Name: Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit in isolierten Rattenlungen mit fluoreszenzbasierten Methoden. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung pulmonaler Gefäßnetzwerke.

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Die Studien wurden durch die NIH HL75503 KP unterstützt.

Alle Versuche an Tieren durchgeführt wurden, wie durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Tennessee Health Science Center genehmigt. 1. Schläuche zur Perfusion Rattenlunge Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie ein Schlauchsystem mit Tygon-Schlauch (# 18) für die Durchblutung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Verbinden Druckwandler (P23XL) und legen Sie den Schlauch auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Eingestellt Wasserbadtemperatur auf 37 ° C </li><li> Schließen Sie die Lunge und Austritts vorübergehend mit Tygon-Schlauch. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Blutinfusionsschlauch. Das Schema zeigt den Schlauch Setup für zirkulierenden Blut durch die isolierte Lungen Zubereitung verwendet. Angedeutet sind assoziiert Komponenten, durch die der Schlauch is geleitet. Eine schematische Darstellung des Herzens und der Lunge ist enthalten, um Websites von Verbindung zwischen der Rohrleitung und Lungenarterie (PA) zu zeigen, und linken Vorhof (LA) Kanüle (blau gestrichelte Linien). 2. Herstellung von isolierten Rattenlungen <ol><li> Anesthetize Ratten (Sprague-Dawley Ratten, 250-300 g) mit Ketamin (80-100 mg / kg) und mit Xylazin (5-10 mg / kg). Nach Sicherstellung eines chirurgischen Ebene der Anästhesie, legen Sie das Tier in Rückenlage. </li><li> Führen Tracheotomie, legen Sie eine Trachealkanüle (PE-90) und mit chirurgischem Nahtmaterial. </li><li> Infuse Heparin (100-200 U) in das Herz durch Herzpunktion (21 G Butterfly-Nadel), warten Sie 60 Sekunden und exsanguinate Blut (~ 12-15 ml Blut). </li><li> Bereiten Sie zwei Kanülen (Tygon-Schlauch, 3 mm Durchmesser 4 cm lang, an einem Ende abgefackelt) füllen und mit Kochsalzlösung. </li><li> Führen Sie eine Thorakotomie. Einen Einschnitt (3 mm) auf der rechten Herzkammer und schieben Sie die erweiterten Ende einer Kanüle in den Schnitt in Richtung der LungenArterie. Sichern Kanüle Lungenarterie mit chirurgischem Nahtmaterial. </li><li> Inzision (3 mm) die Spitze der linken Herzkammer und schieben Sie das erweiterte Ende der zweiten Kanüle in den Schnitt. Führen Sie die Kanüle in den linken Vorhof. Sicherung Kanüle in den linken Ventrikel mit einem Nabelband (2 mm Breite). </li><li> Präparieren Sie jede Bindegewebe, und zusammen in die Lunge und Herz mit den beigefügten Kanülen. Zeigen Lunge und Herz auf eine Petrischale. Positionieren Sie die Lunge, so dass der Zwerchfellfläche nach oben zeigt. Die drei Kanülen sollten die gleiche Richtung zeigen. </li><li> Legen Sie das Lungenpräparat auf einer Bühne, die in den XY-Richtung manipuliert werden können. Jede Bühne, die mit einem Mikroskop kommt, kann geändert werden, um den Schlauch oder eine maßgeschneiderte Bühne gebaut, wenn nötig zu halten. </li></ol> 3. Blut Perfusion der isolierten Rattenlungen <ol><li> Mischen Sie das Blut ausgeblutet mit einer gleichen Menge Albumin (5%) und in den Behälter. Starten Sie die Schlauchpumpe und Durchfluss gesetzt raß bis 14 ml / min. Das Blut, um den Schlauch zu füllen. </li><li> Mit der Shunt geöffnet, entfernen Sie die temporären Lungen Einlass-Auslass-Anschluss. Befestigen der Lungenarterie und der linken atrialen Kanüle in die Lunge Einlaß bzw. Auslaß. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen. </li><li> Verbinden der Trachealkanüle einer dritten Druckwandler (P23XL). Pumpen Sie die Lungen mit 30% Sauerstoff über die Trachealkanüle und Druck aufrecht zu erhalten, auf 5 cm H 2 O. </li><li> Schließen Sie den Shunt mit einer Klammer an Lungendurchblutung beginnen. Aufrechterhaltung Lungenarterie und der linken atrialen Druck bei etwa 10 cm 3 und H 2 O sind. </li></ol> 4. Vorbereitung Lung für mikrovaskuläre Infusion <ol><li> Erhöhen des hinteren Endes des Verlängerungsschlauch für den Katheter über dem Niveau der Lunge und sicher. </li><li> Bereiten Sie einen Infusionskatheter durch Einfügen von ca. 30 cm aus einer 40 cm langen Schlauch in eine PE10 ~ 30 cm lang PE90-Schlauch. Verbinden des freigelegten Endes des PE10-Schlauch mit einer Nadel (30 G)befestigt an einer Spritze (1 ml). </li><li> Legen Sie die Katheter-Kombination in der angehobenen hinteren Ende des Verlängerungsschlauch. Führen Sie den Katheter Kombination durch den linken Vorhof und in die Lunge, bis sie auf Widerstand stößt. Dann drücken Sie den PE10 Katheter allein weiter in die Lunge, bis sie auf Widerstand stößt. Beachten Sie, dass die Anwendung übermäßiger Kraft beim Einführen des Katheters wird die Lunge verletzen. </li><li> Füllen Sie den 1-ml-Spritze mit Ringerlösung und heften sich an einer Spritzenpumpe. Stellen Infusionsrate auf 10 ml / min. </li><li> Infusionsstelle werden im Vergleich zum Rest der Lunge blass. </li><li> Befeuchten Sie die Lunge mit Kochsalzlösung und decken die Lunge mit Plastikfolie mit einem Loch, das groß genug ist, um die Infusionsstelle aufgedeckt verlassen. </li><li> Tupfen Sie etwas Schliffett auf der Unterseite eines O-Ring (nach Maß) und setzen Sie ein Deckglas (# 1.5, 22 mm Durchmesser) auf dem Boden der O-Ring. Positionieren Sie vorsichtig den O-Ring mit dem Deckglas auf der Infusionsstelle. Sichern Sie den O-Ring mit einem Standard-Test-Rohr-holder. Das Deckglas / O-Ring-Kombination nicht die Wabenstrukturen verzerren darunter, wie kürzlich berichtet, 15. </li><li> Positionieren Sie ein Ziel (20X) von einem Fluoreszenz-Mikroskop über dem O-Ring und konzentrieren sich auf die Lungenoberfläche. </li></ol> 5. Fluorescent Imaging Dextran Transit durch Mikrogefäße <ol><li> Bereiten Sie das Mikroskop für die Bildgebung FITC Fluoreszenz. </li><li> Wählen Sie eine Region, die abgebildet werden und die Bilder zu erwerben zum Preis von 1/Minute mit Bildaufnahme-Software. </li><li> Beginn der Infusion von FITC-Dextran 20 kD (0,5 mg / ml) unter Verwendung der Spritzenpumpe. Fluoreszenz in den Blutgefäßen erhöht sich allmählich, und ein Maximum erreichen. Weiter Infusion für 60 min. </li><li> Dann Ringer-Infusion wechseln zu waschen luminalen Fluoreszenz. Pflegen Infusion über 10 min. Weiter Bildaufnahme in 1/min beim Abwaschen. </li></ol> 6. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Datei. </li><li> Platz Regionenvon Interesse über Mikrogefäßen innerhalb des Bildrahmens. </li><li> Spielen Sie die Bilddatei, Frame-by-Frame und notieren Sie die Fluoreszenzintensität bei jeder Region von Interesse für alle Rahmen. </li><li> Zeichnen Sie die Änderung in der Fluoreszenzintensität für jeden interessierenden Bereich als Funktion der Zeit. </li><li> Quantifizieren Sie die maximale Fluoreszenzintensität und der Restfluoreszenzintensität nach 10 min Auswaschen. </li><li> Berechnung des Verhältnisses der maximalen Restfluoreszenzintensität in jedem Bereich von Interesse, die Durchlässigkeitsindex für Mikrogefäßen mit dieser Region von Interesse verbunden zu bekommen. </li></ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
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<li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li>
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<li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+1985%22%5BJournal%5D)">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li>
<li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat in Verbindung mit Echtzeit-Bildgebung liefert ein einfaches Tool zur Bestimmung der Durchlässigkeit Veränderungen in einzelnen Mikrogefäßen der Lunge. Diese Methode wurde die Durchlässigkeit sich in Reaktion auf Infusionen von LPS zu definieren. Unsere Daten legen nahe, dass deutlich LPS-Infusion verursacht einen Anstieg der mikrovaskulären Durchlässigkeit. Ferner können die Daten auch, dass Veränderungen der Durchlässigkeit durch LPS induzierten waren in beiden Venen und Kapi...

Erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität in der Lunge führt zu einer Entwicklung der alveolären Ödem und beeinträchtigt den Gasaustausch und ist ein wesentliches Merkmal des akuten Lungenversagens (ALI) 03.01. Somit sind die Schätzungen der vaskulären Permeabilität bei der Festlegung des Umfangs der Lungenschädigung und die Wirksamkeit der vorgeschlagenen therapeutischen Maßnahmen wichtig. Gravimetrische Analyse wie Blut kostenlos Lungen nass-Trocken-Verhältnis und mikrovaskulären Filtrationskoeffizient sind weit verbreitete Methoden, die Durchlässigkeit 4,5 schätzen. Andere Methoden umfassen die Quantifizierung der Retention von radioaktiven oder fluoreszierenden Sonden im Lungengewebe 6-8. Allerdings sind die obigen Verfahren erfordern postexperiment Verarbeitung von Lungengewebeproben zu der Aufklärung der Permeabilität Daten. Darüber hinaus, da ein Tier nur für einen einzigen Behandlungsprotokoll verwendet werden, große Tierzahlen kann für eine vollständige Untersuchung erforderlich sein. Ein gemeinsames Merkmal der oben genannten Verfahren ist, dass sie die mittlere Gefäßdurchlässigkeit fürAlle Blutgefäße innerhalb der Gewebeprobe. Es ist jedoch bekannt, dass Lungen Mikro-und Makrogefäße phänotypisch unterschiedlichen 9. Daher kann Lässigkeit heterogene Reaktionen zwischen den verschiedenen Gefäßsegmente als auch 9,10 sein. So Quantifizierung mittlere Durchlässigkeit aller Lungengefäße in einer Gewebeprobe kann nicht angemessen widerspiegelt diese Heterogenität. In der isolierten durchbluteten Lungen Vorbereitung können Blutgefäße auf der Lungenoberfläche von einem aufrechten Mikroskop 4,11,12 visualisiert werden. Dies ermöglicht die Charakterisierung Antworten in Einzelgefäße und damit, Adressierung keine Heterogenität in den Antworten 13. Zusätzlich kann durch die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungsmikrogefäße können fluoreszenzbasierten Assays eingebaut werden. Ferner kann eine linke Herzmikrokatheter verwendet werden, um Agenten und Fluoreszenzsonden in Blutgefäße 11,14 liefern werden. Der Mikrokatheter begrenzt die Lieferung an einen kleinen Lungenbereich, also abposiert nur die Blutgefäße in der Region zu den infundiert Mittel und Fluorophore. Dadurch können mehrere kleine Regionen innerhalb der Lunge zu verschiedenen Experimenten verwendet werden, was zu einer Gesamtverringerung der Tiere für eine Untersuchung erforderlich ist. Echtzeit-Bildgebung ermöglicht eine Erfassung der dynamischen Veränderungen im vaskulären und extravaskulären Fluoreszenz der einzelnen Mikrogefäße des isolierten Lungenpräparat. Somit wird für jede Mikrogefäß innerhalb eines Bildfeldes, Änderungen der Fluoreszenz während der Infusion von Fluorophoren und Auswaschen aufgezeichnet werden können, und quantifiziert offline 14. Mit Werten der maximalen und Restgefäß Fluoreszenz kann eine Durchlässigkeit Index für jedes Mikrogefäß im Imaging-Bereich bestimmt werden. Änderungen der Permeabilität als Reaktion auf schädliche oder entzündliche Agenzien zu bestimmen, können die gewünschten Mittel zuerst verabreicht werden und dann wird der Durchlässigkeitsindex bestimmt. Darüber hinaus kann das Bildfeld überall in der Lunge durch die Region infundiert eingestellt werdenMikrokatheter, wodurch eine hohe Flexibilität in der Auswahl der gewünschten Gefäßnetz. Somit ist die isolierten Blutdurchbluteten Lungenpräparat im Tandem mit Echtzeit-Bildgebung bietet eine attraktive experimentellen Modell die Durchlässigkeit in einzelnen Mikrogefäßen der Lunge zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>#18</td></tr><tr><td>Druckmessumformer</td><td>Data Sciences International</td><td>P23XL</td><td>Benötigte Menge 3</td></tr><tr><td>Butterfly Needle</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>21 G</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>PE-90 Schlauch</td><td>Becton Dickinson</td><td>427421</td><td>30 cm benötigt</td></tr><tr><td>PE-10 Schlauch</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>40 cm benötigt</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS8000</td><td></td></tr><tr><td>O-Ring</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung mit einem 20 mm Durchmesser Loch und einem Griff zur Befestigung des O-Rings an der Halterung</td></tr><tr><td>Aufrechte Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus America</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Metamorph</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 20KD</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>0,5 mg/ml (Es kann ein Dextran mit unterschiedlicher Molekülgröße ausgewählt werden, wenn Versuchsexperimente auf der Grundlage der berechneten Permeabilitätsindexwerte auf seine Eignung hinweisen)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Serotyp 0111:B4</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der mikrogefäßdurchlässigkeit im einzel isolierten blutdurchbluteten lungen rat vorbereitung

