Behavioral Phänotypisierung von murinen Krankheitsmodelle mit dem Integrated Behavioral Station (INBEST)

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Verhaltensphänotypisierung und der Versuchsmäuse durch kontinuierliches Monitoring grundlegender Verhaltensmessungen in einer vertrauten Umgebung zu verbessern. Dieses modulare System besteht aus einem digitalisierten computergesteuerten Laufrad aus Klettergittern, einem automatisierten Futterspender, zwei fotozellengesteuerten TERs, einem computergesteuerten Lichtreiz und einem Unterstand, Komponenten von Drittanbietern und Infrarot-MPEG-FOUR-Technologie, die in Videoverfolgung und Ereignisaufzeichnung integriert sind. Softwarepakete sind miteinander verbunden, um acht Arenen zu schaffen, die die gleichzeitige Überwachung von vier Versuchs- und vier Kontrolltieren ermöglichen. Latenzen, Häufigkeiten und Dauern bestimmter Verhaltensweisen werden mit der Software MED PC four analysiert.

Die Bewegungsaktivität und die Topographie der Bewegungsbahnen werden mit der Software ETH ovision XT 8.5 unter Verwendung einer umfassenden statistischen Analyse bewertet. Die Daten wurden oft verarbeitet, um Verhaltensänderungen aufzudecken, die durch das Fortschreiten der Krankheit in verschiedenen Mausmodellen induziert werden. Die komplexe und empfindliche Natur des Verhaltens macht zuverlässige Messungen bei chronisch kranken Mäusen oft sehr schwierig.

Einsatz neuer Technologien, die eine genaue, unvoreingenommene Verhaltensanalyse ermöglichen. Wir beschreiben ein maßgeschneidertes Überwachungssystem namens Inves oder Integrated Behavioral Station. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es langwierige Messungen grundlegender funktioneller Leistungen wie spontane Aktivität, Nahrungs- und Wasseraufnahme, emotionale Reaktivität und motiviertes Verhalten ermöglicht, und das alles in einer stressarmen Umgebung zu Hause.

Zu den Hauptvorteilen von Invest gegenüber einzelnen Verhaltenstests gehören die kontinuierliche Überwachung, die Reduzierung des Transportstresses und die schnelle Erfassung mehrerer Datensätze, die sofort für eine unvoreingenommene computergestützte Analyse eingespeist werden. Obwohl die kontinuierliche Überwachung Verwirrungen behebt, die in traditionellen Studien üblich sind, ist es wichtig zu beachten, dass einige Verhaltensbereiche, wie z. B. die neurologische Funktion und das räumliche Lernen, nicht in der häuslichen Käfigumgebung untersucht werden können, so dass zusätzliche Tests erforderlich sind. Um die Bewertung des Verhaltensprofils abzuschließen, ein bis zwei Wochen vor Beginn des Experiments, Beginnen Sie, die Mäuse an einen Hell-Dunkel-Zyklus von 12 bis 12 Jahren zu gewöhnen. Die Mäuse sind nachts am aktivsten.

Stellen Sie den Zeitrahmen für den Dunkelzyklus so ein, dass er mit den Arbeitszeiten des Experimentators übereinstimmt. Alle anderen Umgebungsfaktoren wie Temperatur und Belüftung sollten in dieser Zeit konstant bleiben. Zur dauerhaften numerischen Identifizierung tätowieren Sie die Mäuse fünf bis sieben Tage lang mit dem Schwanz, bevor Sie testen.

Fassen Sie die Mäuse regelmäßig bis zu zwei Stunden am Tag an und gewöhnen Sie sie so an die Stressmessung, das Körpergewicht und die Rektaltemperatur und notieren Sie sich ihr allgemeines Erscheinungsbild. Schließen Sie Mäuse aus der Studie aus, die grobe Anomalien wie geringen Nahrungs- oder Wasserverbrauch, Körpergewichtsverlust, eine gebeugte Haltung, einen zerzausten oder fleckigen Fellhydrozephalus oder Porphyrinausfluss um die Augen herum aufweisen. Darüber hinaus können in diesem Zeitraum eine Vielzahl von Verhaltenstests, wie z.B. das freie Feld, durchgeführt werden, die ein umfassenderes Verständnis von Leistungsdefiziten ermöglichen.

