wie zum Beispiel milder kognitiver Beeinträchtigung und Alzheimer 7 angewendet. Nach einer Reihe von neurologischen Tests 8-10, acustom gemachte Vorrichtung entwickelt, um die oben genannten Anforderungen durch den Einsatz kontinuierlicher Überwachung mehrerer Verhaltens Ausgänge in angereicherter hauskäfigartigen Umgebung zu erfüllen, kann verwendet werden. Solch eine artgerechte basierten Ansatz für die Bewertung der spontanen Erkundungstätigkeit und motiviertes Verhalten bietet ein umfassenderes Verständnis von Leistungsdefiziten in anderen Paradigmen, wie sie repräsentativ für Lernen und Gedächtnis. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/51524/51524fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung der Längsverhaltens Phänotypisierung in unserem Labor. Die Verhaltens Batterie entworfen, um von Lessing Richtung mehr- belastenden Aufgaben, die zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt werden, um die Auswirkungen der anhaltenden Faktoren wie Krankheitsprogression zu beurteilen entwickeln, pharmakologische Behandlung oder immunologische Reaktionen. INBEST und einzelnen Tests werden während der dunklen p durchgeführthase, oft über 10 und 2 h zuge Abkürzungen:. R - Reflexe; BW - Strahl Gehen Test; RR - Rotarod; OT - Geruchstests; SP - Saccharose Vorlieben Test; SD - Step Down-Test; NEIN - Novel Objekt Tests; VON - Freifeldtest; SAB - Spontane Alter Verhalten; FS - Forced Swim-Test; MWM - Morris Wasser-Labyrinth. * - Aspekte des Tests (beispielsweise Standort, Kontext, Farbe, Form), die müssen in nachfolgenden Studien im gesamten Verlauf des Experiments geändert werden. Kontinuierliche Videoaufzeichnung und Analyse des Verhaltens in einem Heim-käfigartigen Umgebung wurden erstmals im Jahr 2007 11 ausgewiesen. Eine komplexere automatische Vorrichtung, die Verhaltenstests in Studien mit autoimmunen Mäusen integriert wurde auf der &quot;Messverhalten&quot; ein Jahr später treffen vorgestellt 12. Die Integrated Behavioral Station (INBEST, 2A) ist ein modulares System, das comprises einer Unterkunft, computergesteuerte Lichtreiz, zwei Fotozelle lickometers (eine für Wasser, eine für eine Lösung von Interesse), eine automatische Futterspender, ein EDV-Laufrad und ein digitalisiertes Klettergitter. Latenzzeiten, Frequenzen und Dauern von spezifischen Verhaltensweisen sind mit kundenspezifischer Software untersucht. Bewegungs- und Erkundungstätigkeit (zB eines neuartigen Objekt oder einer fremden Artgenossen) mit Video-Tracking-Software (Liste der Werkstoffe / Ausrüstung) bewertet werden, während des Schlafes und weniger häufige Verhaltensmuster, wie selbstverletzendes Verhalten und Anfälle können manuell mit Video-Tracking-Software oder spezielle Ereignis-Aufzeichnung Pakete gewertet. Acht vollständige INBEST / Video-Einstellungen werden verwendet, so dass die gleichzeitige Überwachung von 4 Versuchs und 4 Kontrolltieren (2B). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/51524/51524fig2.jpg" /&gt; Abbildung 2. Integrated Behavioral entfernt. (A) Schematische Darstellung der Hardware und Software bei der Gestaltung einer INBEST Feld (L = 39 x B = 53 x H = 50 cm) verwendet. (B) Acht vollständige INBEST Boxen bieten die Möglichkeit zur gleichzeitigen Heimkäfig Überwachung von vier experimentellen und vier Kontrollmäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51524/51524fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Abhängige Variablen sind Messungen der Futter- / Wasseraufnahme, Reaktionsfähigkeit auf schmackhaftes Stimulation, spontane Bewegungsaktivität, Klettern, freiwillige Lauf, Angst-Verhalten (zB Erforschung von neuartigen Objekt), Körperpflege, Fressen und Schlafen. Darüber hinaus können visuelle Reize für die Konditionierung und Lernparadigmen vorgestellt. Die Vorteile INBEST über Standard-Verhaltenstests