Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Permeabilität einzelner Mikrogefäße in isolierten Rattenlungen mithilfe einer fluoreszenzbasierten Methode zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lungen von Ratten isoliert und mit autologem Blut perfundiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen linken atrialen Mikrokatheter in einen kleinen Bereich der Lunge einzuführen, um fluoreszenzmarkiertes Dextran zu infundieren.

Anschließend werden während der Infusion des markierten Dextrins Bilder der Lungenmikrogefäße aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Permeabilität einzelner Mikrogefäße anhand der Bilder mithilfe einer Software zu quantifizieren. Letztendlich können die Ergebnisse den Grad der Permeabilität der Lungenmikrogefäße unter verschiedenen Bedingungen, beispielsweise nach LPS-Behandlung, anzeigen.

Dr. Kava Kasami, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Führen Sie zunächst eine Tracheotomie an einem männlichen Ratten durch, die sich in einer bestätigten chirurgischen Narkosetiefe befindet. Verwenden Sie eine PE-90-Trachealkanüle und befestigen Sie diese mit Nähten. Anschließend geben Sie 100 bis 200 Einheiten Heparin über eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel in das Herz ein.

Warten Sie eine Minute und entnehmen Sie dann das Blut. Sammeln Sie das Blut und stellen Sie es zusammen mit Kochsalzlösung beiseite. Füllen Sie zwei Kanülen, die aus vier Zentimeter langem Tigon-Rohr mit drei Millimeter Durchmesser bestehen und an einem Ende aufgeweitet sind.

Führen Sie nun eine Thorakotomie durch. Machen Sie einen Einschnitt, der gerade groß genug ist, um die Kanüle in den rechten Ventrikel einzuführen, und schieben Sie die aufgeweitete Spitze einer Kanüle in Richtung Lungenarterie vor. Sichern Sie die Kanüle mit Nähten.

Verwenden Sie dieselbe Technik, um die andere Kanüle in die Spitze des linken Ventrikels in Richtung linkem Vorhof einzuführen. Sichern Sie sie mit einem zwei Millimeter breiten Nabelschnurband. Entfernen Sie nun das behindernde Bindegewebe und nehmen Sie das Herz samt den Kanülen heraus.

Überführen Sie sie in eine Petrischale mit der Zwerchfellfläche der Lunge nach oben und den drei Kanülen in Ausrichtung. Bringen Sie das präparierte Gewebe auf eine verstellbare Halterung, die mit Nummer-18-Tigon-Schläuchen ausgestattet ist, die an Druckmesswandler angeschlossen sind und als Einlass- und Auslassschläuche dienen. Mischen Sie nun das gesammelte Blut mit einem gleichen Volumen an 5%iger Albumin-Lösung.

Fügen Sie diese Mischung dem Ladebehälter hinzu. Starten Sie die Pumpe mit 14 Milliliter pro Minute. Stellen Sie sicher, dass sich in der Schlauchleitung keine Luftblasen befinden.

Während der Vorbereitung. Befestigen Sie die Lungenarterie am Lungenzulaufschlauch und die linke Vorhofkanüle am Auslassschlauch. Überprüfen Sie sorgfältig, dass sich keine Luft in den Schläuchen befindet, und stellen Sie außerdem sicher, dass der Shunt geöffnet ist.

Schließen Sie die tracheale Kanüle an einen dritten Drucktransducer an. Blasen Sie die Lungen über die tracheale Kanüle mit 30 % Sauerstoff auf. Halten Sie die Lungen bei einem Druck von fünf Zentimetern Wassersäule.

Nun den Shunt abklemmen und die Pumpe mit 14 Milliliter pro Minute starten. Um die Lungenperfusion zu beginnen, die Pumpe so einstellen, dass der pulmonale Druck bei etwa 10 Zentimeter Wassersäule und der linksatriale Druck bei drei Zentimeter Wassersäule gehalten wird. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der mit Blut infundierten Lunge.

