Name: Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die halbautomatisierte Bildgebung gewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Detektion östrogenreaktiver Zellen mit einem epifluoreszenzmikroskop.

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Wir danken Susan Farmer und die Mitarbeiter der UAB Zebrafisch-Forschungseinrichtung für Zebrafisch-Pflege. Finanzierung von Start-up-Fonds von der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie zur Verfügung gestellt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Zebrafisch-Zucht-und Ei-Sammlungen <ol><li> Drei Tage vor Beginn der Einwirkung von Chemikalien, montieren Zuchtbecken mit Unterteilungen, getrennte Männer und Frauen. Füllen Sie jeden Tank zur Hälfte mit Wasser Aquakulturanlage. Mit einem Netz, übertragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 Fisch Zuchtbecken, indem zwei Männer und 3 Frauen in jedem Tank durch einen Teiler getrennt. Legen Sie einen Deckel auf jedem Behälter und Etikett mit Datum und Stämme gekreuzt werden. </li><li> Am folgenden Morgen, entfernen Sie alle Hindernisse und Neigungs verblüfft einen flachen Bereich an einem Ende der Zuchtbecken zu schaffen. Lassen Zebrafisch zu paaren, sammeln Embryonen im 10-Minuten-Intervallen, präzise Inszenierung Entwicklungs gewährleisten. Saubere Eier durch Spülen durch ein Teesieb mit E3B Medium und sanft bündig Embryonen in Petrischalen. Zurück erwachsenen Fischen zu dauerhaftenTanks. </li><li> Mit einem Binokular, sortieren, zählen, und entfernen Sie alle unbefruchtet, abnormale oder beschädigte Embryonen. Platz Embryonen in Petrischalen in E3B Medium und Haus bei 28,5 ° C mit einer 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Embryo Dichte Entwicklung beeinflussen. Legen nicht mehr als 100 Embryonen in einer 100 x 35 mm-Schale und nicht mehr als 50 Embryonen in einem 60 x 15 mm-Schale. </li><li> Nach 24 hpf, ersetzen Sie Medien mit E3B, die 200 uM 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU). PTU verhindert Pigmentbildung und hält Zebrafisch-Embryonen und Larven für eine verbesserte Bildqualität transparent. ACHTUNG: konzentriert PTU Lager ist gefährlich; Handschuhe tragen, wenn Sie E3B + PTU Lösung. </li><li> Am 1. Tag nach der Befruchtung (DPF), manuell das Chorion von jedem Embryo mit feinen Pinzette entfernen. Das Chorion nicht erscheint, um das Eindringen der Östrogene beeinflussen, jedoch die Entfernung verbessert die Bildklarheit. Es gibt keine Notwendigkeit, Chorion aus den Medien zu entfernen. HINWEIS: Als Alternative zur manuellen dechorionation, Chargen von Embryonen che werdenmisch dechorionated mit 1 mg / ml Pronase-Behandlung, wie zuvor beschrieben 11. </li></ol> 2. Chemische Behandlung von Embryonen <ol><li> Der Tag vor der Behandlung, die Stammlösungen jeder Chemikalie bei 1000-facher Konzentration in DMSO (oder geeigneten Lösungsmittel). Zum Beispiel, um Embryonen zu 10 uM Bisphenol A (BPA) ausgesetzt werden, bereiten eine 10 mM Stammlösung BPA in 100% DMSO. Dies sichert eine gleichmäßige DMSO-Konzentration in jeder Behandlung und ermöglicht eine ungiftige 1:1000 Verdünnung von DMSO als Vehikelkontrolle dienen. Shop-Stammlösungen bei -20 ° C Für dieses Protokoll, wird Embryonen bis 1 um und 10 um BPA, 18,5 nM und 1,85 &amp;mgr; M Genistein, 367 nM Östradiol (positive Kontrolle) und Vehikel (0,1% DMSO, negative Kontrolle) ausgesetzt. VORSICHT: Chemikalien wie BPA und Östradiol sind gefährlich und können nachteilige Wirkungen auf den menschlichen Fötus. Griff endokrine Disruptoren mit Sorgfalt und verwenden Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung.</li><li> Am Tag der Behandlung, Tauwetter vorbereitet Lager chemische Lösungen. 1:1000 verdünnt durch Pipettieren von 1 ml E3B + PTU in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ul Lager chemische Lösung. Vortex kräftig. DMSO verdünnt 1:1000 in E3B + PTU als Fahrzeugkontrolle. Verwenden Sie 1 mL E3B + PTU in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen als unbehandelte Kontrolle. </li><li> Mit einer großen Bohrung Kunststoff Transferpipette, Transfer-Embryonen aus Petrischalen in jedes Well einer 96-Well-Platte, 3 Embryonen pro Well, 3 Wells pro Zustand. Verdunstung während längerer Behandlung zu verhindern, lassen Embryonen von äußeren Reihen und Spalten der Platte (Zeilen A und E, Spalten 1 und 12). Außenbrunnen mit 300 pl E3B + PTU gefüllt werden. Beschriften Sie die Platte Deckel entsprechend. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus jedem Well mit einem spitzen, dünnen Kunststofftransferpipette. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen zu vermeiden, die Embryonen. </li><li> Geben Sie 200 ul der Behandlungslösung in entsprechende gut. Setzen Sie den Deckel underneath die Platte als Leitfaden für die Zugabe von Behandlungen in die richtigen Brunnen zu gewährleisten. Vortex jedes Rohr vor dem Pipettieren, um die Chemikalie in Lösung zu verteilen. Optisch bestätigen jeder Embryo ist in der Behandlungslösung. Wenn Embryonen sind auf der Seite der gut mit einem sauberen Transferpipette, um sie in den Brunnen mit der Behandlungslösung zu waschen. </li><li> Die Platte wird in den Brutschrank bei 28,5 ° C. Die Embryonen werden für die Fluoreszenz bei 72 hpf analysiert werden. </li></ol> 3. Mated Imaging von Embryonen in 96-Well-Platten <ol><li> Betäuben Embryonen durch Zugabe von 10 ul von 4 mg / ml in jede Vertiefung Tricaine. HINWEIS: Anesthetize Embryonen vor der Bilderzeugung. Bei 24-96 hpf, Zebrafisch zeigen spontane Bewegung und eine Schreckreaktion auf die veränderte Lichtquelle während der Bildaufnahme. Anästhesie Embryonen reduziert Bewegung während der Bildgebung. </li><li> Legen Sie die 96-Well-Platte in der Motortisch und kalibrieren die Bühne. Mit Zeiss Zen Blau-2011-Software automatisch für die Mikroskopieauf und Kontrolle, wählen Sie den Probenträger Option und Multiwell-96. Wählen Sie Kalibrieren. Folgen Sie den schrittweisen Anweisungen auf die Bühne zu kalibrieren. HINWEIS: Nach diesem Schritt deaktivieren Sie das Fliesen-Taste. Wenn die Fliesen-Taste deaktiviert ist, können Kalibrierungseinstellungen verloren gehen und die 96-Well-Platte muss neu kalibriert werden. </li><li> Mit einem 10-fach Objektiv und die Hell (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen entsprechend für BF-und GFP-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. Konzentrieren Sie sich auf einen einzigen Embryo und programmieren das Mikroskop bis 3 Gesamt Z-Profile, ein Bild um 50 oben und 50 um unter der aktuellen Brennebene zu erwerben. HINWEIS: Da die verschiedenen Gewebe besetzen unterschiedliche Brennebenen, wird dadurch sichergestellt, dass für jeden Zebrafisch-Bilder sind mit Herz und Leber im Fokus gefangen genommen. </li><li> Stellen Sie die Software-Parameter, um ein Bild mit Fliesen GFP und BF channe erwerbenls. Unter der Registerkarte Erwerb, wählen Sie Advanced Setup. Wählen Fliesen Regionen, dann Fliesen. Wählen Sie die Option Kreis auch. HINWEIS: Fliesen verwendet wird, um ein zusammengesetztes Bild von jeder Vertiefung zu schaffen. Ein einzelnes Feld-of-view erfasst nur einen kleinen Teil der Vertiefungen. Die Fliesen-Funktion kann automatisch zu erfassen mehrere benachbarte Felder-of-view aus jeder Vertiefung, wodurch ein zusammengesetztes Bild des gesamten gut. Es ist daher möglich, automatisch zu erfassen 96 zusammengesetzte Bilder pro Platte, wobei jede zusammengesetzte Bild enthält mehrere Dutzend Einzelbilder aus einem einzigen gut. </li><li> Wählen Träger und Füllfaktor 90%. Auswählen einen Füllfaktor von 90% werden zu erfassen mehrere Bilder der ausgewählten Vertiefungen, so dass 90% der Fläche von jeder Vertiefung in dem zusammengesetzten Bild sichtbar sein. HINWEIS: Bei der Auswahl der Füllfaktor wird ein Diagramm angezeigt werden, die den abzubildenden Bereich. Wählen Sie einen Prozentsatz, der den Bereich der gut umfassen wirddas ist für den Versuch geeignet. </li><li> Unter Optionen, wählen Sie die gewünschte Menge an Überschneidungen. HINWEIS: Beim Zusammennähen Fliesen für ein einzelnes repräsentatives Bild, eine Überdeckung von 5-10% ermöglicht eine glatte Naht zwischen den Bildern. Allerdings, wenn Stitching ist unnötig, mit einer Überlappung 0% wird Belichtungszeit zu reduzieren. Unter Verwendung von 90% Füllfaktor und 5% überlappen, ein zusammengesetztes Bild von einem einzigen Bohrloch besteht aus 59 Einzelbildern. </li><li> Starten Bildgebung. Das Mikroskop wird automatisch Bilder zu erwerben. </li><li> Manuell inspizieren zusammengesetzte Bilder von jeder Vertiefung zur gewebespezifischen Fluoreszenz (Abb. 1). </li><li> HINWEIS: Es ist am besten, mit der positiven Kontrolle beginnen, um zu bestätigen, dass die chemische Exposition vor Beobachtung experimentelle Behandlung Brunnen gearbeitet. </li></ol> 4. Manuelle Bildaufnahme von Embryonen in 96-Well-Platte HINWEIS: Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie ein 20x Arbeitsabstand Ziel, acerfordern detaillierte Bilder manuell (Bild 2). <ol><li> Mit einem 20x-Objektiv und das Hellfeld (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen für BF und GFP Kanäle richtig, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. </li><li> Identifizieren einzelner Embryonen und die Aufnahmen manuell. HINWEIS: Wenn die Belichtungseinstellungen für die positive Kontrolle Embryo ausgewählt wurde, werden die Einstellungen nicht verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich der Fluoreszenzintensität jedes Bild unter einheitlichen Bedingungen erfasst. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
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<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alterna...

Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren 1, 2 Retinsäure und Östrogene 3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) 4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch 5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoreszenz Zebrafisch verlassen sich oft auf teure Spezialgeräte. High-Content-Screening sogenannte bietet den Vorteil hoher Auflösung, quantitative Bildgebung, aber auf Kosten der Verwendung von spezialisierten Plattenleser für die konfokale Mikroskopie 7,8 ausgestattet. Das Ziel dieser Methode ist es, automatisch Assay gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonenin einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop. Gewebespezifische Fluoreszenz kann mit dieser Technik unterschieden werden und kann ein vernünftiger Ansatz für die Laboratorien, die den Zugang zu spezialisierten Plattenleser oder High-Content-Screening-Geräte fehlt sein. In diesem Protokoll verwenden wir automatisierte Bildgebung von Gewebe-spezifischen Östrogen-Rezeptor (ER)-Agonisten in lebenden Zebrafisch nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) zu erfassen. Die transgene Linie Tg (5xERE: GFP) c262/c262 enthält 5 Tandem Östrogen-Response-Element-DNA-Sequenzen (ERE) stromaufwärts des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 3. In der Abwesenheit von Liganden, ERs sind normalerweise inaktiv. Ligandenbindung löst eine Konformationsänderung, wodurch Rezeptoren binden ERE DNA und regulieren die Transkription 9. 5xERE: GFP Fische verwendet werden, um Substanzbibliotheken für ER-Modulatoren zu screenen und kann verwendet werden, um Umweltwasserproben für östrogene Verunreinigungen zu screenen.