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat ist weit verbreitet, zu visualisieren und zu definieren Signalisierung in einzelnen Mikrogefäßen. Durch Kopplung dieser Zubereitung mit Echtzeit-Bildgebung, wird es möglich, Veränderungen der Durchlässigkeit der einzelnen Lungenmikrogefäßen zu bestimmen. Hier beschreiben wir Schritte, um Rattenlungen isolieren und durchströmen sie mit Eigenblut. Dann skizzieren wir Schritte, um Fluorophore oder Agenten über einen Mikrokatheter in eine kleine Lungenbereich ziehen lassen. Mit diesen beschriebenen Verfahren haben wir festgestellt Lässigkeit erhöht in Rattenlunge Mikrogefäße als Reaktion auf Infusionen von bakteriellen Lipopolysaccharide. Die Daten zeigten, dass Lipopolysaccharid erhöhte Flüssigkeitsleck über beide venulären und Kapillar-Mikrogefäßsegmente. Somit macht es dieses Verfahren möglich, die Durchlässigkeit Reaktionen unter Gefäßsegmente zu vergleichen und definieren keine Heterogenität in der Antwort. Während häufigsten verwendeten Methoden, um Lungendurchlässigkeit definieren erfordern Nachbearbeitung von Lungengewebeproben, dieVerwendung von Echtzeit-Bildgebung entfällt diese Anforderung aus dem vorliegenden Verfahren als deutlich. So bietet die isolierte Lungenpräparat kombiniert mit Echtzeit-Bildgebung mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der Lungenmikrovaskuläre Permeabilität zu bestimmen, noch ist eine einfache Methode zu entwickeln und umzusetzen.

Isoliertes bluteten Lungen Zubereitung der Infusionsschlauch und zugehörige Ausrüstung verbunden ist, in Fig. 2 gezeigt. Zu Demonstrationszwecken verwendeten wir eine Sprague-Dawley-Ratten, obwohl die hierin beschriebenen Verfahren können mit beliebigen Spezies Ratte verwendet werden. Infusionen über einen linksatrialen Mikro erreichen nur einen kleinen Bereich der Lunge. Das aufgegossene Region kann durch die Infusion induzierte Verfärbung (Fig. 3) identifiziert werden. Die Lunge Zuber...