umfassen die Eliminierung von Störfaktoren Auswirkungen INDUCvon Transportbeanspruchungen sowie kontinuierliche, automatisierte Sammlung von Maßnahmen reflektierende der nächtlichen Aktivität, Erforschung, Angst-und depressive ähnlichen Verhaltensweisen ed. Die Integration von empfindlichen Hardwarekomponenten mit einem Videoverfolgungspaket liefert eine Vielzahl von Informationen, die eine verbesserte Beurteilung des Verhaltens in verschiedenen Tiermodellen ermöglicht in Bezug auf Progression von chronischer Krankheit. INBEST kann verwendet werden, um andere chronische Erkrankungen des ZNS (z, Autismus, schwerer Depression, Schizophrenie), als auch in Langzeitstudien mit Schwerpunkt auf die neurologische Entwicklung, Verhaltenswirkungen von systemischen / neoplastischen Erkrankungen und verlängert Pharmakotherapie untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Power Control Interface Bedienpaket</td><td>Med Associates Inc.</td><td>MED-SYST-8 Interface-Box</td><td>und PCI-Karte, die alle A/D-Datenein- und -ausgänge verwaltet</td></tr><tr><td>Stimulus light</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-221M</td><td>28 V DC, 100 mA, 2,5 Zoll; Licht mit cm Durchmesser (zur Präsentation eines konditionierten Stimulus)</td></tr><tr><td>Kopfeintrittsdetektor</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-254-CB</td><td>Ermöglicht die Erkennung des Eindringens des Kopfes in den Pelletbehälter</td></tr><tr><td>Photobeam Lickometer</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-351W</td><td>Infrarot-Sensorsystem zur Erkennung des Abfangens von Strahlen durch die Schnauze</td></tr><tr><td>Lebensmittelpellets</td><td>Bio-Serv</td><td>F0163</td><td>Staubfreie Präzisions-Lebensmittelpellets (20 mg Nagetierfutter auf Getreidebasis)</td></tr><tr><td>Lebensmittelspender</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-203-20</td><td>Automatisiertes Lebensmittelausgabesystem, bestehend aus einem erhöhten Kunststoffbehälter und einem Ausgaberohr</td></tr><tr><td>Lebensmittelbehälter</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-303R2W</td><td>Infrarotempfindliche Basis zur Signalisierung, wenn Lebensmittelpellets ausgegeben oder gesammelt werden</td></tr><tr><td>Kletternetz</td><td>Med Associates Inc.</td><td>CT-Klettergitter</td><td>Langlebige Metallsprossen, Abmessungen</td></tr><tr><td>Med PC IV Software</td><td>Med Associates Inc.</td><td>SOF-735</td><td>Integriert die Datenerfassung von allen elektronischen Geräten</td></tr><tr><td>MPC2XL v1.4</td><td>Med Associates Inc.</td><td>SOF-731</td><td>Dienstprogramm zur Datenübertragung</td></tr><tr><td>Soft CR Pro v1.05</td><td>Med Associates Inc.</td><td>SOF-722</td><td>Online-Fernüberwachungssoftware</td></tr><tr><td>Laufrad</td><td>Med Associates Inc.</td><td>CT-MSUB-ENV-3042-X1</td><td>Aktivitätsrad für Mäuse</td></tr><tr><td>Digitaler Zähler</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ESUB-ENV-3000</td><td>LCD-Zähler (4 Zählungen = 1 Umdrehung = 54,6 cm Länge)</td></tr><tr><td>Picolo Diligent Framegrabber</td><td>Euresys</td><td></td><td>Hochauflösende PCI-Videoaufnahmekarte</td></tr><tr><td>Ethovision XT 8.5</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>Video-Tracking-Software</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Panasonic</td><td>WV-BP334</td><td>Digitale Videokamera mit niedrigem Lux, die an einem speziell angefertigten Metallständer aufgehängt</td></tr><tr><td>ist Video Splitter</td><td>American Dynamics</td><td>ADQUAD87</td><td>Integriert und digitalisiert Eingaben von 4 Videokameras</td></tr></tbody></table>

