Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte In-situ- Hybridisierung Protokoll Xenopus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu zeigen, wo ein bestimmtes Gen in einem intakten Embryo exprimiert wird. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt die zu lokalisierende RNA im Embryo fixiert wird. Eine Antisense-RNA-Sonde, die für das interessierende Gen spezifisch ist, wird mit der Ziel-RNA im Embryo hybridisiert.

Diese Sonde enthält ein Epitop, in der Regel Digo-Genin, das dann nachgewiesen werden kann. Als nächstes wird ein Antikörper, der an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, mit dem Epitop auf der RNA-Sonde hybridisiert, gefolgt von der Verwendung einer farbmetrischen Färbung. Um zu visualisieren, wo die RNA innerhalb des Embryos lokalisiert ist, erhält man Ergebnisse, die genau zeigen, wo das interessierende Gen exprimiert wird, basierend auf der Farbreaktion und der Kenntnis der Anatomie des Embryos.

Der Hauptvorteil unseres Institutsprotokolls gegenüber bestehenden Protokollen besteht darin, dass es schneller ist und weniger Reagenzien ohne erkennbaren Qualitätsverlust verwendet. Diese Methode kann wichtige Fragen der Embryologie beantworten, z. B. wie Gewebe spezifiziert und strukturiert werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung von Opus geben kann, kann sie auch für viele andere kleine Embryonen wie Zebrafische und frühe Mausembryonen verwendet werden.

Wir begannen mit der Entwicklung dieser Methoden, weil die ursprünglichen Methoden viel Zeit in Anspruch nahmen, und wir begannen mit dem Belassen von Ed-Schritten zu experimentieren, um die Effizienz des Verfahrens zu erhöhen, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Die Embryofixation wird in Etappen durchgeführt. Bereiten Sie zunächst die Glasfläschchen vor, die für alle Schritte verwendet werden, einschließlich der endgültigen Lagerung der Embryonen, um die Überwachung der Embryonen während aller Schritte des Prozesses zu ermöglichen.

Verwenden Sie durchsichtige Fläschchen mit einer guten Teflondichtung im Deckel und beschriften Sie die Fläschchen mit einem Permanentmarker, mit den entsprechenden experimentellen Informationen. Decken Sie das Etikett mit durchsichtigem Klebeband ab, um einen Verlust der Etikettierung im Laufe des Eingriffs zu verhindern. Aufgrund der Verwendung von Alkoholen und anderen Lösungsmitteln ist die MFA-Fixierlösung wie im Protokolltext beschrieben herzustellen.

Füllen Sie jedes beschriftete Glasfläschchen mit drei bis vier Millilitern der MFA-Lösung. Lagern Sie eine Lösung aus 100%igem Methanol bei minus 20 Grad Celsius. Machen Sie eine geschliffene Glaspipette und verwenden Sie sie, um die Embryonen in die Glasfläschchen mit der Memphis-Lösung zur Fixierung zu übertragen.

Fügen Sie die Embryonen mit einem Minimum an Flüssigkeitstransfer aus dem Embryomedium hinzu. Fixieren Sie nicht mehr als 20 bis 30 Embryonen pro Embryo. Lassen Sie die Embryonen zwei Stunden lang in Memphis-Lösung bei Raumtemperatur auf einem Mutator.

Nach Abschluss der Paraform-Aldehydfixierung wird die Memphis-Lösung durch etwa vier Milliliter mit minus 20 Grad Celsius ersetzt. 100 % Methanol zur Lagerung der Embryonen vor dem Zusammensetzen der Sondensynthesereaktion, lassen Sie die DNA-Wasser-NTP-Mischung und den Polymerase-Puffer auf Raumtemperatur erwärmen. Einer der wichtigsten Schritte für den Erfolg dieses Verfahrens ist der korrekte Zusammenbau der Sondenreaktion

Die Sondensynthesereaktion bei Raumtemperatur zusammenbauen. Geben Sie die folgenden Komponenten in dieser Reihenfolge in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Template-DNA-Wasser, angepasst an ein Volumen, das das Gesamtvolumen der Reaktion auf 20 Mikroliter bringt, NTP-Mix, RNA-Inhibitor, RNA-Polymerase-Puffer und RNA-Polymerase inkubieren die Transkriptionsreaktion zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Inkubationen, die etwas länger als zwei Stunden dauern, haben keine nachteiligen Auswirkungen, zeigen aber auch eine geringe erhöhte Ausbeute, wenn sie eine Stunde lang inkubiert werden, wird die Ausbeute reduziert, obwohl sie immer noch ausreicht, um eine gute Sonde zu machen. Wenn die Transkriptionsreaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie einen Mikroliter des Reaktionsgemisches, um es auf einem 1%aros zu überprüfen. TAE-Gel zum restlichen Reaktionsgemisch hinzufügen.

