In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aggregationskinetik von unmodifizierten und hyperphosphorylierten Tau-Proteinspezies zu überwachen und zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst unmodifiziertes und hyperphosphoryliertes Tau-Protein durch das Reißverschluss-unterstützte Katalysatorsystem erzeugt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Aggregationsassays so einzurichten, dass sie für eines von zwei verschiedenen Instrumenten geeignet sind.

Der Tau-Aggregationsprozess wird durch die Fluoreszenz von zwei verschiedenen Thio überwacht. Flavin stirbt, das von Flavin S und das von Flavin T. Der letzte Schritt besteht darin, die Aggregationskurven darzustellen und zu vergleichen. Letztendlich werden die kinetischen Veränderungen der Thioflavinfluoreszenz von der Bindung an aggregierte TA-Spezies verwendet, um die hyperphosphorylierungsabhängige Verstärkung des Tau-Flimmerns in vitro zu zeigen.

Hallo, willkommen zu unserem JOV-Artikel. In-vitro-Aggregationsassays mit Hyperphospho-Tau-Protein. Mein Name ist Minko, und die Experimente werden nebenbei durchgeführt und vorgeführt.

Und für dieses Protokoll ein einigermaßen frischer Aggregationspuffer, der innerhalb des letzten Monats erstellt wurde. Kurz vor seiner Verwendung DIO drei Etol zu einem Millimolar hinzufügen, ist auch A filtrierter Theo Flavin-Tee oder S-Stammlösung erforderlich. Hein-Stammlösung, sowohl bei minus 20 Grad Celsius lagerfähig als auch Handtuchprotein bei minus 80 Grad Celsius.

Ziehen Sie das Handtuch auf Eis und passen Sie dann die Konzentration mit dem Aggregationspuffer nach Bedarf an, um die Konsistenz zu gewährleisten. Drehen Sie das Handtuch mit Aggregationspuffer und 20.800 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Übertragen Sie nun das Supinat in ein anderes Röhrchen und halten Sie es auf Eis, bis es Zeit ist, die Aggregationsreaktion zusammenzusetzen.

Bereiten Sie das Aggregationsgemisch in 1,5-Milliliter-Mikrozentriröhrchen vor. Laut Tabelle reichen 100 Mikroliter für ein Aliquot von Reaktanten. Berechnen Sie das Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der Reaktionen und erhöhen Sie es um 10 %, um Pipettierfehler zu berücksichtigen.

Pfeffer kann bei Bedarf durch Rausäure oder Aggregationspuffer ersetzt werden. Mischen Sie die Reaktionen durch Inversion und übertragen Sie sie ohne Vegetation auf 37 Grad Celsius. Füllen Sie die Reaktionen alle 24 Stunden mit einem zusätzlichen Millimolar DTT auf, um eine reduzierende Umgebung für die Messung der Fluoreszenz zu gewährleisten.

Erwärmen Sie das Spektrenfluorimeter für ca. 10 Minuten. Dadurch wird die Konsistenz der Messungen in der Computersoftware verbessert. Wählen Sie den Echtzeitanzeigemodus aus, der sich im Kontrollzentrum des Geräts befindet.

Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 450 Nanometer ein, wobei der Spalt bei zwei Nanometern liegt, und stellen Sie die Emissionswellenlänge auf 510 Nanometer mit dem Spalt von fünf Nanometern ein. Kehren Sie dann zum Kontrollzentrum des Geräts zurück und wählen Sie die Analyse mit konstanter Wellenlänge. Drücken Sie die Hinzufügen-Taste im oberen Rahmen, um einen Satz von Wellenlängen hinzuzufügen.

Legen Sie die Erfassungsparameter des Standardfehlers auf eins und die maximalen Versuche auf drei fest. Klicken Sie dann auf Hinzufügen. Klicken Sie anschließend auf Los, um das Datenanzeigefenster zu öffnen.

Klicken Sie nun im Datenanzeigefenster auf Akt starten, um das Dialogfeld für neue Proben zu öffnen, und wählen Sie Unbekannt als Beispieltyp aus. Bereiten Sie dann die Reaktionen vor, um Messungen alle 100 Mikroliter bei 98 durchzuführen. Mikroliter Aggregationspuffer und zwei Mikroliter drei Millimolare Moleküle aus Flavin S oder T pipettieren die Mischung mehrmals, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten.