behavioral phänotypisierung von murinen krankheitsmodelle mit dem integrated behavioral station (inbest)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Aufgrund der raschen Fortschritte in der Gentechnik, sind kleine Nagetiere werden die bevorzugten Themen in vielen Disziplinen der biomedizinischen Forschung. In Studien zur chronischen ZNS-Störungen, gibt es eine zunehmende Nachfrage nach murine Modelle mit hoher Validität auf der Verhaltensebene. Doch mehrere pathogenen Mechanismen sowie komplexe Funktionsdefizite oft zu verhängen Herausforderungen zuverlässig zu messen und zu interpretieren Verhalten chronisch kranker Mäuse. Daher erfolgt die Prüfung des peripheren Pathologie und einer Verhaltensprofil zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung einer Reihe von Tests erforderlich sind. Video-Tracking, Verhaltens-Spektroskopie und Remote-Übernahme von physiologischen Maßnahmen neue Technologien, die für eine umfassende, genaue und unvoreingenommene Verhaltensanalyse in einem Home-Base-ähnliche Einstellung zu ermöglichen. Dieser Bericht beschreibt eine raffinierte Phänotypisierung-Protokoll, das eine maßgeschneiderte Überwachungsvorrichtung (Integrated Behavioral Station, INBEST), die auf längere Messungen ba konzentriert beinhaltetsic Funktionsausgänge, wie spontane Aktivität, Futter- / Wasseraufnahme und motiviertes Verhalten in einer relativ stressfreien Umgebung. Technische und konzeptionelle Verbesserungen INBEST Design kann weiter zu fördern Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Verhaltensstudien.

Abbildung 3 zeigt beispielhaft zu unterschiedlichen Lesarten zu einer verlängerten Verhaltensstudie mit CD1-Mäusen. Daten repräsentieren Basisleistung (6-2 Tage vor der Operation), postoperativen Erholung (Tage 2 bis 4) und die Verhaltenseffekte durch anhaltintra cerebro-ventrikulären Verabreichung Gehirn reaktive Antikörper induziert (Tage 6 bis 10, wobei 0 bedeutet, die Operation Tag). Analyse mit Event-Recording-Software zeigt, dass die Versuchsgruppe zeigt Beeinträchtigungen in Nahrungsaufnahme Verhalten, wie von einer niedrigeren Frequenz der Wasserflasche Licks (A) hervorgeht, erhöhte Latenz, um die Saccharose-Lösung (B) zu nähern, und verringerte Nahrungsaufnahme (C) während die Versuchsdauer. Gleich mit diesen Veränderungen, sie zeigen auch verminderte Laufrad Wirksamkeit im Vergleich zur Maus (D) zu steuern. Wie von Video-Tracking-Software gemessen, ambulates die experimentelle Gruppe auch weniger in der Heimat-Käfig (E) und zieht es vor, mehr Zeit im Tierheim (F) zu verbringen. Diese Verhaltensunterschiede einWieder auf Probe ethograms (G) veranschaulicht. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51524/51524fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Variablen in einer Reihe von 10-stündigen täglichen Sitzungen, welche die Diskriminante Kraft des INBEST System. Experimental Mäuse trinken weniger Wasser (A), brauchen länger, um Saccharose-Lösung nähern ((Hirnreaktive Antikörper über 2 Wochen ausgesetzt) B), und verbrauchen weniger Nahrung (C) während des Testzeitraums. Zeitgleich mit diesen Änderungen, sie zeigen auch eingeschränkter Aktivität, wie durch reduzierte Laufrad Anzahl (D) veranschaulicht, verringert Gehfähigkeit (E) und längerer Aufenthalt im Tierheim (F). Diese Verhaltensunterschiede auf Probe ethograms (G) veranschaulicht. Das obere Feld zeigt das Verhalten von einem experimentellen Maus an Tag 6, gekennzeichnet durch reduzierte Nahrungsaufnahme Verhalten,unteren Laufradaktivität und erhöhte Heim Zeit im Vergleich zu einer Kontrollmaus Empfang eines Fahrzeugs (unten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51524/51524fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Längerer und umfassende Überwachung der Mäuse in einem Heim-Käfig-Umgebung bietet ein tieferes Verständnis für abweichendes Verhalten in Mausmodellen der Erkrankungen des Gehirns. Dieses Papier beschreibt die Integrated Behavioral Station (INBEST) als wesentlicher Bestandteil der modernen Verhaltensanalyse.