Für eine längere Verhaltensstudie sollte der Futterspender über einen vollen Vorrat an Mausfutterpellets verfügen. Jeweils mit einem Gewicht von 20 Milligramm. Eine Flasche sollte immer mit frischem Leitungswasser gefüllt werden.

Bei einem Präferenztest kann eine zweite Flasche eine alternative Lösung von Interesse liefern, z. B. eine, die Zucker enthält. Wiegen Sie die Flaschen, um das zwischen den Sitzungen verbrauchte Volumen zu schätzen. Um die Latenz und Häufigkeit von Trinkattacken zu messen, müssen die Flaschenausläufe an TERs befestigt werden.

Ein Infrarotsensor erkennt das Lecken, stellen Sie also sicher, dass der Sensor nicht durch die Auslaufdüse blockiert wird. Wenn ja, ändern Sie die Länge des Auslaufs, damit er in den Käfig passt. Ein Unterstand sollte in einer Ecke weit vom Laufrad entfernt aufgestellt werden.

Für die Videoverfolgung ist es notwendig, dass der Raum mit einem schwachen, diffusen Licht beleuchtet wird, das nicht vom Boden oder den Wänden reflektiert wird. Ist die Beleuchtung richtig eingestellt, kann die Prüfarena für die Prüfsoftware digitalisiert werden. Für diese Demonstration wird das Softwarepaket ETH Ovision XT 8.5 für den Aufbau der Arena verwendet.

Öffnen Sie zunächst ein Standard-Tracking-Projekt und geben Sie die experimentellen Einstellungen ein. Dann wähle die Videoquelle, in diesem Fall den piccolo diligent grabber. Legen Sie die Anzahl der Tracking-Arenen auf vier fest.

Wählen Sie Center Nose und Tail als Tracking-Punkte aus, und wählen Sie die Maßeinheiten Next aus der Testliste aus. Legen Sie im Setup-Menü die Anzahl der Testversionen fest, indem Sie auf die Schaltfläche Testversionen hinzufügen klicken. Schalten Sie dann die Option Variable hinzufügen um, um unabhängige Variablen wie Maus-ID, Geschlechtsgruppe, Zuweisung und Stamm anzugeben.

Nehmen Sie nun ein Hintergrundbild der Arena auf, indem Sie auf die Registerkarte Arena-Einstellungen klicken und den Umfang der Arena mit den verfügbaren Zeichenwerkzeugen definieren. Nachdem die Arena definiert wurde, verwenden Sie die Option Zone hinzufügen, um interessante Zonen wie den Boden, die TERs, den Essensspender usw. zu umreißen. Fügen Sie dann Zonen hinzu, in denen die Maus nicht sichtbar ist, indem Sie die Option "Versteckte Zonengruppe hinzufügen" verwenden. Dazu gehören der Unterstand und das Laufrad.

Jede versteckte Zone sollte auch über einen bestimmten Einstiegspunkt verfügen. Nachdem Sie den Umfang und die Zonen jeder Arena definiert haben, führen Sie Kalibrierungstests mit der Kalibrierungsoption in der Software durch. Verwenden Sie das Werkzeug für den Skalenzugriff, um die Breite und Länge der einzelnen Arenen zu bestimmen.

Validiere dann die Einstellungen jeder Arena mit der Schaltfläche "Validieren" und fahre mit dem Einrichten der Testparameter und dem Sammeln von Daten fort. Um die Datenerfassung zu erfassen, müssen zuerst die Parameter im Programm eingestellt werden. Greifen Sie zunächst auf die Registerkarte "Einstellungen für die Teststeuerung" zu und geben Sie die Zeitrahmen für die Testversion an.

