Name: Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie die Dynamik von Aip1p in Hefe mit mutanter Actin-Isoform durch TIRF-Mikroskopie untersucht wird. Diese Methode zeigt verlangsamte Proteinbewegungen bei der R256H-Mutation.

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Die Autoren danken Peter Rubenstein für nützliche Diskussion und technische Beratung und David Pellman für die ursprüngliche PB1996-Klon. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der March of Dimes und Finanzierung von der Fahrt für die Kinder unterstützt.

1. Klonierung in das Plasmid PB1996 <ol><li> Gestalten und bestellen DNA-Primer von einer Oligonukleotid-Produktionsgesellschaft, die die Zielsequenz flankieren und mit einzigartigen Restriktionsstellen in der ausgewählten Eltern Plasmid. HINWEIS: In diesem Fall Primer wurden entworfen, um die 400 Basenpaare am 5&#39;-Ende des AIP1 Sequenz zu amplifizieren. Die XhoI Restriktionsstelle wurde etwa 20 bp vor dem AIP1 Sequenz in die Primer eingebaut und XmaI enthalten war etwa 20 bp nach dem Ziel AIP1 Folge. Das für die Klonierung verwendete Plasmid war PB1996, die eine 3XGFP Tag für Fluoreszenz, eine URA-Gen für Hefe-Stamm Auswahl und ein Ampicillin-Resistenz-Gen für bakterielle Selektion enthalten. </li><li> Reinige die genomische DNA aus einem Hefe-Ura haploiden Stamm. Hinweis: Lesen Sie für ein Diagramm der Abbildung 1 Klonens. </li><li> Führen Sie ein Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung der beiden Primer und die Hefe genomische DNA, um die Aip1p Gen mit den Restriktionsstellen entweder en verstärkend. Digest das PCR-Produkt und der PB1996 Plasmid mit den Restriktionsenzymen in getrennten Reaktionen pro Hersteller empfohlenen Protokolle. In diesem Fall XmaI und XhoI wurden mit dem zugehörigen Puffer bei 37 ° C für 1 h verwendet. </li><li> Ausführen eines 0,8% Agarose-Gel-Elektrophorese, um die verdauten DNA-Fragmente zu trennen. In einem gut, legen Sie eine geringe DNA-Leiter und Masse, in separaten Brunnen, laden die ganze Reaktion von jedem Verdauung. Die Elektrophorese bei 100 Volt für etwa 1 h, bis die Farbstofffront in der Nähe des Ende des Gels. Visualisieren Sie das Gel unter UV-Licht und reinigen Sie das Segment, das an das Protein Segment entspricht und die geschnittene Plasmid. </li><li> Ligation der verdauten AIP1 Segment und PB1996 Plasmid. Transformation des Produkts in DH5 &amp;agr;-Zellen unter Verwendung von Protokollen des Herstellers (10 ul DNA mit 100 ul Zellen 30 min auf Eis, Hitzeschock bei 42 ° C für 2 min, wachsen in SOC-Medium für 2 h bei 37 ° C) und die Platte auf Kulturplatten dass das Antibiotikum zur Selektion enthalten, in diesem Fall LB +Amp-Platten. Wählen Sie wachsen und eine Kolonie in Flüssigkultur. Reinige den neu gestalteten Plasmid. </li></ol> 2. Mutant Hefestamm-Generation <ol><li> Verwenden Sie einen haploiden Hefestamm, in der die Aktin-Allel wurde gestrichen, um eine mutierte Hefestamm bauen. Hinweis: In diesem Fall ist die Elternstamm war ein großzügiges Geschenk von Dr. Peter Rubenstein (University of Iowa) und der Bau wurde von 20 Koch et al Dieser Stamm fehlt die chromosomale Actin-Gens und enthält ein Plasmid, das Wildtyp-Hefe kodiert. Aktin und Uracil. </li><li> Verwenden Sie die pRS Plasmid, das Wildtyp-Hefe-Aktin mit einem Trp + Auswahl als Basis für die Mutagenese Plasmid-21. </li><li> Führen gerichtete Mutagenese auf der pRS Plasmid, um die Missense-Mutation in Aktin-Ingenieur. <ol><li> Für die R256H Mutation in Aktin, machen den Primer 5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39;, die Arg 256 bis 256 Seine ändern. Führen Sie einen