Behavioral Phänotypisierung von murinen Krankheitsmodelle mit dem Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Verhaltensphänotypisierung und experimenteller Mäuse durch kontinuierliche Überwachung grundlegender Verhaltensparameter in einer vertrauten Umgebung zu verbessern. Dieses modulare System besteht aus einem digitalisierten Klettergitter, einem computergesteuerten Laufrad, einem automatisierten Futterdispenser, zwei photozellenkontrollierten TERs, einem computerkontrollierten Lichtreiz, einem Unterschlupf sowie Komponenten von Drittanbietern und Infrarot-MPEG4-Technologie, die mit Video-Tracking- und Ereigniserfassungs-Softwarepaketen verknüpft sind, um acht Versuchsanlagen zu schaffen, die die gleichzeitige Überwachung von vier experimentellen und vier Kontrolltieren ermöglichen. Latenzen, Frequenzen und Dauern spezifischer Verhaltensweisen werden mithilfe der MED PC 4-Software analysiert.Während die motorische Aktivität und die Topographie der Bewegungsbahnen mit der Software ETH ovision XT 8.5 unter Verwendung umfassender statistischer Analysen bewertet werden, wurden die Daten häufig aufbereitet, um Verhaltensänderungen aufgrund des Krankheitsverlaufs in verschiedenen Mausmodellen aufzuzeigen. Die komplexe und empfindliche Natur des Verhaltens erschwert zuverlässige Messungen bei chronisch kranken Mäusen oft erheblich.Mithilfe neuer Technologien, die eine genaue, unvoreingenommene Verhaltensanalyse ermöglichen. Wir beschreiben ein eigens entwickeltes Überwachungssystem namens Inves oder Integrierte Verhaltensstation. Diese Vorrichtung wurde entwickelt, um über einen längeren Zeitraum grundlegende funktionelle Parameter wie spontane Aktivität, Nahrungs- und Wasseraufnahme, emotionale Reaktivität und motivationsgesteuertes Verhalten in einer stressarmen, wohnortähnlichen Umgebung zu messen.Die Hauptvorteile von Invest gegenüber einzelnen Verhaltensprüfungen umfassen eine kontinuierliche Überwachung, eine geringere Transportbelastung und eine schnelle Erfassung mehrerer Datensätze, die sofort für eine objektive computergestützte Analyse bereitstehen. Obwohl die kontinuierliche Überwachung Störfaktoren adressiert, die bei traditionellen Studien häufig auftreten, ist zu beachten, dass bestimmte Verhaltensbereiche wie neurologische Funktion und räumliches Lernen nicht im Heimkäfig-Umfeld untersucht werden können, weshalb zusätzliche Tests erforderlich sind. Um das Verhaltensprofil vollständig zu erfassen, gewöhnen Sie die Mäuse ein bis zwei Wochen vor Versuchsbeginn an einen 12-zu-12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel. Die Mäuse sind nachts am aktivsten.Legen Sie den Zeitraum des Dunkelzyklus so fest, dass er den Arbeitszeiten des Experimentators entspricht. Alle anderen Umweltfaktoren wie Temperatur und Belüftung sollten während dieses Zeitraums konstant bleiben. Für eine dauerhafte numerische Kennzeichnung tätowieren Sie die Mäuse fünf bis sieben Tage vor der Untersuchung am Schwanz.Die Mäuse regelmäßig bis zu zwei Stunden pro Tag handhaben, um sie an die Stressmessung zu gewöhnen, und das Körpergewicht, die rektale Temperatur erfassen sowie Notizen zu ihrem allgemeinen Erscheinungsbild anfertigen. Mäuse mit offensichtlichen Auffälligkeiten wie geringem Futter- oder Wasserverbrauch, Gewichtsverlust, hängender Körperhaltung, zerzaustem oder verfärbtem Fell, Hydrozephalus oder Porphyrinausscheidung um die Augen herum von der Studie ausschließen. Zusätzlich kann während dieses Zeitraums eine Vielzahl von Verhaltensuntersuchungen wie der offene Feldtest durchgeführt werden, um ein umfassenderes Verständnis von Leistungsdefiziten zu ermöglichen.Für eine langfristige Verhaltensstudie sollte die Futteranlage mit einer vollen Versorgung an Futterpellets für Mäuse ausgestattet sein. Jedes Pellet