Übertragen Sie alle 200 Mikroliter einer Mischung auf ein FA drei qve und laden Sie es in Position. Anschließend Lecklauf, um die Fluoreszenzdaten zu sammeln Nachdem Sie die Lösung aus dem Veter genommen haben, spülen Sie sie dreimal mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie im Luftstrom. Dieser Assay bezieht den Fluoreszenzfarbstoff in die Aionenreaktion ein, was kontinuierliche Messungen ermöglicht und besser mit einem automatischen Mat-Well-Plattenleser durchgeführt wird.

Ein regulärer for-Parameter funktioniert ebenfalls durch die Geschwindigkeit des manuellen Betriebs. Richten Sie die Aggregationsmischung in einer undurchsichtigen schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen ein. Bei 360 Mikrolitern reicht ein Well-Volumen von 200 Mikrolitern für jede Zeitpunktmessung.

Mischen Sie jede Reaktion gut durch Pipettieren. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius und fügen Sie alle 24 Stunden ein zusätzliches Millimolar DTT hinzu, um zu jedem Zeitpunkt eine reduzierende Umgebung zu gewährleisten. Schalten Sie für eine Messung den Multi-Mode-Mikroplatten-Reader und den Computer mindestens 10 Minuten im Voraus in der Computersoftware ein.

Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und wählen Sie den Fluoreszenzintensitätsmodus. Stellen Sie dann die Anregungswellenlänge auf 450 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf fünf und 10 Nanometer ein. Setzen Sie die 96-Well-Platte in den Draw ein und drücken Sie die Lesetaste.

Bringen Sie die Platte nach der Messung sofort wieder in den Inkubator zurück, bevor Sie die Daten analysieren. Der Dauermodus-Assay kann mit einem kompakten Spektralphotometer für diesen Assay durchgeführt werden. Bereiten Sie das Aggregationsgemisch in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. 200 Mikroliter Reaktionen reichen aus, um einen Zeitpunkt zu messen.

Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um. Richten Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius oder Raumtemperatur ein und fügen Sie alle 24 Stunden zusätzlich ein Millimolar DTT hinzu, um Messungen durchzuführen. Richten Sie das Urometer und die Software wie für den No-Die-Terminal-Assay ein.

Übergeben Sie die gesamte Mischung an einen Tierarzt und legen Sie sie in den Probenhalter im Probenraum und schließen Sie den Deckel. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenzdaten in den entsprechenden Zeitintervallen zu erfassen. Wenn dieses Intervall kurz ist, z. B. 30 oder 60 Sekunden, ist es in Ordnung, den Q Vet zwischen den Messungen im Gerät zu lassen, bis der letzte Zeitpunkt erreicht ist.

Bringen Sie die Reaktion aus dem Vete wieder in das Probenröhrchen zurück und stellen Sie das Röhrchen wieder in den Inkubator, wenn es fertig ist. Lehnen Sie den Vete wie zuvor angewiesen mit rekombinantem Tau und P tal. Es wurden zwei verschiedene Protokolle entwickelt, um die Kinetik der Aggregation von tau und p tal zu vergleichen, wobei die starke Fluoreszenzemission von flavin t und s bei der Bindung an Amyloid-Proteinaggregate, einschließlich tau und p tal, mit oder ohne den Fluoreszenzfarbstoff genutzt wurde.

In der Aggregationsreaktion kam es zu einer konsistenten Verstärkung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung. Typischerweise steigen die T- und P talliga innerhalb der ersten 30 Minuten schnell an, bevor es zu einer signifikanten Verlangsamung kommt, einschließlich des Flavins. T in den Aggregationsreaktionen führt zu einer signifikanten Verzögerung der Aggregationsrate.

Sowohl Theof Flavian als auch t näherten sich nach 160 Minuten Reaktionszeit einem Plateau. Bioflavine s hingegen verursachten keine nennenswerte Verlangsamung der Aggregation. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Zentralnervensystem-Isoformen oder andere aggregationsanfällige Proteine bei der Neurodegeneration, wie z.B. mit dem Assay durchgeführt werden, um den Beitrag der Proteinisierung zur Pathogenese nach ihrer Entwicklung zu verstehen.

Diese Technik der Vorbereitung eines Hyperphosphat-Top-Protein-PA-Weges für die Forschung auf dem Feld, zahlreiche Krankheiten, um unsere Therapeutika und Arzneimittelentwicklung zu erforschen.