Standard-MutagenesePCR Reaktion mit dem Plasmid aus Schritt 2.2. </li><li> Transformieren Sie die Mutante Aktin Plasmid aus der PCR in DH5a Zellen. Isolieren der Plasmid-DNA zu sequenzieren und die Aktin-Gen, um die Mutation zu überprüfen. </li></ol></li><li> Transformieren Sie das Plasmid kodiert mutierten Hefe-Aktin in den haploiden Hefestamm aus Schritt 2.1. </li><li> Kultur die transformierten Zellen auf Trp-Platten für die Hefe, die den Trp + enthält mutierte Hefe Aktin Plasmid auswählen. </li><li> Wählen Sie für die Zellen ohne den ursprünglichen Wildtyp-Plasmid, das Aktin und Uracil (in 2.1 beschrieben) durch Unter Kultivierung von Zellen aus den Trp-Platten auf Platten, die 5-Fluororotsäure (5-FOA) enthalten kodiert. 5-FOA wird der giftige Form, 5-flurouracil umgewandelt, in Yeas Stämme die funktionelle URA3-Gen exprimiert. Die Zellen, die nach der Auswahl schrittweise wachsen wird nur der Mutante Aktin Plasmid enthalten. </li><li> Ein Reinigen der Plasmid-DNA aus den neuen Hefestamm. Sequenz, die das Plasmid, um sicherzustellen, das mutierte Gen Aktin vorhanden ist. Verwenden Sie diese strainieren in weiteren Studien. Dieser Vorgang ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. </li></ol> 3. Umwandlung der Plasmid in Hefezellen <ol><li> Verdauen die Aip1p-GFP-Plasmid mit einem Restriktionsenzym, die Integration in den Hefe-Chromosom zu ermöglichen. HINWEIS: Die Restriktionsstelle muss außerhalb des Sequenzblock, der die Fluoreszenz-Tag, das Gen von Interesse und Selektionsmarker enthält. In diesem Fall verwenden 1 ul Restriktionsenzym HpaI mit 8 ul DNA und 1 &amp;mgr; l des beigefügten 10x-Puffer für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Kultur S. cerevisiae-Zellen (aus Stufe 2.5), die nicht Uracil (Ura-Stamm) über Nacht in 5 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Dextrose) auf einem Rad bei 30 º C zu synthetisieren Spin down 1 ml der Zellen für 5 min bei 1.000 x g. </li><li> Machen PLATE Mischung. Machen 10XTE durch Zugabe von 5 ml 1 M Tris pH 7,5 und 2 ml von 250 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 43 ml ddH 2 O. In 0.204 G Lithiumacetat zu 20 ml 1XTE, dann 8 g Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht ~ 3300) und sterilfiltriert. </li><li> Dekantieren des Überstandes von den Zellen, die in Schritt 3.2 gesponnen und Resuspendieren der Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit. Auf die suspendierten Zellen, add 2 ul 10 mg / ml Lachshoden-DNA-Träger. Werden 10 &amp;mgr; l der verdauten Plasmid-DNA aus Schritt 3.1 und Wirbel. In 0,5 ml PLATE und Wirbel. In 20 ul 1 M DTT und Wirbel. </li><li> Inkubieren der Mischung für 6-8 Stunden bei 25 ° C. Hitzeschock der Zellen in einem Wasserbad bei 42 ° C für 10 min. Platte 100 ul der Zellen vom Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, wo sie sich auf eine-Ura Platte abgesetzt haben. Inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage oder bis Kolonien bilden. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien und Streifen heraus auf eine Platte-Ura. ANMERKUNG: Diese Zellen enthalten, die das Plasmid mit dem AIP1-GFP und Ura-Gen in das Chromosom integriert, was für das Wachstum. Diese Zellen werden dann in Mikroskopie verwendet werdenpy. </li></ol> 4. Visualisierung der Aip1p Protein Bewegung Mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy <ol><li> Wachsen einer Kultur von Hefe-Zellen mit dem einge Aip1p-GFP in YPD über Nacht auf einem Rad bei 30 ° C. Subculture 1 ml der Übernachtkultur in 9 ml-Ura-Medien. Wachsen die Zellen für weitere 3-4 Stunden auf einem Schüttler bei 30 ° C, um sicherzustellen, dass