Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, aufzuzeigen, wo ein bestimmtes Gen in einem intakten Embryo exprimiert wird. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt die RNA fixiert wird, um sie innerhalb des Embryos ortsfest zu halten. Eine antigene RNA-Sonde, spezifisch für das Gen von Interesse, wird an die Ziel-RNA innerhalb des Embryos hybridisiert.

Diese Sonde enthält ein Epitop, gewöhnlich Digoxygenin, das anschließend nachgewiesen werden kann. Danach wird ein an alkalische Phosphatase gekoppeltes Antikörpermolekül an das Epitop auf der RNA-Sonde hybridisiert, gefolgt von der Verwendung einer farbgebenden Färbung. Um die Lokalisation der RNA innerhalb des Embryos sichtbar zu machen, werden Ergebnisse erhalten, die genau anzeigen, wo das Gen von Interesse aufgrund der Farbreaktion und der Kenntnis der Embryonalanatomie exprimiert wird.

Der Hauptvorteil unseres Institutsprotokolls gegenüber bestehenden Protokollen liegt in der höheren Geschwindigkeit und der geringeren Verwendung von Reagenzien, ohne dass dies zu einem erkennbaren Qualitätsverlust führt. Diese Methode kann zentrale Fragen in der Embryologie beantworten, beispielsweise, wie Gewebe spezifiziert und mustergemäß angeordnet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung von Opus ermöglicht, kann sie ebenfalls für viele andere kleine Embryonen verwendet werden, wie beispielsweise Zebrafisch- und frühe Mausembryonen.

Wir begannen zunächst mit der Entwicklung dieser Methoden, weil die ursprünglichen Methoden sehr zeitaufwändig waren, und experimentierten damit, Ed-Schritte wegzulassen, um die Effizienz des Verfahrens zu steigern, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Die Embryofixierung erfolgt in mehreren Stufen. Bereiten Sie zunächst die Glasfläschchen vor, die für alle Schritte verwendet werden, einschließlich der endgültigen Lagerung der Embryonen, um eine Überwachung der Embryonen während sämtlicher Arbeitsschritte zu ermöglichen.

Verwenden Sie klare Gefäße mit guter Teflon-Dichtung im Deckel und beschriften Sie diese mit einem Permanentstift mit den entsprechenden experimentellen Angaben. Decken Sie die Beschriftung mit durchsichtigem Klebeband ab, um den Verlust der Kennzeichnung im Verlauf des Verfahrens zu verhindern. Aufgrund der Verwendung von Alkoholen und anderen Lösungsmitteln muss die MFA-Fixierungslösung wie im Protokolltext beschrieben hergestellt werden.

Füllen Sie jedes beschriftete Glasfläschchen mit drei bis vier Milliliter der MFA-Lösung. Lagern Sie eine Lösung aus 100 % Methanol bei minus 20 Grad Celsius. Stellen Sie eine geschnittene Glaspipette her und verwenden Sie sie, um Embryonen in die Glasfläschchen mit Memphis-Lösung zur Fixierung zu überführen.

Fügen Sie die Embryonen mit einem Minimum an übertragender Flüssigkeit aus dem Embryonenmedium hinzu. Fixieren Sie nicht mehr als 20 bis 30 Embryonen pro Röhrchen. Lassen Sie die Embryonen zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Mutaschüttler in Memphis-Lösung.

Nach Beendigung der Paraformaldehyd-Fixierung ersetzen Sie die Memphis-Lösung durch etwa vier Milliliter Methanol bei minus 20 Grad Celsius, um die Embryonen vorzubereiten, bevor die Proben-Synthese-Reaktion angesetzt wird. Lassen Sie die DNA-Wasser-NTP-Mischung und den Polymerase-Puffer auf Raumtemperatur erwärmen. Einer der kritischsten Schritte für den Erfolg dieses Verfahrens ist das korrekte Ansetzen der Proben-Reaktion.

Stellen Sie die Proben-Synthese-Reaktion bei Raumtemperatur zusammen. Geben Sie die folgenden Komponenten in dieser Reihenfolge in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen: Matrizen-DNA, Wasser in einem Volumen, das das Gesamtvolumen der Reaktion auf 20 Mikroliter anpasst, NTP-Mix, RNA-Inhibitor, RNA-Polymerase-Puffer und RNA-Polymerase. Inkubieren Sie die Transkriptionsreaktion zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Inkubationen, die etwas länger als zwei Stunden dauern, haben keine nachteiligen Auswirkungen, zeigen aber auch kaum eine erhöhte Ausbeute. Wenn eine Stunde inkubiert wird, ist die Ausbeute reduziert, jedoch immer noch ausreichend, um eine gute Sonde herzustellen. Sobald die Transkriptionsreaktion abgeschlossen ist, entnehmen Sie einen Mikroliter der Reaktionsmischung, um diese auf einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel zu überprüfen, und geben Sie ihn zur verbleibenden Reaktionsmischung hinzu.

