Name: Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Lernen Sie die effiziente Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteinen und deren Komplexen mit BS3-vernetzter Strep-Tactin-Harz. Diese Methode ermöglicht hohe Ausbeuten und Reinheit für Massenspektrometrie-Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken für die technische Unterstützung von Sini Miettinen, Minna Pöllänen und Taru Rautavesi. Wir bedanken uns für die Bereitstellung Helka Nurkkala HEK 293-Zellen, die Twin-Strep-getaggte GFP und Pekka Evijärvi für die Bereitstellung von Aufnahmegerät. Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland finanziert, gewähren Nummern 138329, 134684 und 258978.

1. Vernetzung von Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) <ol><li> Äquilibrieren einer abgedichteten Mikroröhrchen, das 2 mg BS3 Vernetzer auf Raumtemperatur. ACHTUNG: BS3 ist ein gefährlicher Stoff. Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen. </li><li> Resuspendieren Strep-Tactin Polymethacrylatharz (50% Suspension in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) durch kurzes kräftiges Schütteln und sofort übertragen 600 ul der Suspension auf eine Spin-Säule mit einer Pipettenspitze mit der Ende abgeschnitten. </li><li> Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und mit 450 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die Säule. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2 mehrmals, um Tris-Puffer vollständig ersetzen mit PBS und lassen Sie den Harz in 430 ul PBS auf pH 8,0 nach der letzten Zentrifugation angepasst. </li><li> Punktieren Sie die Folie des Mikroröhrchens mit BS3 mit einer Pipettenspitze, die 1001, l Reinstwasser. Lösen Sie das Pulver in Wasser BS3 durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren und sofort 20 ul der Lösung für das Spin-Säule. Die Endkonzentration von BS3 in der Vernetzungsreaktion ist ~ 1,2 mm. </li><li> Drehen der Säule für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie, dass das Harz richtig mit dem BS3-Lösung gemischt. </li><li> Um die Reaktion abzuschrecken, addieren 6 ul 3 M Tris-HCl, pH 7,5, und dreht die Säule weitere 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und Resuspendieren des vernetzten Harzes in 450 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST). Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte zwei weitere Male. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 450 ul TBS. </li><li> Übertragen Sie die Harzsuspension in ein frisches Röhrchen mit einer Pipettenspitze mit dem Ende abgeschnitten. Resuspendieren des Harzes in der Säule mit weiteren 450 &amp;mgr; l TBS links und übertragen auf den gleichen Rohr. Wiederholen the letzten Schritt nochmals eine maximale Übertragung des Harzes aus der Säule, um das Rohr zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie den Schlauch stehen für 10 Minuten bei Raumtemperatur und die Lautstärke auf 600 ul indem überschüssiges TBS. Das Harz ist bereit für den sofortigen Einsatz (empfohlen) oder können bei 4 ° C gelagert werden, ohne zu frieren. </li></ol> 2. Bindung des Twin-Strep-markierten Protein-Köder und assoziierten Komplexe auf die Cross-linked Strep-Tactin Polymethacrylatharz <ol><li> Zentrifuge 1 ml der Probe Köderprotein in Bindungspuffer bei 17.000 × g für 10 min bei 4 ° C und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Zur Minimierung der Bindung von endogenem biotinylierten Proteine ​​an die Strep-Tactin Harz, Zugabe von Avidin zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml und dreht 15 min bei 4 ° C. <ol><li> Wenn das vernetzte Harz aus Schritt 1,10 für einen längeren Zeitraum bei 4 ° C gelagert wurden, sammeln das Harz durch Zentrifugation bei 400 xg for 1 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und das Harz mit 1 ml TBST. Wiederholen der Zentrifugations-und Waschschritte noch zweimal, zuerst mit TBST und dann mit TBS gewaschen. Das Röhrchen bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C und Einstellen auf das ursprüngliche Volumen, indem überschüssiges TBS. </li></ol></li><li> Resuspendieren des vernetzten Strep-Tactin Harz durch Vortexen. Sofort 50 ul der Harzsuspension dem Rohr den Köder-Protein enthaltenden Probe mit einem geschnittenen Pipettenspitze und drehen noch 30 min bei 4 ° C. </li><li> Während der Wartezeit eingestellt Thermomixer auf 55 ° C vorheizen und 500 ul Elutionspuffer zur Verwendung in Schritt 3.1. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C. Verwerfen des Überstandes und Waschen des Harzes auf einem Rotator für 5 min bei 4 ° C mit 1 ml vorgekühltes Waschpuffer # 1. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte dreimal. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 250 ul Waschpuffer # 2. </li><li> Tr<html> ansfer die Harzsuspension in einen frischen Spin-Säule. Resuspendieren des restlichen in dem Rohr in einem anderen 250 ul Waschpuffer # 2 Harz und übertragen auf den gleichen Spalte. </li><li> Zentrifuge bei 400 g für 3 min bei 4 ° C, entsorgen Sie die Durchfluss und übertragen Sie die Spalte zu einem frischen Delphin-Nase-2-ml-Tube. Gehen Sie sofort auf die Elution Schritt unten. </li></ol> 3. Spezifische Elution der Proteinkomplexe <ol><li> Jeweils 150 ul der vorgewärmten Elutionspuffer von Schritt 2.4, um die Spin-Säule. </li><li> Inkubation in Thermomixer für 5 min bei 55 ° C, bei 1.400 Umdrehungen pro Minute zittern. </li><li> Zentrifugieren bei 1500 × g für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die Spalte und speichern die gereinigten Zielproteine ​​bei ≤ -20 ° C </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Na 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 137 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KCl </td><td style="width:299px;"> 2,7 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> pH-Wert auf 7,4 eingestellt, sofern nicht anders angegeben (pH 8.0 in Abschnitt 1.4) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td hei<html> ght = &quot;20&quot; style = &quot;height: 20px; width: 299px;&quot;&gt; NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tween 20 </td><td style="width:299px;"> 0,1% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Bindungspuffer </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td>x; &quot;&gt; 550 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </td><td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glycerol </td><td style="width:299px;"> 10% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Waschpuffer # 1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 500 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </<html> td&gt; <td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,4 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Igepal CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0,2% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glycerol </td><td style="width:299px;"> 5% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Waschpuffer # 2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20">2 &quot;height =&quot; 20 &quot;style =&quot; height: 20px; width: 597px; &quot;&gt; Elutionspuffer </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1% (w / v) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Puffer in der vorliegenden Studie verwendet.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das obige Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-getaggte Köder Protein von Interesse und die damit verbundenen Komplexe in jeder geeigneten Puffer, die nicht Biotin oder starke Vergällungsmittel enthält reinigen. In der aktuellen Version des Protokolls, Bindung und Waschen unter relativ stringenten Bedingungen in der Gegenwart von hohen Salz und nicht-ionischen Detergens durchgeführt. Dies führt zwar zu weniger Hintergrund, kann fragilen Proteinkomplexe unter diesen Bedingungen zu distanzieren. Um solche...