sie in log-Wachstumsphase sind. </li><li> In 3 ul der Zellen auf einen Glasobjektträger und fügen Sie ein Deckglas. Lassen Sie die Zellen auf dem Objektträger für 5 min zu begleichen. Legen Sie die Folie in der Klammer der Tischplatte. </li><li> Beachten Sie die Aip1p-GFP-Protein mit einem Totalreflexion (TIRF)-Mikroskop (488 nm) mit einem Öl-Immersion 100X TIRF Ziel und eine digitale CCD-Kamera. Mit Slidebook 5.0 Software, Bilder für 20 Sekunden zu erhalten, mit einer Geschwindigkeit von 5 Bildern / s (Individuelle Rahmen der aufgenommenen Bilder werden in 2A vorgelegt). <ol><li> Um auf der c konzentrierenEllen, offene Slidebook 5.0-Software und klicken Sie auf den Fokus-Fenster in der Symbolleiste, um die Schwerpunkte steuert den Zugriff. Wählen Sie die Registerkarte Bereich und wählen Sie den 100X-TIRF Ziel. Schalten Sie die Lampe auf und schieben Sie die Lampenleiste, um 15%. Ändern Sie die Einstellung, um Bin 2 x 2. Filter ändern zu Hellfeld. </li><li> Auf dem Mikroskop, verwenden Sie die Feinfokus Wahl, um die Zellen in den Fokus zu bringen, wie auf dem Computerbildschirm zu sehen. </li><li> Mit den Kontrollen im Fokus Fenster, schalten Sie die Lampe aus, ändern Sie die Filter, um zu leben, und klicken Sie auf die Schaltfläche TIRFM. </li><li> Auf der TIRFM Illuminator auf die rechte Seite Port des Mikroskops befestigt, drehen Sie die Laseremission auf On. </li><li> Wählen Sie die Registerkarte-Stream im Fokus Fenster, das Kontrollkästchen neben der Aufnahme zu beginnen, und klicken Sie dann auf Hellfeld-Taste. </li><li> Auf der TIRFM Illuminator, drehen Sie den Mikrometer, den Einfallswinkel des Lasers anpassen. Dies wird verwendet, um die Fluoreszenzemission von der AIP1-GFP Foci zu optimieren und minimieren die Hintergrundfluoreszenz von derZellen und Rutsche. </li><li> Wenn das gewünschte Bild angezeigt wird, drücken Sie Start. Nach 20 Sekunden, drücken Sie Stop. Speichern Sie die Bilder. Unter der Registerkarte Datei auf der Hauptmenüleiste Slide Speichern unter, und geben Sie den Speicherort der Datei und den Namen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ImageJ-Software, um die Bilder zu analysieren. Verwenden Sie den Makro-Plugin &quot;Manuelle Tracker&quot;, die Bewegung und die Geschwindigkeit der Fluoreszenz Aip1p Herde zu verfolgen. Ändern Sie den Parameter Zeitintervall auf 0,2 sek. <ol><li> Mit dem Add Track-Auswahl, wählen und verfolgen eine individuelle fluoreszierende Protein durch vier Minuten vor acht Verbindungsrahmen. Verwenden Sie den Befehl Ende Spur und die Geschwindigkeit der Proteinbewegung zwischen den einzelnen Bildern wird in einem Ergebnisfenster angezeigt. </li><li> Bestimmen Sie die Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den einzelnen Bildern mit einer Microsoft Excel-Tabelle. Verwenden der Werte, um die mittlere Geschwindigkeit der Bewegung Aip1p für jede Zelllinie von Interesse zu berechnen. HINWEIS: Ein Streudiagramm der Rate der Aip1p Bewegung und den durchschnittlichen, nicht-lineare Geschwindigkeit in Figu gezeigtre 2B. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine wirksame Strategie, um die Dynamik des Zytoskeletts und der Nutzen in Untersuchungen auf pathogene Mutationen visualisieren hier beschrieben wurde. Erweiterte bildgebenden Verfahren haben neue Möglichkeiten, um die intrazelluläre Bewegung von Proteinen in der Nähe der Zellmembran verstehen erstellt. Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) ist eine empfindliche Methode für funktionelle Untersuchungen in lebenden Zellen. TIRF verwendet einen abgewinkelten Anregungslaser, ein evaneszentes Feld aufgrund der Diffe...

