Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Hallo, ich bin Christina McKennan von der Universität Helsinki, Finnland. Eine der Herausforderungen bei der Charakterisierung eines bestimmten Protein-Komplexes besteht darin, seine molekulare Zusammensetzung zu bestimmen. Dazu ist die Entwicklung von Methoden erforderlich, um den Komplex aus seiner zellulären Umgebung zu isolieren und zu reinigen.

Der Forschungsbereich im Bereich Mikrobe ist die Interaktion zwischen Pflanzenviren und ihren Wirtszellen, weshalb wir an den verschiedenen viralen Ribonukleoprotein-Komplexen interessiert sind, die während einer Infektion gebildet werden. In der Vergangenheit haben wir diese Komplexe erfolgreich mittels Affinitätsreinigung basierend auf Duct-Systemen in unserem Labor untersucht. Der Twin-Strep-Duct erwies sich als einer der besten Ducts.

Wir haben jedoch bestimmte Einschränkungen bei der Anwendung beobachtet, darunter eine geringe Ausbeute, weshalb wir dieses Verfahren verbessern wollten. Hallo, mein Name ist Mata und ich werde Sie durch den experimentellen Protokollablauf führen. Zunächst möchte ich Ihnen jedoch einen Überblick über die Methode geben.

Wir verwenden Strep-Tactin-Macro-Prep-Beads zur Reinigung spezifischer Komplexe zwischen doppelt Strep-getaggten Proteinen und ihren physiologischen Bindungspartnern. Der Strep-Tactin-Tetramer ist in grün dargestellt, das doppelt Strep-getaggte Protein in blau, sein Bindungspartner in orange und zwei Kopien des Strep-Tags in rot.

Die als anmutige Furcht dargestellten ungebundenen Proteine werden durch Waschen im kanonischen Ansatz entfernt. Die gebundenen Komplexe werden kompetitiv mit Biotin, dargestellt in Rosa, nachgewiesen. Bei Verwendung dieses Ansatzes beobachteten wir jedoch eine unvollständige Elution der gebundenen Komplexe, wobei nur ein Bruchteil erfolgreich von den Streptavidin-Perlen abgelöst wurde.

Dies führt zu einer geringen Ausbeute an Zielprotein. Die Proteinrückgewinnung kann durch den Einsatz einer denaturierenden Elution mit S-D-S-S-D-S verbessert werden, was die weitere Analyse erschwert. Um das denaturierte Twin-Strep-Ttag-Bait-Protein herum bilden sich Miss-Zellen.

Sein Bindungspartner und die dissoziierten Monomere von Strept-Aktin. Die resultierende Probenkontamination mit freigesetztem Strept-Aktin ist inakzeptabel, wenn die Probe anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert werden muss. Um das Problem der Probenkontamination zu überwinden, haben wir eine Methode entwickelt, bei der das Strept-Tachin-Tetramer zunächst durch chemische Vernetzung stabilisiert wird.

Das resultierende vernetzte Harz wird zur Reinigung des Bait-Proteins und seines Bindungspartners verwendet. Die Probenauszug mit SDS gewährleistet eine hohe Proteinrückgewinnung, während die chemische Vernetzung des Harzes die Elution des mit Strep-Tag markierten Bait-Proteins und seines Bindungspartners ohne Probenkontamination durch freigesetztes Strep ermöglicht. Puffern Sie ein verschlossenes Mikroröhrchen, das zwei Milligramm BS3-Vernetzer enthält, auf Raumtemperatur.

Bereiten Sie eine Pipettenspitze für die Harzübertragung vor, indem Sie das Ende der Spitze abschneiden, um das Strep-Tactin- und Macro-Prep-Harz durch kurzes, kräftiges Schütteln wieder in Suspension zu bringen, und übertragen Sie umgehend 600 µL der Suspension in eine CoStar-SpinX-Filterzentrifugenkolonne. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 4.000 U/min. Geben Sie bei Raumtemperatur 450 µL gepufferte Phosphatlösung (phosphate buffered saline) hinzu. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, das primäre Amin Tris durch nichtreaktives Phosphat zu ersetzen.