<table><tbody><tr><td>Transferpipetten aus Kunststoff; mit breiter Bohrung</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten aus Kunststoff; feine Spitze</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit rundem Boden</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Platten mit 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Platten mit 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Spitzenmaße 0,05 x 0,01 mm, zur manuellen Entnahme von Chorionen aus Embryonen</td></tr><tr><td>Tricain Methansulfonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>siehe Zebrafisch Buch für Rezept (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>20 mM Vorrat vorbereiten (100x) und bei 200 μm verwenden; M in E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protokoll erfordert ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Tisch</td></tr><tr><td>20x Objektiv mit langem Arbeitsabstand</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Wir verwenden ein Objektiv mit 0,4 NA und 8,4 mm Arbeitsabstand</td></tr><tr><td>Axiocam HRm Digitalkamera</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 Mikroskopsteuerungssoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Das Protokoll erfordert eine Automatisierungs- und Steuerungssoftware für die Mikroskopie, um die Aufnahme von gekachelten Bildern mit einem motorisierten Tisch</td></tr><tr><td>zu ermöglichen Methylene Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 Gramm</td><td>ergeben eine 2%ige Lösung in RO-Wasser zur Verwendung in E3B (unten)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 LÖSUNG: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17,2 Gramm KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,76 Gramm CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2,9 Gramm MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 Gramm oder MgSO4 - 2,39 Gramm In 1 Liter Milli-Q Wasser auflösen; In steriler 1-Liter-Flasche aufbewahren. 1X E3B LÖSUNG FÜR ZEBRAFISCHE: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% Methylenblau&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; Mit Milli-Q Wasser auf 9 Liter bringen &nbsp;</td></tr></tbody></table>

semi-automated imaging von gewebespezifische fluoreszenz-in zebrafischembryonen

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine ​​exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.

Fig. 1 zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Jedes zusammengesetzte Bild wird von 59 Einzelbildern mit 5% Bildüberlappung besteht. Beachten Sie, dass die Live-Zebrafisch sind zufällig in jedem gut orientiert, aber wir sind in der Lage, um die Fluoreszenz im Herzen von der Leber zu unterscheiden. Hell Bilder sind als Verweise auf Zebrafisch-Orientierung zu beurteilen und zu visualisieren, morphologische Veränderungen (1A und 1C). Automated Imaging mit e...