Aktin ist der Hauptprotein, das das Zellskelett und beteiligt sich an kritische zelluläre Prozesse einschließlich Zellteilung, Organellen Bewegung, Zellbewegung, Kontraktion und Signalisierung. Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben krankheitsverursachende Mutationen in Aktin in jeder der sechs menschlichen Actin-Isoformen, die zu einer Reihe von Erkrankungen entdeckt worden, von Myopathien Koronararterienerkrankung 1-7. Die Prozesse, durch die Aktin Mutationen führen zu Krankheit weiter erläutert. Die Hefe-Modell bleibt der Goldstandard, um die biochemischen Auswirkungen von Mutationen auf die Aktin-Funktion aufgrund der Vorteile des Binnen wesentliche Aktin-Isoform, genetische Lenkbarkeit und hohe Erhaltung der Aktin-Sequenz und Funktion zu untersuchen. Studien zeigen, dass einzelne Aktin-Mutationen führen zu spezifischen molekularen Funktionsstörungen mit dominant negative Effekte 8. Zum Beispiel, Taubheit verursachenden Mutationen in γ-Nicht-Muskel-Aktin, die die Lys-118-Rest beeinflussen verändern Regulierung durchdas Aktin-bindende Protein Arp2 / 3 9. Studien häufig in vitro-Analysen beschäftigen Protein-Protein-Interaktionen. Untersuchungen über die Wirkung der Mutationen auf Aktin Zellbiologie und insbesondere Aktin-Bindeproteinlokalisierung in der Zelle begrenzt. Studien der Hefe Zytoskeletts in vivo konventionell verlassen sich auf Bilder von fixierten Zellen von einem invertierten Fluoreszenzmikroskop 10. Diese Experimente geliefert grundlegende Daten über die Morphologie des Actin-Cytoskeletts. Untersuchungen haben seit dreidimensionalen konfokalen Abbildungs ​​eingebaut, um die komplexen Zytoskelett-Netzwerk 11, 12 sichtbar. Dieses bildgebende ermöglicht die Quantifizierung der Fülle und der relativen Lage der Aktin-Filamente und Patches. Dünnelektronentomographie hat zu Bild verwendet wurde die Morphologie der dichten Fadennetze relativ zu erhalten subzellulärer Strukturen 13. Crowded zellulären sSchritte mit einem kleinen Querschnitt kann in feinen Details mit dieser Technik untersucht werden. Imaging-Studien haben lebende Zellen mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie erweitert. Als Bleich Foto-und Hintergrundfluoreszenz moderiert werden, ermöglicht Zeitraffer-Imaging Untersuchungen der Dynamik der Proteine ​​des Zytoskeletts und der Reaktion auf Umweltbedingungen 11, 14. Getrennt davon wurde die Visualisierung der Dynamik von Aktin-Filamenten in vitro durch die Einführung von Total-Innenreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie schoben. Im Vergleich zu Weitfeld-Mikroskopie, TIRF hat den Vorteil der verringerten Hintergrundfluoreszenz und verbesserte Kontrast zu einzelnen Fäden 15, 16 zu überwachen. Mit diesen Eigenschaften ist TIRFM Zellbiologen angepasst worden, um Zellstrukturen an der Plasmamembran 17, 18 zu überwachen. Cellular Ereignisse, einschließlich der Änderungen im Zytoskelett, kannEchtzeit mit niedrigen Phototoxizität, maximaler Kontrast und minimaler Hintergrundfluoreszenz 19 visualisiert werden. Um die Wirkung der Mutationen auf die Aktin-Bewegung, Lokalisierung und Umsatz von Zytoskelett-Proteine ​​in der Zelle, TIRF-Mikroskopie und Proteinmarkierungs besseren Verständnis verwendet. Hierin sind Verfahren, um die Auswirkungen einer klinisch relevanten Mutation in Aktin auf Zytoskeletts in Saccharomyces cerevisiae untersucht werden beschrieben. Insbesondere ist die Lokalisierung und Bewegung des Aktin-bindendes Protein, Aip1p wurde visualisiert und in Zellen die R256H-Mutation in Actin