Die Startbedingung, die beginnen soll, wenn die Dauer des Mittelpunkts in der Arena eine Sekunde überschreitet, die Dauer des Versuchs wird durch Erweitern des Stoppbedingungsfelds festgelegt und der Versuch so eingestellt, dass er nach einer voreingestellten Verzögerung wie 10 Stunden beendet wird. Wählen Sie nun eine Option aus der Erkennungsmethode auf der Registerkarte "Erkennungseinstellungen" aus. Nehmen Sie als Nächstes das Referenzbild der leeren Arena auf, indem Sie die Einstellungstaste verwenden und Strom abrufen auswählen, während Sie sich noch im Erkennungsmodul befinden, und passen Sie den Kontrastbereich für die Erkennungspunkte der mittleren Nase und des Hecks an. Legen Sie den Bereich auf kontinuierlich fest.

Geben Sie dann an, dass die Maus heller oder dunkler als der Hintergrund ist. Passen Sie nun die Einstellung für die Motivgröße an, die auf dem Sichtfeld der Kamera basiert. Passen Sie dann bei Bedarf die Frames pro Sekunde der Analyse basierend auf den Möglichkeiten des Computers an.

Verarbeitung von 14,9 Frames. Die zweite ist in der Regel ausreichend. Wenn alle Änderungen an den Optionen des Erkennungsmoduls vorgenommen wurden, stellen Sie sicher, dass Sie sie speichern, bevor Sie mit dem Messen der Latenz, Häufigkeit und Dauer von Verhaltenshandlungen fortfahren.

Eine speziell entwickelte Routine in MED PC four dient der schrittweisen Eingabe der Sitzungsparameter wie Maus-ID, Testdauer, Laufradkämpfe usw. Wenn alle diese Parameter eingegeben wurden und alle Testgeräte eingeschaltet sind, fahren Sie fort, indem Sie die Maus in die Arena halten. Synchronisieren Sie dann die Video- und Ereignisverfolgungspakete, indem Sie gleichzeitig die Aufnahmetasten drücken, und verlassen Sie den Raum später, wenn der Aufnahmezeitraum abgelaufen ist, bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück, messen Sie die Flaschengewichte und speichern Sie alle aufgezeichneten Daten auf digitalen Medien.

Die Rohdaten können zur Analyse in eine Tabelle ausgegeben werden, und die Rohvideodateien können auf seltene Verhaltensweisen wie Stereotypisierung oder Anfälle überprüft werden. Eine längere Studie mit Zöliakie-1-Mäusen unter Verwendung der besten wurde mehrere Tage vor der Operation durchgeführt. Es wurden Ausgangsdaten erhoben, gefolgt von postoperativen Daten, die eine anhaltende intrazerebroventrikuläre Verabreichung von hirnreaktiven Antikörpern umfassen.

Ab dem fünften Tag zeigten die Versuchsgruppen verschiedene Beeinträchtigungen, darunter ein vermindertes Lecken von Wasserflaschen. Sie zeigten auch eine erhöhte Latenz bei der Annäherung an Flaschen mit Sucralose-Lösung und einen verringerten Lebensmittelkonsum. Zeitgleich mit diesen Veränderungen zeigten die Mäuse, denen hirnreaktive Antikörper verabreicht wurden, auch eine verminderte Laufradaktivität im Vergleich zu Kontrollmäusen, die mit der Video-Tracking-Software gemessen wurden.

In der Versuchsgruppe zogen es die behandelten Mäuse vor, Zeit in den Tierheimen zu verbringen. Anhand dieser Daten wurde ein einfaches Rogramm erstellt, um diese Verhaltensunterschiede zu veranschaulichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein maßgeschneidertes Überwachungsgerät für eine unvoreingenommene Verhaltensanalyse einrichten.

In einer häuslichen Umgebung bietet die automatisierte Phänotypisierung von Heimkäfigen eine Fülle von Informationen, die eine genauere Beurteilung der Kinetik des Beginns und der Schwere von krankheitsinduzierten Verhaltensdefiziten im Zusammenhang mit spontanem, bewegungsmotiviertem Verhalten und emotionaler Reaktivität ermöglichen, indem Probleme im Zusammenhang mit inkonsistenten Umgebungseinstellungen, Transport, Stress und wiederholter Handhabung von Geräten wie Inves die Konsistenz und Präzision der Verhaltensergebnisse erheblich verbessern können in separaten Studien.