Fügen Sie 80 Mikroliter 1 % SDS in TE-Puffer, 10 Mikroliter fünf Molar Ammoniumacetat und 220 Mikroliter kalten Ethanol hinzu. Vortexen Sie die Mischung kräftig und stellen Sie sie auf Eis, bis die Ergebnisse der RNA-Qualitätskontrolle vorliegen. Nach Zugabe von Wasser und Standard-Ladefarbstoff zu dem einen Mikroliter RNA, der vor der Präzipitation entnommen wurde, führen Sie die RNA auf einem 1 % Agarose-TAE-Gel mit AUM-Bromid durch.

Analysieren Sie die mit Atheriumbromid markierte RNA im Gel unter Verwendung eines UV-Licht-Transilluminationssystems, um die Qualität der Sonde zu überprüfen. Es sollte ein einzelnes Band ohne Verschmierung oberhalb oder unterhalb sichtbar sein. Nach der Bestätigung der RNA-Qualität wird die beiseitegestellte RNA, die auf Eis aufbewahrt wurde, durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Drehzahl für 10 bis 15 Minuten ausgefällt.

Entfernen Sie den Überstand mit einer ausgezogenen Glaspipette und lassen Sie die RNA kurz trocknen. Anschließend wird die Sonde in Hybridisierungspuffer für RNA resuspendiert und in einem 15-Milliliter-Schraubverschluss-Polystyrolröhrchen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt. Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie die in Methanol bei minus 20 Grad Celsius gelagerten Embryonen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.

Das gesamte Verfahren wird in Glasgefäßen durchgeführt. Falls verschiedene Embryonen aus einer Gruppe mit unterschiedlichen Sonden untersucht werden sollen, bewahren Sie diese bis kurz vor dem Zugabe der Sonden in einem einzigen Gefäß auf. Um die Variabilität und den Arbeitsaufwand am ersten Tag vorzubereiten, rehydratisieren Sie die Embryonen gemäß der in dieser Tabelle beschriebenen Methanol-Serie. Verwenden Sie hierbei Glaspipetten, um jede Lösung vorsichtig abzusaugen und hinzuzufügen, da die Embryonen bei diesem Schritt leicht beschädigt werden können.

Beim Übertragen der Flüssigkeiten die Innenseite der Verschlüsse prüfen, um sicherzustellen, dass sich keine Embryonen darin verfangen haben. Nach jedem Mediumwechsel die Embryonen vorsichtig schwenken, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seiten oder aneinander haften. Die Embryonen durch Montieren der Fläschchen auf einem Mutator schaukeln und das RNA-Hybridisierungspuffer und die Sonde müssen vor der Verwendung auf 65 Grad Celsius vorgewärmt werden.

Die Embryonen über Nacht in der Sondenlösung bei 65 Grad Celsius unter Schütteln hybridisieren. Die Sondenlösung am folgenden Tag entfernen und in einem 15-Milliliter-Schraubverschluss-Polystyrolrohr aufbewahren, das mit Datum und Anzahl der bisherigen Verwendungen der Sonde gekennzeichnet ist. Die Sondenlösung bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Nachdem die Sonde entfernt wurde, bereiten Sie die Embryonen durch eine Reihe von Waschschritten für die Antikörperfärbung gegen die Sonde vor, wie hier beschrieben, und ändern Sie die Temperatur, indem Sie den Mutator mit den daran befestigten Embryonenröhrchen in Hybridisierungsöfen bewegen, die auf die geeignete Temperatur eingestellt sind. Während die Embryonen in der Blockierungslösung inkubiert werden, stellen Sie das entsprechende Volumen der Blockierungslösung plus Anti-D-dig-Antikörper her, sodass der Antikörper vor seiner Zugabe zu den Embryonen blockiert wird. Inkubieren Sie die Embryonen am folgenden Tag über Nacht in der Antikörperlösung unter Schütteln bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie mit mab, einer Lösung, die Maleinsäure und Natriumchlorid enthält. Führen Sie mindestens 1230 Minuten Waschschritte bei Raumtemperatur unter Schütteln durch. Ersetzen Sie die letzte Waschlösung durch das Substrat für alkalische Phosphatase.

Führen Sie die Anfärbung bei Raumtemperatur unter Schütteln über Nacht am folgenden Tag durch. Beenden Sie die Anfärbung und bereiten Sie die Embryonen zur Aufbewahrung und Bildgebung vor, indem Sie die Flüssigkeiten gemäß dieser Tabelle wechseln. Nach der Rehydratation der Embryonen fixieren Sie die Färbung mit MFA 30 Minuten lang.