exprimieren quantifiziert. Diese Techniken ergänzen biochemischen in vitro Studien und ermöglichen ein besseres Verständnis der Protein-Interaktionen und Funktionen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, einzelsträngig aus Lachshoden</td><td>Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>Warnung! Schädliche Reizungen</td></tr> Pilz<tr><td>-/Bakterien-DNA-Kit</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Jedes Kit funktioniert</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>06.01.2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD-Medien</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>Medien</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>Jedes PCR-Gerät funktioniert</td></tr><tr><td>TIRF Mikroskop</td><td>Olympus IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA-R Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p dynamics werden von der r256h mutation in actin altered

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutationen in Aktin verursachen eine Reihe von Krankheiten des Menschen durch spezifische molekulare Veränderungen, die oft ändern Zytoskelett-Funktion. In dieser Studie Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung interner Total Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie wird verwendet, um Veränderungen im Zytoskelett-Dynamik zu visualisieren und zu quantifizieren. TIRF-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen ermöglicht auch eine Quantifizierung der Änderungen Zytoskeletts durch Mutationen in Aktin verursacht. Unter Verwendung dieser Technik Quantifizierung der Zytoskelett-Funktion in lebenden Zellen wertvoll ergänzt in vitro-Studien der Proteinfunktion. Als Beispiel wurden Missense-Mutationen, die die Aktin-Rest R256 in drei menschlichen Actin-Isoformen hindeutet diese Aminosäure eine wichtige Rolle in regulatorischen Wechselwirkungen identifiziert. Die Wirkungen von Aktin R256H-Mutation auf Zytoskelett Bewegungen wurden unter Verwendung des Hefe-Modell untersucht. Das Protein, AIP1, die bekannt ist, Cofilin in Aktin Depolymerisation zu unterstützen, warmit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert am N-Terminus und in vivo unter Verwendung von TIRF-Mikroskopie verfolgt. Die Rate der Aip1p Bewegung sowohl in Wildtyp-und Mutanten-Stämme wurde quantifiziert. In Zellen R256H-Mutante Aktin exprimieren, ist Aip1p Bewegung eingeschränkt und die Geschwindigkeit der Bewegung ist fast die Hälfte der Geschwindigkeit gemessen in Wildtyp-Zellen (0,88 ± 0,30 um / s in R256H-Zellen im Vergleich zu 1,60 ± 0,42 um / s in Wildtyp-Zellen, S. &lt;0,005).

Verfahren zur Abbildung der Dynamik von Zytoskelett-Proteine ​​in der Zelle präsentiert wird. Die Aktin-bindende Protein, Aip1p wurde mit GFP markiert. Der Entwurf für das Plasmid, das das markierte Produkt kodiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasmid wurde dann in den Hefe-Zellen transformiert. Expression des fluoreszenzmarkierten Aip1p erlaubt die Visualisierung des Verhaltens Protein in der Zelle. Aip1p lokalisiert in der Regel an Aktin-Patches an den Standorten der Endozytose 22. ...

Krankheitsverursachende Mutationen in Aktin-Zytoskelett-Funktion kann zu verändern. Cytoskeletal Dynamik werden durch Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung von internen Totalfluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Als Beispiel hat die Zytoskelett-Protein, Aip1p, Lokalisierung und Bewegung in Zellen, die das mutierte Aktin-Isoform exprimieren, R256H verändert.

Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bewegung des Aktin-bindenden Proteins in Hefe zu visualisieren, die eine mutierte Aktin-Isoform exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid hergestellt wird, das das Gen für das mit einem dreifachen grünen fluoreszierenden Protein Fluor vier markierte Aktin-Interaktionsprotein eins oder A IP eins P enthält. Der zweite Schritt besteht darin, einen Hefestamm zu erzeugen, der ausschließlich die Wildtyp- oder mutierte Aktin-Form exprimiert.Anschließend wird das GFP-markierte A IP one P-Plasmid in den Wildtyp- oder Mutanten-Hefestamm transformiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Bewegung des markierten A IP one P in Hefezellen des Wildtyps und des Mutanten zu bildlich darzustellen und zu analysieren. Letztendlich totale innere Reflexion.Mithilfe von Fluoreszenz- oder Rasenmikroskopie lässt sich zeigen, dass sich A IP one P in Hefe, die das R 2 56 H-Mutantenaktin exprimieren, langsamer bewegt als in Hefe mit Wildtyp-Aktin. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Cytoskeletts zu beantworten, beispielsweise die relativen zeitlichen Bewegungen von Bindungspartnern. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als ich feststellte, dass das Löschen von A IP one P in der Mutantenhefe im Gegensatz zum Wildtyp-Stamm letal war.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie liegt in dem verbesserten Kontrast und der höheren Bildgeschwindigkeit. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, die Mikroskopeinstellungen für ihr jeweiliges Experiment zu optimieren, aufgrund der zahlreichen möglichen Anpassungen und der subjektiven Natur der Bildqualität. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Herstellung des A IP one PGFP-Plasmids und des mutierten Hefestamms gemäß den Anweisungen im Textprotokoll und verdauen Sie das Plasmid mit einem Restriktionsenzym, um die Integration in das Hefechromosom zu ermöglichen.Die vorbereiteten S-C-V-C-A-Zellen, die nicht in der Lage sind, Uracil zu synthetisieren, werden über Nacht in fünf Milliliter YPD-Medium auf einem Rotor bei 30 Grad Celsius inkubiert. Zentrifugieren Sie ein Milliliter der Zellen fünf Minuten lang mit 1000 × g. Danach stellen Sie die Plattenmischung gemäß den Anweisungen im textlichen Protokoll her und filtrieren das Überstandmedium, um es steril zu machen. Dekantieren Sie den Überstand von den Zellen und resuspendieren Sie die Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit, um die suspendierten Zellen zu erhalten.Fügen Sie zwei Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter haltigen Träger-DNA aus Lachstestes hinzu. Danach geben Sie 10 Mikroliter des digerierten Plasmids, DNA, hinzu und wirbeln es, bevor Sie 0,5 Milliliter Plättchen hinzufügen und erneut wirbeln. Schließlich geben Sie 20 Mikroliter einer einmolaren DI-Drei-Etol-Lösung hinzu und wirbeln erneut.Nach einer Inkubation der Mischung für sechs bis acht Stunden bei 25 Grad Celsius. Hitzeschock der Zellen in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten. 100 Mikroliter der Zellen vom Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, wo sie sich abgesetzt haben, auf eine Minus-U-Platte auftragen.Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage oder bis Kolonien entstehen. Wählen Sie einzelne Kolonien aus und streichen Sie diese auf ein minus.ATE-Medium aus. Für die Mikroskopie enthalten diese Zellen das Plasmid mit dem A IP eins GFP und UroGen, das in das Chromosom integriert ist.Züchten Sie eine Kultur der Hefezellen mit integriertem A IP one PGFP in YPD über Nacht auf einem Rotor bei 30 Grad Celsius. Impfen Sie ein Milliliter der Übernachtkultur in neun Milliliter Minus-Euro-Medien um. Züchten Sie die Zellen zusätzlich drei bis vier Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie sich in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.Fügen Sie anschließend drei Mikroliter Zellen auf einen Glasobjektträger hinzu und geben Sie ein Deckglas darauf. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang auf dem Objektträger absetzen. Beobachten Sie vor dem Einlegen des Objektträgers in die Halterung der Objekttischplatte das A IP one PGFP-Protein mit einem Mikroskop mit totaler innerer Reflexionsfluoreszenz (TIRF) unter Verwendung eines ölimmersionsoptischen 100×-TIRF-Objektivs und einer digitalen CCD-Kamera.Um die Zellen zu fokussieren, öffnen Sie die Software Slide Book 5.0 und klicken Sie auf die Schaltfläche „Fokusfenster“ in der Symbolleiste. Um auf die Fokusierungssteuerung zuzugreifen, wählen Sie den Reiter „Scope“ und anschließend das 100×-Turf-Objektiv aus. Schalten Sie die Lampe ein und stellen Sie den Lampenregler auf 15 %. Ändern Sie die Binning-Einstellung auf zwei mal zwei und wechseln Sie den Filter auf Hellfeld am Mikroskop.Verwenden Sie den Feinfokus, um die Zellen scharfzustellen, wie auf dem Computerbildschirm zu sehen. Drehen Sie mithilfe der Steuerelemente im Fokusfenster die Lampe aus, wechseln Sie den Filter auf „Live“ und klicken Sie die T-I-R-F-M-Taste am T-I-R-F-M-Beleuchter, der am rechten Seitenport des Mikroskops angebracht ist. Schalten Sie die Laseremission ein und wählen Sie im Fokusfenster die Registerkarte „Stream“ aus.Wählen Sie das Kästchen neben „Aufnahme starten“ aus und klicken Sie dann auf die Hellfeld-Taste am TIR-FM-Beleuchter. Drehen Sie am Mikrometer, um den Einfallswinkel des Lasers einzustellen. Dies dient dazu, die Fluoreszenzemission der A IP one GFP-Foci zu optimieren und die Hintergrundfluoreszenz der Zellen und des Objektträgers zu minimieren, sobald das gewünschte Bild angezeigt wird.Start drücken. 20 Sekunden lang Bilder mit einer Rate von fünf Bildern pro Sekunde aufnehmen. Nach 20 Sekunden „Stop“ drücken.Speichern Sie die Bilder über die Registerkarte „Datei“ in der Hauptmenüleiste. Wählen Sie „Folie speichern unter“ und geben Sie die Datei, den Speicherort und den Namen ein. Verwenden Sie anschließend die Image-J-Software.Verwenden Sie zum Analysieren der Bilder das Makro-Plugin „Manual Tracker“, um die Bewegung und Geschwindigkeit der fluoreszierenden A IP one P-Foci zu verfolgen. Ändern Sie den Zeitintervall-Parameter auf 0,2 Sekunden. Wählen Sie mithilfe der Funktion „Add Track Selection“ ein einzelnes fluoreszierendes Protein aus und verfolgen Sie es über vier bis acht zusammenhängende Einzelbilder.Verwenden Sie den N-Track-Befehl, und die Geschwindigkeit der Proteinbewegung zwischen jedem Einzelbild wird in einem Ergebnisfenster angezeigt. Bestimmen Sie die mittlere Geschwindigkeit zwischen den Einzelbildern mithilfe einer Microsoft-Excel-Tabelle.Verwenden Sie die Werte, um die Durchschnittsgeschwindigkeit einer IP₃P-Bewegung oder eines jeden interessierenden Zellstamms zu berechnen, um die IP₃P-Bewegung zu quantifizieren. Mehr als 50 fluoreszierende IP₃P-Foci wurden in mehr als 10 Zellen verfolgt. Repräsentative Ergebnisse der IP₃P-Bewegung in Wildtyp-Zellen sind wie erwartet dargestellt.Das fluoreszenzmarkierte A IP eins P bewegt sich schnell durch die Zelle und verschwindet anschließend in Zellen, die das R 2 56 H-Mutant-Actin exprimieren. A IP eins P zeigt eine geringere Bewegung im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Die Bewegung des Proteins wird mithilfe von Image J quantitativ verfolgt und kartiert.Ein A IP one P bewegt sich im Wildtyp-Stamm über die gesamte Zelle, während es sich im Mutanten-Stamm nur in einem begrenzten Bereich fortbewegt. Im mutierten Actin-Stamm wurde die durchschnittliche Geschwindigkeit für jeden fluoreszierenden A IP one P-Bereich berechnet. In Wildtyp-Zellen beträgt die mittlere Geschwindigkeit der Bewegung von A IP one P 1,60 ± 0,42 Mikrometer pro Sekunde. Zellen, die das R 2 56 H-Mutant-Actin exprimieren, das für eine abnormale Morphologie des Aktin-Cytoskeletts bekannt ist, weisen im Mutanten-Stamm ein verändertes A IP one P-Phänotyp auf.Die Bewegung von A IP one P ist eingeschränkt und langsamer. Die durchschnittliche Geschwindigkeit der Bewegung von A IP one P beträgt 0,88 ± 0,30 Mikrometer pro Sekunde. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zytoskelettproteine mithilfe der Turf-Mikroskopie abbilden kann.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen nicht austrocknen oder photobleichen.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered

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