wiegt 20 Milligramm. Eine Flasche sollte stets mit frischem Leitungswasser gefüllt sein.Bei einem Präferenztest kann eine zweite Flasche eine alternative Lösung von Interesse bereitstellen, beispielsweise eine Zuckerlösung. Wiegen Sie die Flaschen, um das zwischen den Sitzungen konsumierte Volumen abzuschätzen. Um Latenz und Frequenz der Trinkphasen zu messen, müssen die Flaschenschnabel an TERs angeschlossen werden.Ein Infrarotsensor erfasst das Lecken. Stellen Sie daher sicher, dass der Sensor nicht durch die Ausgabedüse blockiert ist. Ändern Sie gegebenenfalls die Länge der Ausgabedüse, sodass sie in den Käfig passt. Ein Unterschlupf sollte in einer Ecke platziert werden, die der Laufradseite gegenüberliegt.Für die Video-Verfolgung ist es notwendig, dass der Raum mit einem schwachen, diffusen Licht beleuchtet ist, das nicht vom Boden oder den Wänden des Versuchsraums reflektiert wird. Sobald die Beleuchtung korrekt eingestellt ist, kann die Testarena für die Testsoftware digitalisiert werden. Für diese Demonstration wird das Softwarepaket ETH Ovision XT 8.5 verwendet, um die Arena einzurichten.Öffnen Sie zunächst ein Standard-Tracking-Projekt und geben Sie die experimentellen Einstellungen ein. Wählen Sie dann die Videoquelle, in diesem Fall den Piccolo Diligent Grabber. Stellen Sie die Anzahl der Tracking-Arenen auf vier ein.Wählen Sie die Nasenmitte und den Schwanz als Nachverfolgungspunkte aus und wählen Sie die Messgrößen aus der Versuchsliste unter „Weiter“. Definieren Sie unter dem Menü „Einrichten“ die Anzahl der Versuche, indem Sie auf die Schaltfläche „Versuche hinzufügen“ klicken. Aktivieren Sie dann die Option „Variable hinzufügen“, um unabhängige Variablen wie die Maus-ID, das Geschlecht, die Gruppenzugehörigkeit und den Stamm anzugeben.Erstellen Sie nun ein Hintergrundbild der Arena, indem Sie auf den Reiter „Arena-Einstellungen“ klicken und den Umfang der Arena mithilfe der verfügbaren Zeichenwerkzeuge definieren. Nachdem die Arena definiert ist, verwenden Sie die Option „Zone hinzufügen“, um Bereiche von Interesse wie den Boden, die TERs, die Futterausgabevorrichtung usw. abzugrenzen. Fügen Sie anschließend Zonen hinzu, in denen die Maus nicht sichtbar sein kann, indem Sie die Option „Versteckte Zonen-Gruppe hinzufügen“ nutzen. Dazu gehören der Unterschlupf und das Laufrad.Jeder versteckte Bereich sollte außerdem einen festgelegten Ein- und Ausstiegspunkt aufweisen. Nach der Definition des Umfangs und der Zonen jedes Areals führen Sie Kalibrierungstests mithilfe der Kalibrierungsoption in der Software durch. Verwenden Sie das Skalierungs-Werkzeug, um Breite und Länge jedes Areals zu bestimmen.Überprüfen Sie anschließend die Einstellungen jeder Arena mithilfe der Schaltfläche „Validieren“ und fahren Sie mit der Festlegung der Versuchsparameter und der Datensammlung fort. Um Daten zu erfassen, müssen zunächst die Aufnahmeparameter im Programm festgelegt werden. Öffnen Sie dazu die Registerkarte „Versuchssteuerungseinstellungen“ und legen Sie die Zeitrahmen für den Versuchsdurchlauf fest.Die Startbedingung, um zu beginnen, wenn die Dauer des Mittelpunkts im Arena mehr als eine Sekunde beträgt. Die Dauer des Versuchs wird festgelegt, indem das Feld für die Stoppbedingung erweitert und der Versuch so eingestellt wird, dass er nach einer vordefinierten Verzögerung, beispielsweise 10 Stunden, beendet wird. Wählen Sie nun eine Option aus der Erkennungsmethode unter der Registerkarte „Erkennungseinstellungen“. Greifen Sie anschließend mithilfe der Einstellungsschaltfläche und durch Auswahl von „Aktuelles Bild erfassen“ das Referenzbild der leeren Arena ab, während Sie sich noch im Erkennungsmodul befinden, und passen Sie den Kontrastbereich für die Erkennungspunkte der Körpermitte, der Nase und des Schwanzes an. Stellen