Nach dem Fixieren entfernen Sie die MFA und waschen die Embryonen mit 25% Methanol. Falls eine Entfernung des endogenen Pigments erforderlich ist, entfernen Sie das 25% Methanol und geben die Bleichlösung hinzu. Beobachten Sie den Bleichvorgang genau, da er relativ schnell abläuft, und passen Sie den Grad der Bleiche für unterschiedliche Effekte an.

Für die Langzeitlagerung werden die Embryonen nach der Bleichung zur kurzfristigen Lagerung und anschließender Bildgebung durch eine Methanolreihe bis zu 100 % Methanol entwässert. Anschließend werden die Embryonen in PBS überführt. Undurchsichtige Embryonen lassen sich am besten auf einem Hintergrund aus 1 % Aros beobachten und abbilden. Zur Herstellung der Aros-Lösung wird Aros zu Wasser gegeben und unter Rühren zum Sieden gebracht, bis die Substanz vollständig gelöst ist. Nachdem die Aros-Lösung auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, wird sie in eine Petrischale bis zu einer Dicke von etwa zwei Millimetern eingefüllt.

Wenn die Aros-Schale bereit ist, legen Sie die nicht geklärten Embryonen in die Schale und fahren Sie mit der Bildaufnahme fort. Aros erzeugt einen blaugrauen Hintergrund, der sich gut vom Embryo und der blauen Farbe der Anfärbereaktion abhebt. Außerdem hilft es, störende Schatten und Reflexionen zu streuen, die die Aufmerksamkeit vom Embryo ablenken, sodass der Embryo aus alternativen Perspektiven, beispielsweise von der ventralen Seite, abgebildet werden kann.

Verwenden Sie feine Pinzetten, um Einschnitte in die Aros zu schneiden, um den Embryo anzupassen. Platzieren Sie die Embryonen zur Orientierung in diese Kanäle. Gehen Sie vorsichtig beim Umgang mit den Embryonen um, da diese leicht beschädigt werden können.

Verwenden Sie die Lichtquelle mit Glasfaser, um das Embryo aus flachem Winkel zu beleuchten, wodurch Schatten auf dem Embryo entstehen, die dem Bild Tiefe verleihen und die Unterscheidung von Oberflächenstrukturen erleichtern, da eine Ausbleichung Pigmente entfernen kann, die als nützliche Orientierungspunkte dienen. Nutzen Sie die Schattenbildung bei stark ausgeblichenen Embryonen. Durchsichtige Embryonen werden verwendet, um tiefliegende Färbungen im Inneren des Embryos abzubilden, wie beispielsweise im Rückenmark, in der Lunge oder in Bereichen des Gehirns.

In diesem Protokoll werden unterschiedliche Ausbleichgrade verwendet, um die Färbung im Embryo sichtbar zu machen. Ist die Färbung intensiv, ermöglicht eine schwächere Ausbleichung, bei der etwas Pigmentierung erhalten bleibt, eine bessere Bestimmung des Entwicklungsstadiums und Orientierung des Embryos. Ist die Färbung jedoch in einem Bereich mit starker Pigmentierung wie der Niere lokalisiert, führt eine stärkere Ausbleichung zu besseren Ergebnissen.

Die Manipulation der ARO-Basis kann bei der Ausrichtung des Embryos helfen. Wenn beispielsweise ein feiner Kanal in die Aros geschnitten wird, kann ein Embryo im Froschlaich-Stadium, der seitlich liegt, stabil genug von der ventralen Seite aus betrachtet werden, um eine qualitativ hochwertige Aufnahme zu erhalten. Dieser Embryo wurde in eine kleine Vertiefung platziert, die seine Position mit der ventralen Seite nach oben stabilisierte und so eine vollständige Sicht auf das Expressionsmuster des interessierenden Gens ermöglichte.

Interne Organe können sowohl in undurchsichtigen als auch in durchsichtigen Embryonen eines undurchsichtigen Embryos, der für PAX zwei gefärbt wurde, betrachtet werden. Im Stadium 34 sind der Augenstiel sowie das Neuralrohr sichtbar. Allerdings sind die Details nicht scharf. Durch die Durchsichtigmachung des Embryos werden die Grenzen der Expressionsstellen, einschließlich des Augenstieles, schärfer.

Der Grad der Klärung zeigt sich an der Sichtbarkeit beider Augen in diesem Embryo. Ein häufiges Problem bei geklärten Embryonen ist jedoch, dass sich einige Färbungen in den inneren Hohlräumen anreichern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man eine Ganzpräparat-In-situ-Hybridisierung schnell und mit weniger Reagenzien durchführt und hochwertige Bilder aufnimmt.