Name: Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte In-situ- Hybridisierung Protokoll Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Lernen Sie die vereinfachte Ganzmount-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung der Genexpression in Xenopus laevis Embryonen. Diese effiziente Methode ermöglicht präzise Lokalisierung mit weniger Reagenzien.

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Die Autoren möchten dem CIHR für die Unterstützung des Stipendiums von Steve Deimling und der Abteilung für Pädiatrie der University of Western Ontario für die Unterstützung von Steve Deimling, Rami Halabi und Stephanie Grover danken. Diese Arbeit wurde durch den NSERC Grant R2654A11 und ein NSERC Discovery Accelerator Supplement unterstützt

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<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Die Fähigkeit, in situ Hybridisierung verwendet werden, um die Expressionsmuster von spezifischen Genen sichtbar bleibt das am häufigsten verwendete Verfahren zur spezifischen Organen oder Zelltypen in Xenopus Embryo identifizieren. Dies ist wegen der verschiedenen Vorteile, die diese Technik bietet. Die Expression eines Gens spezifischen Strukturen und vor jedem histologischen Zeichen der Differenzierung zu identifizieren, wie die Hülle für Nkx2.5-Expression in den Herz Progenitoren vor einer...

Das Expressionsmuster eines bestimmten Gens ist eine wichtige Information bei der Bestimmung der potenziellen Rolle dieses Gens bei der Entwicklung eines bestimmten Organs oder Zelltyps. Einfach ausgedrückt: Wenn sie nicht zur richtigen Zeit und am richtigen Ort geäußert wird, ist es unwahrscheinlich, dass sie eine Schlüsselrolle spielt. Bei Xenopus, wie bei den meisten frühen Embryonen, ist der am häufigsten verwendete Assay zum Nachweis der Expression eines Gens die In-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden. Die Verwendung von Antikörperfärbung zur Beurteilung der Expression eines Gens in Xenopus wird immer häufiger, da Forscher Antikörper entdecken, die normalerweise gegen Säugetierproteine gebildet werden, die mit dem Xenopus-Homolog kreuzreagieren oder ihre eigenen 1-3 erzeugen. Die überwiegende Mehrheit der Studien zur Xenopus-Organogenese verwendet jedoch immer noch Antisense-RNA-Sonden. Bei der Verwendung von Antikörpern muss jeder einzelne Antikörper häufig für die Primärantikörperkonzentration oder die Fixierungsprotokolle optimiert werden. Im Gegensatz dazu ist das Protokoll für in situ Hybridisierungen für verschiedene Sonden im Wesentlichen invariant. Das Grundkonzept ist relativ einfach und ein hervorragendes Standardprotokoll hat sich gut etabliert 4. Unser Protokoll ist eine abgespeckte Version des ursprünglichen Protokolls 4, das immer noch einen hervorragenden Nachweis von Genexpressionsmustern im frühen Embryo bietet. Die Embryonen werden fixiert und dann für die Hybridisierung vorbereitet, indem Lösungen und Temperaturen so geändert werden, dass eine hohe Stringenz der markierten Antisense-RNA-Sonde an ihre Ziel-mRNA möglich ist. Die ungebundene Sonde wird weggewaschen und die Embryonen werden dann für die Bindung eines Antikörpers an die Markierung auf den RNA-Sonden vorbereitet. Überschüssiger Antikörper wird dann weggespült und eine enzymatische Farbreaktion wird verwendet, um zu lokalisieren, wo die RNA-Sonde im Embryo gebunden ist. Inzwischen gibt es eine Reihe von transgenen Xenopus-Linien, die die Expression fluoreszierender Proteine in bestimmten Geweben steuern, und diese sind in den Xenopus-Lagerzentren wie der National Xenopus Resource in Woods Hole erhältlich. Diese Option ist zwar sehr nützlich für viele Experimente, bei denen die Organogenese in lebenden Embryonen untersucht werden muss, erfordert jedoch eine separate Unterbringung der transgenen Linien. 
Durch die In-situ-Hybridisierung kann klar abgegrenzt werden, wo sich bestimmte Organe oder Zelltypen im frühen Embryo bilden werden (Abbildung 1). Die Technik ist bemerkenswert empfindlich, da man die Genexpression in einer kleinen Anzahl von Zellen in einem einzigen Embryo nachweisen kann 5. Eine in situ Hybridisierung mit der Intensität der kolorimetrischen Färbung wird jedoch nicht als quantifizierbar angesehen, da die Farbreaktion nicht linear ist. Trotz der Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Färbeintensität sind die Veränderungen in der Expression oft recht auffällig; insbesondere dann, wenn die in situ Hybridisierung quantifizierbare Zu- oder Abnahmen in der Größe der Expressionsdomänen zeigt 6,7. 
Die klaren Vorteile der In-situ-Hybridisierung machen sie zu einem kritischen Assay für die Untersuchung der frühen Entwicklung. Es ist jedoch ein zeitaufwändiger Vorgang, der viele Schritte über mehrere Tage hinweg erfordert. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Version des Standardprotokolls, die mehrere Schritte eliminiert, ohne die Qualität des In-situ-Ergebnisses zu beeinträchtigen. Durch die Vereinfachung werden auch Variabilitätsquellen eliminiert, was die Fehlersuche erleichtert, wenn eine in situ Hybridisierung nicht optimal ist. Insbesondere haben wir die Verwendung von Proteinase-K- und RNAse-Behandlungen des Embryos eliminiert, zwei Schritte, die von der Qualität der Reagenzien abhängen können und auch die Signalintensität verringern können, wenn sie übertrieben werden. Das Protokoll bietet auch ein gewisses Maß an Kosteneinsparung, da nicht mehr mehrere Reagenzien verwendet werden müssen. Schließlich bietet dieses Protokoll auch einige einfache Richtlinien für eine verbesserte Erfassung von Bildern von in situ Hybridisierungsergebnissen. Obwohl dieses Protokoll für die Arbeit an Xenopus-Embryonen optimiert ist, ist es wahrscheinlich, dass zumindest einige der Vereinfachungen auf die In-situ-Hybridisierungsarbeit in anderen Embryosystemen anwendbar sein werden.