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, östrogenreaktive Zellen in lebenden Zebrafischlarven automatisch nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst fünf X-E-R-E-G-F-P adulte Fische gekreuzt werden, um Östrogen-Reporter-Zebrafischembryonen zu erzeugen. Anschließend werden die Embryonen in einzelne Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gegeben.Dann werden Östrogene zur Platte mit Embryonen hinzugefügt. Abschließend wird die Platte mit einem epifluoreszierenden Mikroskop mit motorisiertem Objekttisch auf Fluoreszenz gescannt. Letztendlich dient die Fluoreszenzmikroskopie dazu, die gewebespezifische Aktivität von Östrogenrezeptoren nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen herkömmlichen Methoden wie Hochdurchsatz- oder Hochinhalts-Screening besteht also darin, dass die gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonen mithilfe eines einfachen epifluoreszenten Mikroskops abgebildet werden kann. Ein motorisierter Probentisch ist ausreichend, sodass kein spezieller Plattenreader erforderlich ist. Vorsicht: Chemikalien wie BPA und Estradiol sind gefährlich und können schädliche Wirkungen auf den menschlichen Fetus haben.Umgang Sie vorsichtig mit endokrinen Disruptoren und tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung. In dieser Demonstration werden Zebrafische verschiedenen Dosen der Östrogene 17-Beta-Estradiol, Bisphenol A und Genistein ausgesetzt, beginnend 48 Stunden nach der Befruchtung, nachdem die Zebrafische gezüchtet, die Eier gesammelt und sortiert wurden. Am Tag der Behandlung verdünnen Sie laut Anweisung die aufgetauten Stammlösungen der Chemikalien im Verhältnis 1 zu 1000 in einem Milliliter E3B plus PTU und wirbeln die Lösung kräftig im Vortex. Als Fahrzeugkontrolle. Verdünnen Sie DMSO im Verhältnis 1 zu 1000 in E3B und PTU unter Verwendung einer Plastikpipette mit großem Durchmesser. Übertragen Sie mit einer Pipette jeweils drei Embryonen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte und bereiten Sie drei Vertiefungen pro Bedingung vor.Vermeiden Sie es, Embryonen in äußeren Vertiefungen zu platzieren, um die Verdunstung des Mediums während einer längeren Behandlung zu verhindern. Entfernen Sie das Medium schnell aus jeder Vertiefung, um ein Austrocknen der Embryonen zu vermeiden, und geben Sie 200 µL gut durchmischte Behandlungslösung hinzu. Überprüfen Sie visuell, ob alle Embryonen vollständig in der Lösung eingetaucht sind und nicht an der Wand der Vertiefung haften. Die Embryonen 72 Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Nach der Befruchtung die Embryonen durch Zugabe von 10 Mikrolitern einer vier Milligramm pro Milliliter Trica enthaltenden Lösung anästhesieren. Danach die 96-Well-Platte auf eine motorisierte Stufe stellen und die Zeiss-Zen-Blue-2011-Software verwenden.Kalibrieren Sie die Bühne, indem Sie die Option für den Probenhalter auswählen und „Mehrfachmulde 96“ wählen. Wählen Sie anschließend „Kalibrieren“ und folgen Sie den schrittweisen Anweisungen. Verwenden Sie ein 10×-Objektiv und die Hellfeld- oder BF-Einstellung, identifizieren Sie einen positiven Kontroll-Embryo und stellen Sie die Belichtungseinstellungen entsprechend für die BF- und GFP-Kanäle ein, wobei sichergestellt werden muss, dass das Fluoreszenzsignal die Kamera nicht übersteuert. Fokussieren Sie auf einen einzelnen Embryo und programmieren Sie das Mikroskop, insgesamt drei Z-Schnitte aufzunehmen, darunter ein Bild 50 Mikrometer oberhalb und ein Bild 50 Mikrometer unterhalb der aktuellen Fokusebene.Danach die Softwareparameter festlegen, um ein Kachelbild unter Verwendung der GFP- und BF-Kanäle aufzunehmen. Unter dem Reiter Aufnahme die erweiterte Konfiguration auswählen, dann Kachelbereiche und anschließend Kacheln. Den Kreis auswählen.Wählen Sie bei den Optionen den gewünschten Brunnen und einen Füllfaktor von 90 %, um mehrere Bilder der ausgewählten Brunnen aufzunehmen, sodass 90 % der Fläche jedes Brunnens im zusammengesetzten Bild sichtbar sein werden. Wählen Sie unter Optionen den gewünschten Überlappungsbereich, beispielsweise fünf bis 10 %, um einen gleichmäßigen Übergang zwischen den Bildern zu ermöglichen. Starten Sie anschließend die Bildaufnahme, um manuell Bilder mit einem 20×-Objektiv und der BF-Einstellung aufzunehmen, und identifizieren Sie einen positiven Kontroll-Embryo.Stellen Sie die BF- und GFP-Einstellungen wie zuvor ein und nehmen Sie Bilder auf. Diese Abbildung zeigt zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Jedes Bild setzt sich aus 59 Einzelbildern mit 5 % Bildüberlappung zusammen.Beachten Sie, dass die lebenden Zebrafische in jedem Brunnen zufällig orientiert sind. Dennoch können wir die Fluoreszenz im Herzen von der Fluoreszenz in der Leber unterscheiden. Hellfeldaufnahmen sind als Referenzen nützlich, um die Orientierung der Zebrafische zu beurteilen und morphologische Abnormalitäten zu visualisieren.Die hier gezeigten Bilder wurden mit einem 20x-Objektiv mit langem Arbeitsabstand für eine detailliertere Analyse aufgenommen und unmittelbar nach dem zuvor gezeigten automatischen Scan aufgenommen, ohne die Platte vom Mikroskoptisch zu entfernen. Mit einem 20x-Objektiv kann die Fluoreszenz im Herzen präzise auf die durch die Pfeile markierten atrioventrikulären Klappen sowie auf die Aortenklappen, wie durch den Pfeilkopf angegeben, lokalisiert werden. Sobald diese Technik beherrscht ist, können pro Tag Bilder von drei 96-Well-Platten erfasst werden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit endokrinen Disruptoren gefährlich sein kann. Tragen Sie daher stets die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen wie beispielsweise die Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Quelle: Zhang, X., et al. Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung von Zebrafischembryonen, die mit Staphylococcus aureus injiziert wurden, was eine Quantifizierung des Infektionsverlaufs und der bakteriellen Verteilung ermöglicht, um den Einfluss von Biomaterial-Mikrosphären auf Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo zu bewerten.

 Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lernen Sie die halbautomatisierte Bildgebung gewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Detektion östrogenreaktiver Zellen mit einem epifluoreszenzmikroskop.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

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