Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Permeabilität in einzelnen Mikrogefäßen isolierter Rattenlungen mit Hilfe einer fluoreszenzbasierten Methode zu quantifizieren. Dazu werden zunächst Rattenlungen isoliert und mit autologem Blut durchblutet. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen linksatrialen Mikrokatheter in eine kleine Region der Lunge einzuführen, um Dextrin der Flora 4 zu infundieren.

Während das markierte Dextrin infundiert wird, werden Bilder der Lungenmikrogefäße aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Permeabilität einzelner Mikrogefäße aus den Bildern mit Hilfe einer Software zu quantifizieren. Letztendlich können die Ergebnisse den Grad der Durchlässigkeit der Lungenmikrogefäße unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. nach einer LPS-Behandlung, zeigen.

Verfahren wird von Dr. Kava Kasami, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Durchführung einer Tracheotomie an einer männlichen Ratte in einer bestätigten chirurgischen Anästhesieebene. Verwenden Sie eine Trachealkanüle PE 90 und befestigen Sie diese mit Nähten. Als nächstes infundieren Sie das Herz mit 100 bis 200 Einheiten Heparin mit einer 21-Gauge-Schmetterlingsnadel

Warten Sie eine Minute und entbluten Sie dann das Blut. Sammeln Sie das Blut und legen Sie es mit Kochsalzlösung beiseite. Füllen Sie zwei Kanülen aus drei Millimeter dicken, vier Zentimeter langen und an einem Ende aufgeweiteten Tigon-Schlauch.

Führen Sie nun eine Thorakotomie durch. Machen Sie einen Schnitt, der gerade groß genug für die Kanüle ist, in den rechten Ventrikel und schieben Sie ihn in die ausgestellte Höhle einer Kanüle in Richtung Lungenarterie. Befestigen Sie die Kanüle mit Nähten.

Verwenden Sie die gleiche Technik, um die andere Kanüle in die Spitze des linken Ventrikels in Richtung des linken Vorhofs einzuführen. Sichern Sie es mit zwei Millimeter breitem Nabelband. Entfernen Sie nun das hinderliche Bindegewebe und entfernen Sie die Lang- und Herzkranüle zusammen mit den Kanülen.

Übertragen Sie sie in eine Petrischale, wobei die Zwerchfellfläche der Lunge nach oben zeigt und die drei Kanülen alle ausgerichtet sind. Bringen Sie das präparierte Präparat auf einen verstellbaren Tisch, der mit Tigon-Rohren Nummer 18 ausgestattet ist, die an Druckmessumformern befestigt sind, die als Einlass- und Auslassrohre dienen. Mischen Sie nun die Blutentnahme mit einem gleichen Volumen von 5%iger Albuminlösung.

Geben Sie diese Mischung in den Ladebehälter. Starten Sie die Pumpe mit 14 Millilitern pro Minute. Achten Sie darauf, dass der Schlauch keine Luftblasen aufweist.

Bei der Vorbereitung. Befestigen Sie die Lungenarterie am Lungeneintrittsschlauch und die linke Vorhofkanüle am Auslassschlauch. Vergewissern Sie sich, dass sich keine Luft in den Rohren befindet, und prüfen Sie auch, ob der Shunt offen ist.

Verbinden Sie die Trachealkanüle mit einem dritten Druckaufnehmer. Blasen Sie die Lunge über die Trachealkanüle mit 30% Sauerstoff auf. Halten Sie die Lunge auf einem Wasserdruck von fünf Zentimetern.

Klemmen Sie nun den Shunt ein und starten Sie die Pumpe mit 14 Millilitern pro Minute. Um die Lungenperfusion während der Perfusion zu beginnen, stellen Sie die Pumpe so ein, dass der Lungendruck bei etwa 10 Zentimetern Wasser und der linke Vorhofdruck bei drei Zentimetern Wasser gehalten wird. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der mit Blut angereicherten Lunge.

Bauen Sie zunächst einen Infusionskatheter aus einem 40 Zentimeter langen PE 10-Schlauch, der in einen 30 Zentimeter langen PE 90-Schlauch eingeführt wird. Befestigen Sie das andere Ende des PE 10-Schlauchs an einer 30-Gauge-Nadel, die an einer Ein-cm³-Spritze befestigt ist. Bringen Sie das Ende des an der Lunge befestigten Schlauchs über das Präparat und befestigen Sie den Infusionskatheter daran.

Führen Sie den Infusionskatheter in den linken Vorhof und dann in die Lunge, bis er auf Widerstand stößt. Übermäßige Krafteinwirkung verletzt die Lunge. Die richtige Inzision des Mikrokatheters ist von entscheidender Bedeutung, da jede Schädigung der Lunge durch den Mikrokatheter den Erfolg des Protokolls verringert.

Füllen Sie als Nächstes die Spritze mit Ringern und befestigen Sie sie an einer Pumpe. Lassen Sie die Lösung langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute ziehen. Allmählich wird die Infusionsstelle im Vergleich zum Rest der Lunge blass, um die Lungenoberfläche in Kunststoff mit Ausnahme der Infusionsstelle schnell feucht zu halten.

Um nun die Lunge sichtbar zu machen, erstellen Sie ein Sichtfenster, indem Sie einen O-Ring an einem 22 Millimeter dicken Deckglas befestigen. Befestigen Sie den O-Ring mit Absperrfett an einem Reagenzglashalter. Positionieren Sie dann das Fenster über der Infusionsstelle.

Vervollständigen Sie die Einrichtung, indem Sie ein 20-fach-Objektiv über den Deckglas schwingen und sich auf die Lunge fokussieren. Es ist keine visuelle Verzerrung zu erwarten. Gießen Sie nun die Lunge mit einer Lösung Ihrer Wahl.

In diesem Beispiel wird nach der Kochsalzlösung ein Milliliter ZI-konjugiertes Dextrin über die Spritzenpumpe über einen Zeitraum von 60 Minuten in die Lunge infundiert. Nehmen Sie mit der Bildgebungssoftware ein Bild pro Minute über die einstündige Infusion auf und setzen Sie die Aufzeichnung während der anschließenden Auswaschung fort. Schritt Nach der Infusion des Fitz-Dextrins waschen Sie es aus, indem Sie die Lungenringerlösung für mindestens weitere 10 Minuten bei der gleichen Flussrate infundieren. Später. Bei der Analyse der aufgenommenen Bilder wird die maximale Fluoreszenzintensität in der interessierenden Region während der fit-e-Infusion bewertet.

Bewerten Sie dann die maximale Fluoreszenzintensität der Restfluoreszenz nach der 10-minütigen Auswaschung. Veränderungen der Gefäßpermeabilität wurden unter Verwendung einer Fitzy-Dextrin-Infusion nach Behandlung mit bakteriellem Lipopolysaccharid untersucht, da dies ein weit verbreitetes Modell eines LI ist.Die Rest-Fit-e-Fluoreszenz war bei Mikrogefäßen, die mit Ringern behandelt wurden, niedrig, aber bei denen, die mit LPS behandelt wurden, hoch. Darüber hinaus führte die LPS-Infusion im Vergleich zur Ringer-Infusion zu einer signifikanten Verringerung des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Erhöhung der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet.

Darüber hinaus führte die LPS-Infusion im Vergleich zur Ringer-Infusion zu einer signifikanten Verringerung des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Erhöhung der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte es ein gutes Verständnis dafür haben, wie man isolierte Vogelprophylaxelungen vorbereitet, einen Mikrokatheter für den linken Schwanz einführt und die Durchlässigkeit in Mikro definiert.