<table><tbody><tr><td>Labguake Röhrchenschüttler</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>VWR Fläschchen</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>Ribonukleosid-Triphosphat-Set, 100 mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Inhibator (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase</td><td>Fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase</td><td>Fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>Fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen &</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>Schaf Serum</td><td>&nbsp; Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM violett Ap Substrat</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ap Feb Fragmente</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mops</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td> CAMX0100-3-Trinatriumcitrat <td></td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30% ige Lösung)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Benzylalkohol</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzylbenzoat</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table> kg

das verständnis frühen organogenese das vereinfachte<em&gt; in-situ-</em&gt; hybridisierung protokoll<em&gt; xenopus</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenese ist die Untersuchung, wie Organe spezifiziert werden und dann während der Entwicklung ihre spezifische Form und Funktion erhalten. Der Xenopuslaevis-Embryo ist sehr nützlich für die Untersuchung der Organogenese, da er aufgrund seiner Größe sehr gut für die Identifizierung von Organen in den frühesten Schritten der Organogenese geeignet ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die primäre Methode, die zur Identifizierung eines spezifischen Organs oder Primordiums verwendet wird, die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden, die spezifisch für ein Gen sind, das in dem interessierenden Organ exprimiert wird. Darüber hinaus ist es relativ einfach, Gene oder Signalwege in Xenopus zu manipulieren, und die In-situ-Hybridisierung ermöglicht es dann, auf Veränderungen im Vorhandensein oder in der Morphologie eines Zielorgans zu testen. Die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount ist ein mehrtägiges Protokoll mit vielen Schritten. Hier bieten wir ein vereinfachtes Protokoll mit reduzierter Anzahl von Schritten und verwendeten Reagenzien, das sich gut für Routine-Assays eignet. In-situ-Hybridisierungsroboter haben den Prozess erheblich vereinfacht, und wir beschreiben, wie und wann wir diese Technologie in diesem Prozess einsetzen. Sobald eine In-situ-Hybridisierung abgeschlossen ist, kann es frustrierend sein, das beste Bild des Ergebnisses aufzunehmen. Wir beraten Sie, wie die Bildgebung von In-situ-Hybridisierungsergebnissen optimiert werden kann. Obwohl das Protokoll die Beurteilung der Organogenese bei Xenopus laevis beschreibt, kann das gleiche Basisprotokoll mit ziemlicher Sicherheit auf Xenopus tropicalis und andere Modellsysteme übertragen werden.

Die Verwendung von gewebespezifischen Sonden können hervorragende Informationen in Bezug auf den Stand der Entwicklung für spezifische Organe bereitzustellen. In den folgenden Beispielen wird die Stufe des Embryos auf der Nieuwkoop und Faber Staging-Tabelle 11 basieren. Wenn man Sonden Form Gene nach der Differenzierung zum Ausdruck, Troponin I in der ersten Stufe 28 bis 30, zum Beispiel (1C), die Anwesenheit oder die Größe eines differenzierten Organs verwendet, kann zu jedem Zeitpu...

Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung. Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, aufzuzeigen, wo ein bestimmtes Gen in einem intakten Embryo exprimiert wird. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt die RNA fixiert wird, um sie innerhalb des Embryos ortsfest zu halten. Eine antigene RNA-Sonde, spezifisch für das Gen von Interesse, wird an die Ziel-RNA innerhalb des Embryos hybridisiert.Diese Sonde enthält ein Epitop, gewöhnlich Digoxygenin, das anschließend nachgewiesen werden kann. Danach wird ein an alkalische Phosphatase gekoppeltes Antikörpermolekül an das Epitop auf der RNA-Sonde hybridisiert, gefolgt von der Verwendung einer farbgebenden Färbung. Um die Lokalisation der RNA innerhalb des Embryos sichtbar zu machen, werden Ergebnisse erhalten, die genau anzeigen, wo das Gen von Interesse aufgrund der Farbreaktion und der Kenntnis der Embryonalanatomie exprimiert wird.Der Hauptvorteil unseres Institutsprotokolls gegenüber bestehenden Protokollen liegt in der höheren Geschwindigkeit und der geringeren Verwendung von Reagenzien, ohne dass dies zu einem erkennbaren Qualitätsverlust führt. Diese Methode kann zentrale Fragen in der Embryologie beantworten, beispielsweise, wie Gewebe spezifizi

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

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Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

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