Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, östrogenempfindliche Zellen in lebenden Zebrafischlarven automatisch zu erkennen. Dies wird erreicht, indem zunächst fünf erwachsene X-E-R-E-G-F-P-Fische gezüchtet werden, um Östrogen-Reporter-Zebrafischembryonen zu erzeugen. Als nächstes werden die Embryonen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte gelegt.

Dann werden Östrogene in die Platte der Embryonen gegeben. Abschließend wird die Platte mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop mit motorisiertem Tisch auf Fluoreszenz gescannt. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die gewebespezifische Aktivität von Östrogenrezeptoren zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen traditionellen Techniken wie Hochdurchsatz oder High-Content-Screening besteht darin, dass gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischlarven nur mit einem Standard-Epi-Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden kann. Ausgestattet mit einem motorisierten Tisch ist kein spezieller Plattenleser erforderlich. Vorsicht: Chemikalien mit BPA und Östradiol sind gefährlich und können schädliche Auswirkungen auf den menschlichen Fötus haben.

Gehen Sie vorsichtig mit endokrinen Disruptoren um und verwenden Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung. In dieser Demonstration werden Zebrafische den Östrogenen 17 beta Estradiol, Bisphenol A und Genin in verschiedenen Dosen ausgesetzt, beginnend 48 Stunden nach der Befruchtung nach der Zebrafischzucht und dem Sammeln und Gleichsetzen von Eiern. Gemäß dem Text am Tag der Behandlung werden die chemischen Stofflösungen von einem bis 1000 in einem Milliliter E drei B plus PTU-Wirbel kräftig aufgetaut.

Als Fahrzeugsteuerung. Verwenden Sie eine Verdünnung von DMSO von eins bis 1000 in E, drei B und PTU unter Verwendung eines Kunststofftransfers mit großer Bohrung. Pipettieren Sie drei Embryonen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, um drei Wells pro Bedingung vorzubereiten.

Vermeiden Sie es, Embryonen in die äußeren Vertiefungen zu legen, um eine Verdunstung des Mediums während einer längeren Behandlung zu verhindern. Um ein Austrocknen der Embryonen zu vermeiden, entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 200 Mikroliter gut gemischte Behandlungslösung hinzu. Vergewissern Sie sich visuell, dass alle Embryonen in die Lösung eingetaucht sind und nicht an der Seite der Vertiefung kleben.

Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius nach 72 Stunden. Nach der Befruchtung betäuben Sie die Embryonen, indem Sie 10 Mikroliter à vier Milligramm pro Milliliter Trica hinzufügen. Platzieren Sie jeweils die 96-Well-Platte auf einem motorisierten Tisch und verwenden Sie die Zeiss Zen Blue 2011 Software.

Kalibrieren Sie den Tisch, indem Sie die Probenträgeroption und dann Multiwell 96 auswählen. Wählen Sie dann Kalibrieren, bevor Sie den schrittweisen Anweisungen folgen, indem Sie ein 10-fach-Objektiv und die Hellfeld- oder BF-Einstellung verwenden, einen Positivkontrollembryo identifizieren und die Belichtungseinstellungen entsprechend für BF- und GFP-Kanäle einstellen, um sicherzustellen, dass das Fluoreszenzsignal die Kamera nicht übersättigt. Fokussieren Sie sich auf einen einzelnen Embryo und programmieren Sie das Mikroskop so, dass es insgesamt drei Z-Schnitte aufnimmt, die ein Bild 50 Mikrometer über und eines 50 Mikrometer unterhalb der aktuellen Brennebene enthalten.

Als nächstes legen Sie die Softwareparameter fest, um ein gekacheltes Bild mit GFP- und BF-Kanälen zu erfassen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" die Option "Erweitertes Setup", dann "Kachelregionen" und dann "Kacheln" aus. Wählen Sie den Kreis aus.

Wählen Sie bei der Well-Option Träger und Füllfaktor 90 % aus, um mehrere Bilder der ausgewählten Wells aufzunehmen, sodass 90 % der Fläche jedes Wells im Kompositbild sichtbar sind. Wählen Sie unter Optionen den gewünschten Überlappungsgrad aus, z. B. fünf bis 10 %, was eine glatte Naht zwischen den Bildern ermöglicht. Starten Sie dann die Bildgebung, um manuell Bilder mit einem 20-fach-Objektiv aufzunehmen und mit der BF-Einstellung einen Positivkontrollembryo zu identifizieren.

Stellen Sie die BF- und GFP-Einstellungen wie zuvor ein und nehmen Sie Bilder auf. Diese Abbildung zeigt zusammengesetzte Bilder von einzelnen Wells einer 96-Well-Platte. Jedes Bild besteht aus 59 Einzelbildern mit 5 % Bildüberlappung.

Beachten Sie, dass die lebenden Zebrafische zufällig in jeder Vertiefung ausgerichtet sind. Dennoch sind wir in der Lage, die Fluoreszenz im Herzen von der Fluoreszenz in der Leber zu unterscheiden. Hellfeldbilder sind nützlich als Referenz, um die Orientierung von Zebrafischen zu beurteilen und morphologische Anomalien sichtbar zu machen.

Die hier gezeigten Bilder wurden mit einem Objektiv mit 20-fachem Arbeitsabstand für eine detailliertere Analyse aufgenommen und direkt nach dem gerade gezeigten automatisierten Scan aufgenommen, ohne die Platte vom Mikroskoptisch zu entfernen. Mit Hilfe eines 20-fach-Objektivs kann die Fluoreszenz im Herzen genau auf die durch die Pfeile gekennzeichneten Vorhofventrikelklappen und die durch die Pfeilspitze angezeigten Aortenklappen lokalisiert werden. Sobald diese Technik beherrscht wird, können Bilder von 3 96 Wandplatten pro Tag aufgenommen werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit endokrin wirksamen Verbindungen gefährlich sein kann, also treffen Sie immer die richtigen Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen der richtigen persönlichen Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.