Fügen Sie 80 Mikroliter 1%SDS in TE-Puffer, 10 Mikroliter fünfmolares Ammoniumacetat und 220 Mikroliter kaltes Ethanol hinzu. Den Mix kräftig aufwirbeln und auf Eis legen, bis die Ergebnisse der RNA-Qualitätskontrolle bekannt sind. Nach Zugabe von Wasser und Standard-Ladefarbstoff zu dem einen Mikroliter RNA, der vor der Fällung entfernt wurde, führen Sie die RNA auf einem 1%aros, TAE-Gel mit AUM-Bromid aus.

Betrachten Sie die mit Atheriumbromid markierte RNA auf dem Gel mit einem UV-Lichttransluminator, um die Qualität der Sonde zu überprüfen. Es sollte ein einzelnes Band ohne Verschmierung darüber oder darunter sichtbar gemacht werden. Sobald die Qualität der RNA überprüft wurde, fällt die verbleibende RNA, die auf Eis gelegt wurde, aus, indem Sie sie in einer Mikrozentrifuge 10 bis 15 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit drehen.

Entfernen Sie den Überstand mit einer herausgezogenen Glaspipette und lassen Sie die RNA kurz trocknen. Anschließend wird die Sonde in RNA-Hybridisierungspuffer resuspendiert und in einem 15-Milliliter-Schraubverschluss-Polystyrolröhrchen bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie die Embryonen, die in minus 20 Grad Celsius Methanol gelagert wurden, und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.

Der gesamte Eingriff wird in den Glasfläschchen durchgeführt. Wenn verschiedene Embryonen aus einer Gruppe mit verschiedenen Sonden untersucht werden, bewahren Sie sie bis kurz vor dem Hinzufügen der Sonden in einem einzigen Fläschchen auf. Um die Variabilität und die Wehen am ersten Tag in Vorbereitung auf die Zugabe der Sonde zu reduzieren, rehydrieren Sie die Embryonen durch eine Methanolserie, wie in dieser Tabelle beschrieben, verwenden Sie Glaspipetten, um jede Lösung zu entfernen und vorsichtig hinzuzufügen, da die Embryonen während dieses Schritts leicht beschädigt werden können.

Überprüfen Sie beim Umfüllen der Flüssigkeiten die Innenseite der Kappen, um sicherzustellen, dass dort keine Embryonen gefangen wurden. Schwenken Sie die Embryonen nach jedem Wechsel vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seiten oder aneinander kleben. Und rocken Sie die Embryonen, indem Sie die Fläschchen vor der Verwendung des RNA-Hybridisierungspuffers auf einen Mutator montieren, und die Sonde muss auf 65 Grad Celsius vorgewarnt werden.

Hybridisieren Sie die Embryonen in der Sondenlösung über Nacht mit Schaukeln bei 65 Grad Celsius am nächsten Tag. Entfernen Sie die Sondenlösung und bewahren Sie sie in einem 15-Milliliter-Schraubverschluss-Styroporröhrchen auf, das mit dem Datum und der Anzahl der Verwendungen der Sonde gekennzeichnet ist. Lagern Sie die Sondenlösung bei minus 20 Grad Celsius.

Sobald die Sonde entfernt ist, bereiten Sie die Embryonen für die Antikörperfärbung gegen die Sonde durch eine Reihe von Wäschen vor, wie hier beschrieben, und ändern Sie die Temperatur nach Bedarf, indem Sie den Mutator mit den direkt angeschlossenen Fläschchen mit Embryonen in Hybridisierungsöfen bewegen, die auf die entsprechende Temperatur eingestellt sind. Während der Zeit, in der die Embryonen in der Blockierungslösung inkubiert werden, das entsprechende Volumen der Blockierungslösung plus Anti-D-Dig-Antikörper auffüllen, so dass der Antikörper vor seiner Zugabe zu den Embryonen blockiert wird. Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in der Antikörperlösung und wiegen Sie sie am nächsten Tag bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie mit Mab, einer Lösung, die Maleinsäure und Natriumchlorid enthält. Waschen Sie mindestens 1230 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln. Ersetzen Sie die letzte Waschlösung durch das alkalische Phosphatasesubstrat.

Führen Sie die Färbereaktion bei Raumtemperatur mit Schaukeln über Nacht am folgenden Tag durch. Stoppen Sie die Färbereaktion und bereiten Sie die Embryonen für die Lagerung und Bildgebung vor, indem Sie die Flüssigkeiten wie in dieser Tabelle beschrieben wechseln. Nachdem Sie die Embryonen rehydriert haben, fixieren Sie den Fleck 30 Minuten lang mit MFA.