In den letzten Jahren hat Strep-Tag-Technologie in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Proteomforschung und Strukturbiologie weit verbreitet. Diese Technologie zur Proteinreinigung, die auf der Fusion von rekombinanten Proteinen an einer kurzen Strep-tag-Peptid beruht, mit dem Aufkommen von Affinitätsmatrizes Durchführung Strep-Tactin, eine gentechnisch Variante von Streptavidin mit verbesserter Peptid-Bindungsfähigkeit 1, 2 gereift. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag, zeigen eine höhere Affinität für Strep-Tactin Matrizen als solche, die nur eine einzige Strep-Tag, eine effizientere Reinigung der rekombinanten Proteine ​​und bezeichnet enthält ihre zugeordneten Bindungspartnern. Allerdings hat der höhere Affinität von Twin-Strep-markierte Proteine ​​zu Strep-Tactin auch seine Kehrseite. Kompetitive Elution derartiger Proteine ​​mit einem Überschuss Biotin kann unvollständig sein, was zu einer verringerten Ausbeute Zielprotein. A mErz effiziente Alternative ist die Elution mit SDS, aber es führt zu unerwünschten Kontamination der Probe mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt, so dass der Test nicht mit Proteomanalyse. Dieser Artikel stellt eine Technik, um diese Beschränkung durch die ersten Stabilisierungs harzgekuppelten Tetramer von Strep-Tactin durch chemische Vernetzung und dann unter Verwendung von SDS zur Doppel-Strep-markierte Proteine ​​und ihre zugehörigen Komplexe aus der resultierenden vernetzten Harz zu eluieren überwinden. Somit kann eine ausreichende Proteinausbeute ohne Kontamination der Probe mit Strep-Tactin erreicht werden, wodurch eine weitere Analyse durch Massenspektrometrie erlaubt. Das Verfahren ist mit einer oberflächenexponierten SIII-Tag 3 oder Twin-Strep-Tag (Aminosäuresequenz WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK und SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK jeweils) geeignet für die Reinigung von jedem rekombinantes Fusionsprotein. Das Protein kann aus tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein und kann entweder aus insgesamt Zelle isoliert werdenLysat oder angereicherten Organell-Fraktion. Als Beispiel beschreiben wir hier die Reinigung eines SIII-markierten Protein VPg-Pro von Kartoffelvirus A (PVA) 4 von der Kernfraktion von PVA-infizierten Nicotiana benthamiana Pflanzen. Die Kernfraktion wurde isoliert, wie zuvor beschrieben 5, mit den folgenden Modifikationen: die Zellen wurden nicht mit Formaldehyd behandelt wurde Natriumbutyrat in alle Puffer mit 5 mM Natriumfluorid ersetzt wurde komplette Proteaseinhibitor PMSF substituiert mit Triton X-100-Konzentration im Extraktions Puffer # 2 wurde auf 0,3% gesenkt (v / v) und das Kernpellet durch Zentrifugation über Saccharose-Kissen (Extraktionspuffer # 3) erhalten wurde in 1,45 ml vorgekühltem Bindungspuffer resuspendiert und gedreht wird 1,5 Stunden bei 4 ° C. Die daraus resultierende Kernextrakt die SIII-markierten Köderprotein und die damit verbundenen Komplexe (Köder Proteinprobe) enthält, wurde gemäß dem unten beschriebenen (siehe Abschnitt 2)-Protokoll verarbeitet.