Entfernen Sie das Durchflussvolumen. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Gefäß mehrmals umdrehen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Waschschritte zwei Mal und lassen Sie das Harz in 430 Mikrolitern P-B-S-P-H acht zurück.

Nach der letzten Zentrifugation perforieren Sie die Folie des No-Way-Mikroröhrchens mit einer Pipettenspitze, die 100 Mikroliter Milli-Q-Wasser enthält, und lösen Sie das BS-3-Pulver durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in Wasser auf. Sobald sich das BS-3 vollständig gelöst hat, geben Sie umgehend 20 Mikroliter der Lösung auf die Spin-X-Säule. Stellen Sie sicher, dass die Inhalte gründlich gemischt werden.

Drehen Sie die Säule 30 Minuten bei Raumtemperatur, wobei sichergestellt werden muss, dass das Harz gründlich mit der BS-Drei-Lösung vermischt wird. Um die Reaktion abzubrechen, geben Sie sechs Mikroliter dreimolarer Triss, der mit Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt wurde, hinzu. Drehen Sie die Säule weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie anschließend 30 Sekunden bei 4.000 U/min.

Bei Raumtemperatur resuspendieren Sie das vernetzte Harz in 450 µL Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 und verwerfen Sie den Durchlauf. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Waschschritte noch zweimal. Im letzten Schritt resuspendieren Sie das Harz in 450 µL TBS. Überführen Sie die Harzsuspension in ein frisches Röhrchen, resuspendieren Sie das im Säulchen verbliebene Harz mit weiteren 450 µL TBS und überführen Sie es in dasselbe Röhrchen.

Wiederholen Sie den letzten Schritt noch einmal, um den maximalen Transfer des Harzes von der Säule in das Reagenzglas sicherzustellen. Lassen Sie das Reagenzglas mit der Harzsuspension 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen und stellen Sie das Volumen auf 600 Mikroliter ein. Durch das Entfernen des überschüssigen TBS ist das Harz entweder sofort gebrauchsfertig oder kann bei vier Grad Celsius ohne Einfrieren gelagert werden.

Diese Methode eignet sich zur Reinigung jeglicher Twin-Strep-markierter Fusionsproteine und ihrer assoziierten Komplexe. Das Protein kann tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein und kann entweder aus einem gesamten Zelllysat oder einer angereicherten organellen Fraktion isoliert werden. In diesem Beispiel isolieren wir das Twin-Strep-markierte Protein VPG Pro des Kartoffelvirus A aus der nukleären Fraktion virusinfizierter Pflanzen, indem wir zunächst eine Milliliter-Probe der Bait-Proteinprobe in Bindungspuffer bei 13.000 U/min zehn Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Überführen Sie das Überstand in ein frisches Gefäß, um die Bindung endogener biotinylierter Proteine an das Strep-Tact und das Harz zu minimieren. Geben Sie Avadon bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und stellen Sie sicher, dass die Inhalte gründlich gemischt sind. Inkubieren Sie unter Schwenken für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Suspendieren Sie das vernetzte Harz durch Vortexen und geben Sie mithilfe einer Cup-Pipettenspitze sofort 50 Mikroliter der Harzsuspension in das Röhrchen mit der Probe des Bait-Proteins. Inkubieren Sie weitere 30 Minuten unter Rotation bei vier Grad Celsius. Stellen Sie den Thermomixer auf 55 Grad Celsius ein und erwärmen Sie 500 Mikroliter Elu-Puffer für den Elutionsschritt vor. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 2000 U/min und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Harz mit einem Milliliter vorab gekühltem Waschpuffer. Erstens: rotieren Sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Waschschritte insgesamt dreimal, im letzten Schritt ebenfalls.