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Permeabilität einzelner Mikrogefäße in isolierten Rattenlungen mithilfe einer fluoreszenzbasierten Methode zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lungen von Ratten isoliert und mit autologem Blut perfundiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen linken atrialen Mikrokatheter in einen kleinen Bereich der Lunge einzuführen, um fluoreszenzmarkiertes Dextran zu infundieren.Anschließend werden während der Infusion des markierten Dextrins Bilder der Lungenmikrogefäße aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Permeabilität einzelner Mikrogefäße anhand der Bilder mithilfe einer Software zu quantifizieren. Letztendlich können die Ergebnisse den Grad der Permeabilität der Lungenmikrogefäße unter verschiedenen Bedingungen, beispielsweise nach LPS-Behandlung, anzeigen.Dr. Kava Kasami, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Führen Sie zunächst eine Tracheotomie an einem männlichen Ratten durch, die sich in einer bestätigten chirurgischen Narkosetiefe befindet. Verwenden Sie eine PE-90-Trachealkanüle und befestigen Sie diese mit Nähten. Anschließend geben Sie 100 bis 200 Einheiten Heparin über eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel in das Herz ein. Warten Sie eine Minute und entnehmen Sie dann das Blut. Sammeln Sie das Blut und stellen Sie es zusammen mit Kochsalzlösung beiseite. Füllen Sie zwei Kanülen, die aus vier Zentimeter langem Tigon-Rohr mit drei Millimeter Durchmesser bestehen und an einem Ende aufgeweitet sind.Führen Sie nun eine Thorakotomie durch. Machen Sie einen Einschnitt, der gerade groß genug ist, um die Kanüle in den rechten Ventrikel einzuführen, und schieben Sie die aufgeweitete Spitze einer Kanüle in Richtung Lungenarterie vor. Sichern Sie die Kanüle mit Nähten.Verwenden Sie dieselbe Technik, um die andere Kanüle in die Spitze des linken Ventrikels in Richtung linkem Vorhof einzuführen. Sichern Sie sie mit einem zwei Millimeter breiten Nabelschnurband. Entfernen Sie nun das behindernde Bindegewebe und nehmen Sie das Herz samt den Kanülen heraus.Überführen Sie sie in eine Petrischale mit der Zwerchfellfläche der Lunge nach oben und den drei Kanülen in Ausrichtung. Bringen Sie das präparierte Gewebe auf eine verstellbare Halterung, die mit Nummer-18-Tigon-Schläuchen ausgestattet ist, die an Druckmesswandler angeschlossen sind und als Einlass- und Auslassschläuche dienen. Mischen Sie nun das gesammelte Blut mit einem gleichen Volumen an 5%iger Albumin-Lösung.Fügen Sie diese Mischung dem Ladebehälter hinzu. Starten Sie die Pumpe mit 14 Milliliter pro Minute. Stellen Sie sicher, dass sich in der Schlauchleitung keine Luftblasen befinden.Während der Vorbereitung. Befestigen Sie die Lungenarterie am Lungenzulaufschlauch und die linke Vorhofkanüle am Auslassschlauch. Überprüfen Sie sorgfältig, dass sich keine Luft in den Schläuchen befindet, und stellen Sie außerdem sicher, dass der Shunt geöffnet ist.Schließen Sie die tracheale Kanüle an einen dritten Drucktransducer an. Blasen Sie die Lungen über die tracheale Kanüle mit 30 % Sauerstoff auf. Halten Sie die Lungen bei einem Druck von fünf Zentimetern Wassersäule.Nun den Shunt abklemmen und die Pumpe mit 14 Milliliter pro Minute starten. Um die Lungenperfusion zu beginnen, die Pumpe so einstellen, dass der pulmonale Druck bei etwa 10 Zentimeter Wassersäule und der linksatriale Druck bei drei Zentimeter Wassersäule gehalten wird. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der mit Blut infundierten Lunge.Zunächst stellen Sie einen Infusionskatheter her, indem Sie ein 40 cm langes Stück PE 10-Schlauchmaterial in ein 30 cm langes Stück PE 90-Schlauchmaterial einführen. Befestigen Sie das andere Ende des PE 10-Schlauchs an einer Nadel mit 30 Gauge, die an einer Ein-Kubikzentimeter-Spritze befestigt ist. Führen Sie das mit der Lunge verbundene Ende des Schlauchs über die Präparation hinweg und verbinden Sie den Infusionskatheter damit.Führen Sie den Infusionskatheter in das linke Vorhof und anschließend in die Lunge, bis ein Widerstand spürbar ist. Übermäßiger Druck verletzt die Lunge. Ein korrekter Schnitt mit dem Mikrokatheter ist entscheidend, da jegliche Schädigung der Lunge durch den Mikrokatheter den Erfolg des Protokolls verringert.Füllen Sie als Nächstes die Spritze mit Ringer-Lösung und verbinden Sie sie mit einer Pumpe. Infundieren Sie die Lösung langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute. Allmählich wird sich die Infusionsstelle im Vergleich zum übrigen Lungenareal blass färben, um die Lungenoberfläche feucht zu halten, schnell in Kunststoff mit Ausnahme der Infusionsstelle.Um nun die Lunge sichtbar zu machen, erzeugen Sie ein Sichtfenster, indem Sie einen O-Ring auf einem 22 Millimeter großen Deckglas befestigen. Befestigen Sie den O-Ring mit Hahnfett an einem Reagenzglashalter. Bringen Sie dann das Fenster über der Infusionsstelle an.Vervollständigen Sie die Einrichtung, indem Sie ein 20×-Objektiv über die Deckglasabdeckung schwenken und auf die Lunge fokussieren. Es wird keine visuelle Verzerrung erwartet. Spülen Sie nun die Lunge mit einer Lösung Ihrer Wahl aus.In diesem Beispiel wird nach der Gabe von Kochsalzlösung über eine Stunde lang ein Milliliter ZI-konjugiertes Dextrin mittels einer Spritzenpumpe in die Lunge infundiert. Mit der Bildgebungssoftware wird während der einstündigen Infusion jede Minute ein Bild aufgezeichnet, und die Aufzeichnung wird anschließend im Schritt der Ausspülung weitere 10 Minuten lang fortgesetzt. Nach der Infusion des Fitz-Dextrins erfolgt die Ausspülung durch die Infusion von Ringer-Lösung für mindestens weitere 10 Minuten mit derselben Flussrate. Bei der Analyse der aufgezeichneten Bilder wird später die maximale Fluoreszenzintensität im interessierenden Bereich während der Fit-Infusion bewertet.Danach die maximale Fluoreszenzintensität der verbleibenden Fluoreszenz nach der 10-minütigen Auswaschung bewerten. Veränderungen der vaskulären Permeabilität wurden mittels Fitzy-Dextrin-Infusion nach Behandlung mit bakteriellem Lipopolysaccharid untersucht, da dies ein weit verbreitetes Modell einer LI darstellt. Die verbleibende Fit-e-Fluoreszenz war in Mikrogefäßen, die mit Ringer-Lösung behandelt wurden, gering, hingegen hoch in solchen, die mit LPS behandelt wurden. Darüber hinaus führte im Vergleich zur Ringer-Infusion die LPS-Infusion zu einer signifikanten Abnahme des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Zunahme der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet.Außerdem führte im Vergleich zur Ringer-Infusion die LPS-Infusion zu einer signifikanten Verringerung des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Erhöhung der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man isolierte Vogellungen vorbereitet, einen Mikrokatheter in den linken Lungenstamm einführt und die Permeabilität im Mikromaßstab bestimmt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung, Lüftungs-und Instrumentierung Mauslungen zu stabilisieren oder pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen zu messen, um die Auswirkungen des Blutflusses, Luftstrom-, Atemwegs-Änderungen und Gefäßveränderungen am rechten Ventrikels Nachlast zu quantifizieren.

Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

Hypoxische Lungenvasokonstriktion (HPV) ist ein wichtiges physiologisches Phänomen, durch das bei alveolarer Hypoxie-Lungenperfusion auf die Beatmung abgestimmt wird. Das wichtigste Gefäßsegment, das zu HPV beiträgt, ist die Intra-Acinar-Arterie. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Analyse von HPV von murinen Lungengefäßen mit Durchmessern von 20-100 m.

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Es wird eine Methode vorgestellt, um die mikrozirkulatorische Blutflussgeschwindigkeit bei Lungenkrebsmetastasen der Pleuraoberfläche bei Ratten automatisiert unter Verwendung der geschlossenen Lungen-Intravitalmikroskopie zu messen. Dieses Modell hat das Potenzial, als weit verbreitetes Werkzeug für die physiologische Forschung an Lungenmetastasen bei Nagetieren eingesetzt zu werden.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP) konnten Lungentransplantation beim Menschen leichter, indem du die Fähigkeit, Organe zu bewerten und zu erweitern den Spenderkreis zur Verfügung stehen. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer Ratte EVLP Programm und Verfeinerungen, die für ein reproduzierbares Modell für zukünftige Erweiterungen zu ermöglichen.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

Die modifizierte Landis-Technik ermöglicht die paarweise Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Mesenterium von normalen und genetisch veränderten Ratten unter Kontroll- und Testbedingungen unter Verwendung von Mikroperfusionstechniken. Es bietet eine bequeme Methode zur Bewertung von Mechanismen, die die Durchlässigkeit von Mikrogefäßen und den transvaskulären Austausch unter physiologischen Bedingungen regulieren.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

Das isolierte Kaninchenlungenpräparat ist ein Goldstandardwerkzeug in der Lungenforschung. Diese Publikation zielt darauf ab, die Technik zu beschreiben, die für die Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen entwickelt wurde, die an der Reaktivität der Atemwege, der Lungenerhaltung und der präklinischen Forschung bei Lungentransplantationen und Lungenödemen beteiligt sind.

Isoliertes Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell

Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B4.

Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte bei Mäusen über Läppchen hinweg

Erfahren Sie die Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit in isolierten Rattenlungen mit fluoreszenzbasierten Methoden. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung pulmonaler Gefäßnetzwerke.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

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