Zunächst stellen Sie einen Infusionskatheter her, indem Sie ein 40 cm langes Stück PE 10-Schlauchmaterial in ein 30 cm langes Stück PE 90-Schlauchmaterial einführen. Befestigen Sie das andere Ende des PE 10-Schlauchs an einer Nadel mit 30 Gauge, die an einer Ein-Kubikzentimeter-Spritze befestigt ist. Führen Sie das mit der Lunge verbundene Ende des Schlauchs über die Präparation hinweg und verbinden Sie den Infusionskatheter damit.

Führen Sie den Infusionskatheter in das linke Vorhof und anschließend in die Lunge, bis ein Widerstand spürbar ist. Übermäßiger Druck verletzt die Lunge. Ein korrekter Schnitt mit dem Mikrokatheter ist entscheidend, da jegliche Schädigung der Lunge durch den Mikrokatheter den Erfolg des Protokolls verringert.

Füllen Sie als Nächstes die Spritze mit Ringer-Lösung und verbinden Sie sie mit einer Pumpe. Infundieren Sie die Lösung langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute. Allmählich wird sich die Infusionsstelle im Vergleich zum übrigen Lungenareal blass färben, um die Lungenoberfläche feucht zu halten, schnell in Kunststoff mit Ausnahme der Infusionsstelle.

Um nun die Lunge sichtbar zu machen, erzeugen Sie ein Sichtfenster, indem Sie einen O-Ring auf einem 22 Millimeter großen Deckglas befestigen. Befestigen Sie den O-Ring mit Hahnfett an einem Reagenzglashalter. Bringen Sie dann das Fenster über der Infusionsstelle an.

Vervollständigen Sie die Einrichtung, indem Sie ein 20×-Objektiv über die Deckglasabdeckung schwenken und auf die Lunge fokussieren. Es wird keine visuelle Verzerrung erwartet. Spülen Sie nun die Lunge mit einer Lösung Ihrer Wahl aus.

In diesem Beispiel wird nach der Gabe von Kochsalzlösung über eine Stunde lang ein Milliliter ZI-konjugiertes Dextrin mittels einer Spritzenpumpe in die Lunge infundiert. Mit der Bildgebungssoftware wird während der einstündigen Infusion jede Minute ein Bild aufgezeichnet, und die Aufzeichnung wird anschließend im Schritt der Ausspülung weitere 10 Minuten lang fortgesetzt. Nach der Infusion des Fitz-Dextrins erfolgt die Ausspülung durch die Infusion von Ringer-Lösung für mindestens weitere 10 Minuten mit derselben Flussrate. Bei der Analyse der aufgezeichneten Bilder wird später die maximale Fluoreszenzintensität im interessierenden Bereich während der Fit-Infusion bewertet.

Danach die maximale Fluoreszenzintensität der verbleibenden Fluoreszenz nach der 10-minütigen Auswaschung bewerten. Veränderungen der vaskulären Permeabilität wurden mittels Fitzy-Dextrin-Infusion nach Behandlung mit bakteriellem Lipopolysaccharid untersucht, da dies ein weit verbreitetes Modell einer LI darstellt. Die verbleibende Fit-e-Fluoreszenz war in Mikrogefäßen, die mit Ringer-Lösung behandelt wurden, gering, hingegen hoch in solchen, die mit LPS behandelt wurden. Darüber hinaus führte im Vergleich zur Ringer-Infusion die LPS-Infusion zu einer signifikanten Abnahme des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Zunahme der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet.

Außerdem führte im Vergleich zur Ringer-Infusion die LPS-Infusion zu einer signifikanten Verringerung des Permeabilitätsindex, was auf eine globale Erhöhung der Permeabilität in allen Gefäßen innerhalb des Bildfeldes hindeutet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man isolierte Vogellungen vorbereitet, einen Mikrokatheter in den linken Lungenstamm einführt und die Permeabilität im Mikromaßstab bestimmt.