Suspendieren Sie das Harz in 250 Mikrolitern Waschpuffer Nummer zwei und überführen Sie die Harzsuspension in eine frische Spinx-Säule. Suspendieren Sie das im Gefäß verbliebene Harz in weiteren 250 Mikrolitern Waschpuffer Nummer zwei und überführen Sie es in dieselbe Säule. Zentrifugieren Sie drei Minuten bei 2000 U/min und vier Grad Celsius. Überführen Sie die Säule in ein frisches Dolphin-Nose-2-ml-Gefäß und entsorgen Sie den Durchlauf.

Fahren Sie unmittelbar mit dem folgenden Eluierungsschritt fort. Geben Sie 150 Mikroliter vorgewärmten Elutionspuffer auf die Spinx-Säule. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 55 Grad Celsius im Thermomixer mit Schütteln bei 1400 U/min, zentrifugieren Sie anschließend eine Minute bei Raumtemperatur mit 4.000 U/min und entsorgen Sie die Säule.

Die gereinigten Zielproteine sind nun bereit für weitere Analysen und können unter minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Das Bild zeigt, dass die Proteinelution aus Streptactin-Macro-Prep-Harz mit Biotin im Vergleich zur Elution mit SDS unvollständig ist. Der Unterschied in den Signalintensitäten der Western Blot-Aufnahme spiegelt unterschiedliche Proteinausbeuten wider, die mit den beiden Elutionsmethoden erzielt wurden. Obwohl die Elution mit SDS deutlich effizienter ist als die Elution mit Biotin, führt sie zu einer Kontamination der Probe mit freigesetztem Streptactin.

Das Bild zeigt ein Silbernitrat-Gelelfärbung von SDS-EITs aus der Strept-Actin-Macro-Prep-Harzaufbereitung; beachten Sie das Vorhandensein von freigesetztem Strept-Actin in der linken Spur, jedoch dessen Abwesenheit in der rechten Spur. Die Probe auf der linken Seite stammte vom nicht vernetzten Harz, die Probe auf der rechten Seite vom mit BS drei vernetzten Harz. Basierend auf diesen Ergebnissen schlussfolgern wir, dass die Vernetzung mit BS drei die Freisetzung von Strept-Actin aus dem Harz während der SDS-Elution verhindert.

In diesem Beispiel verwendeten wir Strept-Actin-Macro-Prep-Harz, das mit BS³ vernetzt wurde, um das Bait-Protein VPG PRO und seine Bindungspartner zu reinigen. Eine Aliquotprobe der gereinigten Probe wurde einer Massenspektrometrie-Analyse zur Proteinidentifizierung unterzogen. Das Fehlen eines spezifischen Bands in der Negativkontrolle bestätigt die Spezifität des Pull-downs.

Das niedrigere Band entspricht dem Bait-Protein VPG PRO und das obere Band seinem Bindungspartner NIB, der durch Massenspektrometrie identifiziert wurde. Hallo, wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie chemische Vernetzung verwendet werden kann, um die mit Dena und Illusion aus dem Strep-Tactin-Harz verbundenen Einschränkungen zu überwinden. Neben der Reinigung von Protein-Protein-Komplexen kann die Methode auch zur Reinigung von Protein-Komplexen mit Nukleinsäuren eingesetzt werden, einschließlich solcher, die mit Formaldehyd rückwärts vernetzt wurden.

Schließlich kann die Methode zur Reinigung von Strep-Tech-Membranproteinen verwendet werden, die mit Detergenzien solubilisiert wurden. Detergenzien sind erforderlich, um diese hydrophoben Proteine in Lösung zu halten.

Jedoch kann ihre Anwesenheit zu einer Probenkontamination durch Freisetzung von Strep-Tactin führen. Selbst wenn eine milde Biotin-Elution verwendet wird, sind wir der Ansicht, dass die Vernetzung des Harzes eine Lösung für das Problem der Probenkontamination darstellt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Okay.