Sie den Bereich auf kontinuierlich ein.Dann angeben, ob die Maus heller oder dunkler als der Hintergrund ist. Nun die Objektgrößeneinstellung anpassen, die auf dem Sichtfeld der Kamera basiert. Danach gegebenenfalls die Bildrate der Analyse entsprechend der Leistungsfähigkeit des Computers anpassen.Verarbeitung von 14,9 Bildern. Die zweite ist normalerweise ausreichend. Nachdem alle Änderungen an den Optionen des Erkennungsmoduls vorgenommen wurden, sollten diese gespeichert werden, bevor die Latenz, Frequenz und Dauer von Verhaltensakten gemessen werden.Eine benutzerdefinierte Routine in MED PC IV wird zur schrittweisen Eingabe der Sitzungsparameter wie Maus-ID, Versuchsdauer, Laufrad-Episoden usw. verwendet. Sobald alle Parameter eingegeben sind und sämtliche Testausrüstung eingeschaltet wurde, setzen Sie fort, indem Sie die Maus in die Versuchsanlage platzieren. Synchronisieren Sie anschließend die Video- und Ereigniserfassungssoftware, indem Sie gleichzeitig die Aufnahmetasten drücken, und verlassen Sie leise den Raum. Wenn die Aufnahmedauer abgelaufen ist, bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück, messen Sie das Gewicht der Flaschen und speichern Sie alle aufgezeichneten Daten auf digitalem Speichermedium.Die Rohdaten können zur Analyse in eine Tabellenkalkulation exportiert werden, und die Rohvideodateien können auf seltene Verhaltensweisen wie Stereotypien oder Anfälle hin ausgewertet werden. Eine langfristige Studie mit CD1-Mäusen unter Verwendung des in best wurde mehrere Tage vor der Operation durchgeführt. Es wurden Basisliniendaten erhoben, gefolgt von postoperativen Daten, die eine anhaltende intrazerebroventrikuläre Applikation von hirnreaktiven Antikörpern umfassen.Ab Tag fünf zeigten die experimentellen Gruppen verschiedene Beeinträchtigungen, darunter eine verminderte Ableckung von Wasserflaschen. Außerdem zeigten sie eine verlängerte Latenz beim Annähern an Flaschen mit Sucralose-Lösung sowie eine verringerte Nahrungsaufnahme. In Übereinstimmung mit diesen Veränderungen zeigten die Mäuse, denen gehirnreaktive Antikörper verabreicht worden waren, im Vergleich zu Kontrollmäusen eine verminderte Laufradaktivität; die Beweglichkeit, gemessen mittels der Video-Tracking-Software, war ebenfalls reduziert.In der Versuchsgruppe verbrachten die behandelten Mäuse vorzugsweise ihre Zeit in den Unterschlüpfen. Anhand dieser Daten wurde ein einfaches Programm erstellt, um diese Verhaltensunterschiede zu veranschaulichen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine selbstgebaute Überwachungsvorrichtung für eine unvoreingenommene Verhaltensanalyse einrichtet.Unter bedingungen, die einer häuslichen umgebung ähneln, liefert die automatisierte phänotypisierung im wohnkäfig eine fülle an informationen, die eine genauere beurteilung der einsetzkinetik und schwere von krankheitsbedingten verhaltensdefiziten ermöglichen, die mit spontaner lokomotion, motiviertem verhalten und emotionaler reaktivität zusammenhängen, indem probleme aufgrund inkonsistenter umgebungsbedingungen, transport, stress und wiederholtem handling vermieden werden; apparate wie inves können somit die konsistenz und präzision verhaltensbezogener ergebnisse über verschiedene studien hinweg erheblich verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Vollautomatisches System zur Messung physiologisch sinnvollen Eigenschaften der Mechanismen der Vermittlung räumliche Lokalisierung, zeitliche Lokalisierung, Dauer, Geschwindigkeit und Wahrscheinlichkeitsschätzung, Risikobewertung, Impulsivität und die Genauigkeit und Präzision der Erinnerung, um die Auswirkungen der genetischen und pharmakologischen Manipulationen bewerten grundlegenden Mechanismen der Kognition bei Mäusen.

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