Sobald es fixiert ist, entfernen Sie die MFA und waschen Sie die Embryonen mit 25%Methanol. Wenn eine Entfernung von endogenem Pigment erforderlich ist, entfernen Sie das 25%ige Methanol und fügen Sie die Bleichlösung hinzu. Beobachten Sie das Bleichen genau, da es relativ schnell geschieht und der Grad des Bleichens für verschiedene Effekte variiert werden kann.

Für die Langzeitlagerung dehydrieren Sie die Embryonen durch eine Methanolserie auf 100 % Methanol nach dem Bleichen für die Kurzzeitlagerung und die anschließende Bildgebung, übertragen Sie die Embryonen auf PBS Ungeklärte Embryonen werden am besten auf einem 1%aros-Hintergrund betrachtet und abgebildet. Zur Zubereitung der Aros-Lösung Aros in Wasser geben und zum Kochen bringen, bis die Aros in Lösung ist. Nachdem der Aros auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, gießen Sie ihn in eine Petrischale bis zu einer Tiefe von etwa zwei Millimetern.

Wenn die Arous-Schale fertig ist, legen Sie die ungeklärten Embryonen in die Schale und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Der Aros ergibt einen blaugrauen Hintergrund, der einen guten Kontrast zum Embryo und der blauen Farbe der Färbereaktion bildet. Es hilft auch, störende Schatten und Reflexionen zu zerstreuen, die die Aufmerksamkeit vom Embryo ablenken, um den Embryo von einer anderen Seite, wie z. B. von der ventralen Seite, abzubilden.

Schneiden Sie mit einer feinen Pinzette in den Aros, damit er an den Embryo passt. Platzieren Sie die Embryonen zur Orientierung in diesen Kanälen. Seien Sie vorsichtig bei der Manipulation der Embryonen, da sie leicht beschädigt werden können.

Verwenden Sie die faseroptische Lichtquelle, um den Embryo aus einem flachen Winkel zu beleuchten und Schatten auf dem Embryo zu erzeugen, die dem Bild Tiefe verleihen und helfen, Oberflächenstrukturen zu erkennen, da durch das Bleichen Pigmente entfernt werden können, die nützliche Orientierungspunkte bieten. Verwenden Sie Shadowing für stark gebleichte Embryonen. Geklärte Embryonen werden verwendet, um Färbungen abzubilden, die sich tief im Inneren des Embryos befinden, z. B. im Nabelschnur, in der Lunge oder in Regionen des Gehirns.

In diesem Protokoll werden verschiedene Bleichstufen verwendet, um die Färbung im Embryo sichtbar zu machen. Wenn der Fleck stark ist, ermöglicht ein leichteres Bleichen, das eine gewisse Pigmentierung hinterlässt, ein besseres Staging und eine bessere Ausrichtung des Embryos. Befindet sich der Fleck jedoch in einem Bereich mit hoher Pigmentierung, wie z. B. der Niere, führt ein stärkeres Bleichen zu einem besseren Ergebnis.

Die Manipulation der ARO-Basis kann bei der Embryonenorientierung helfen. Wenn man zum Beispiel einen feinen Kanal in den Aros schneidet, kann ein Embryo im Tad-Pol-Stadium, der auf der Seite liegt, von der Bauchseite aus mit genügend Stabilität betrachtet werden, um ein gutes Bild aufzunehmen. Dieser Embryo wurde in ein kleines Loch gesetzt, das seine Position mit der Bauchseite nach oben stabilisierte und eine vollständige Betrachtung des Expressionsmusters des interessierenden Gens ermöglichte.

Innere Organe können sowohl bei ungeklärten Embryonen als auch bei ungeklärten Embryonen in einem ungeklärten, undurchsichtigen Embryo, der für PAX zwei gefärbt wurde, betrachtet werden. Im Stadium 34 können sowohl der optische Stiel als auch das Neuralrohr sichtbar gemacht werden. Durch die Reinigung des Embryos werden die Grenzen der Expressionsstellen, einschließlich des optischen Stiels, schärfer.

Das Ausmaß der Klärung zeigt sich an der Fähigkeit, bei diesem Embryo beide Augen zu sehen. Ein häufiges Problem bei geklärten Embryonen ist jedoch, dass sich einige Verfärbungen in den inneren Hohlräumen ansammeln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine ganze Montierung in situ schnell und mit weniger Reagenzien durchführen und qualitativ hochwertige Bilder aufnehmen können.