<table><tbody><tr><td>Bis(sulfosuccinimidyl)-suberat (BS3), No-Weigh-Format, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585<</td><td>a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com ACHTUNG: Gefährlicher Stoff. Verursacht schwere Reizungen der Atemwege, der Haut und der Augen. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Augenschutz.</a></td></tr><tr><td>Strep-Tactin MacroPrep Harz (50% Suspension)</td><td>IBA</td><td>2-1505<</td><td>a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Spin-X Zentrifugenrohrfilter, Celluloseacetat-Membran, Porengröße 0,45 &mu; m, unsteril</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Delfinnasenschläuche</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213<</td><td>a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204<</td><td>a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

ein-schritt-reinigung von twin-strep-markierten proteine ​​und ihre komplexe auf mit bis (sulfosuccinimidyl) strep-tactin resin vernetzte suberat (bs3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Affinitätsreinigung von Strep-markierten Fusionsproteinen auf Harze Durchführung eines manipulierten Streptavidin (Strep-Tactin) hat sich eine weit verbreitete Methode zur Isolierung von Proteinkomplexen unter physiologischen Bedingungen. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag bezeichnet, enthalten, haben den Vorteil der höheren Affinität für Strep-Tactin Vergleich zu denen nur eine einzige Strep-Tag enthält, so dass eine effizientere Proteinreinigung. Allerdings wird dieser Vorteil durch die Tatsache, dass die Elution von Zwillings-Strep-markierte Proteine ​​mit Biotin kann unvollständig sein, was zu einer geringen Proteinrückgewinnung auszugleichen. Die Rückgewinnung kann durch die Verwendung stark denaturierender Elution mit Natriumdodecylsulfat (SDS) verbessert werden, aber dies führt zu einer Kontamination mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt abzutasten, so dass der Test nicht mit nachgeschalteten Proteomanalyse. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Verfahren, bei dem mit Harz gekoppelt Tetramer von Strep-Tactin entwickeltenZunächst wird durch kovalente Quervernetzung mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) und die resultierende vernetzte Harz wird dann verwendet, um Zielprotein-Komplexe in einer einzigen Charge zu reinigen Reinigungsschritt stabilisiert. Effiziente Elution mit SDS-Protein sorgt für eine gute Erholung, während der Abwesenheit von kontaminierenden Strep-Tactin ermöglicht Downstream-Protein-Analyse durch Massenspektrometrie. Als Proof of Concept, beschreiben wir hier ein Protokoll für die Reinigung von SIII-markierten viralen Protein VPg-Pro aus Kernen von Virus-infizierten N. benthamiana-Pflanzen mit dem Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit BS3 vernetzt. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-markierten Protein von Interesse reinigen und zu charakterisieren seine physiologischen Bindungspartner werden.

Das Reinigungsverfahren ist schematisch in Fig. 1 dargestellt, zusammen mit einer Darstellung von Problemen mit bestehenden Reinigungsverfahren verbunden sind. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> 1. Schematische Darstellung des Reinigungsverfahrens. Der Workflow umfasst die Stabilisierung des harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramer über kovalent...

Es wird ein Verfahren zur effizienten Reinigung von Doppel Strep-tag-Fusionsproteine ​​und deren Komplexe spezifisch auf modifizierte Streptavidin beschrieben (Strep-Tactin)-Harz kovalent mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) vernetzt. Das Verfahren hat die Vorteile der schnellen Geschwindigkeit, gute Zielprotein Recovery und hohe Reinheit und ist mit nachfolgender Analyse durch Massenspektrometrie kompatibel.

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Hallo, ich bin Christina McKennan von der Universität Helsinki, Finnland. Eine der Herausforderungen bei der Charakterisierung eines bestimmten Protein-Komplexes besteht darin, seine molekulare Zusammensetzung zu bestimmen. Dazu ist die Entwicklung von Methoden erforderlich, um den Komplex aus seiner zellulären Umgebung zu isolieren und zu reinigen.Der Forschungsbereich im Bereich Mikrobe ist die Interaktion zwischen Pflanzenviren und ihren Wirtszellen, weshalb wir an den verschiedenen viralen Ribonukleoprotein-Komplexen interessiert sind, die während einer Infektion gebildet werden. In der Vergangenheit haben wir diese Komplexe erfolgreich mittels Affinitätsreinigung basierend auf Duct-Systemen in unserem Labor untersucht. Der Twin-Strep-Duct erwies sich als einer der besten Ducts.Wir haben jedoch bestimmte Einschränkungen bei der Anwendung beobachtet, darunter eine geringe Ausbeute, weshalb wir dieses Verfahren verbessern wollten. Hallo, mein Name ist Mata und ich werde Sie durch den experimentellen Protokollablauf führen. Zunächst möchte ich Ihnen jedoch einen Überblick über die Methode geben.Wir verwenden Strep-Tactin-Macro-Prep-Beads zur Reinigung spezifischer Komplexe zwische

one-step-purification-twin-strep-tagged-proteins-their-complexes-on

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Quelle: Murata, T., et al. Aufreinigung eines Proteins mit hoher molekularer Masse in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins, das von Streptococcus mutans sezerniert wird.

Ein Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins aus Streptococcus mutans

Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die...

Tandem-Affinitätsreinigungsassay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Die Methode der Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) wurde ausgiebig verwendet, um native Komplexe aus zellulärem Extrakt, hauptsächlich eukaryotisch, für die Proteomik zu isolieren. Hier stellen wir ein TAP-Methodenprotokoll vor, das für die Aufreinigung von nativen Komplexen für Strukturstudien optimiert ist.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

Beschrieben hier ist eine einfache Methode zur Reinigung eines Genprodukts in Streptococcus mutans. Diese Technik kann bei der Reinigung von Proteinen, insbesondere Membranproteinen und Proteinen mit hoher Molekularmasse, von Vorteil sein und kann mit verschiedenen anderen Bakterienarten verwendet werden.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettproteinen ist ein wichtiges Werkzeug, um die grundlegenden funktionellen Eigenschaften dieser Proteine zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Reinigung und Bewertung der Qualität von rekombinanten Septinkomplexen, die eine zentrale Rolle bei der Zellteilung und -migration spielen.

Reinigung und Qualitätskontrolle von rekombinanten Septinkomplexen zur zellfreien Rekonstitution

Lernen Sie die effiziente Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteinen und deren Komplexen mit BS3-vernetzter Strep-Tactin-Harz. Diese Methode ermöglicht hohe Ausbeuten und Reinheit für Massenspektrometrie-Analysen.

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3) (Video) | JoVE Journal

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Weitere Videos entdecken

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)