Name: Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Induktion akuter Hirntraumata bei Mäusen mit anschließendem Zwei-Photonen-Imaging. Diese Technik ermöglicht die Beobachtung von Zellverhalten in vivo und liefert wertvolle Einblicke für die Traumaforschung.

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Wir sind zutiefst dankbar, dass Dr. Frank Kirchhoff für die Bereitstellung von GFAP-EGFP und CX3CR1-EGFP Mausstämme. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Zentrum für internationale Mobilität von Finnland, Tekes, der finnischen Graduate School of Neuroscience (FGSN) und der Akademie von Finnland unterstützt.

Alle hier vorgestellten Verfahren wurden nach den örtlichen Leitlinien für die Tierpflege (Die finnische Gesetz über Tierversuche 62/2006) durchgeführt. Tier Lizenz (ESAVI/2857/04.10.03/2012) wurde von örtlichen Behörde (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA) erhalten. Erwachsene Mäuse von 1-3 Monaten Alter, Gewicht 24-38 g, wurden in Einzelkäfigen in der zertifizierten Universität Tierhaltung gehalten und mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt. 1. Brain Injury Imaging Durch eine Hirn Fenster <ol><li> Anästhesie Tiere und die Vorbereitung der Operationsfeld <ol><li> Betäuben Mäusen durch peritoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) und Xylazin (Rompun, 10 mg / kg) in filtersterilisiert Phosphatpuffersalzlösung (PBS), pH 7,4 gelöst. Überprüfen Reflexe der Maus die regelmäßig (Schwanz-und Zehen Prise Sonde), um die Narkosetiefe zu überprüfen. Erhöhen Sie die Dosis gegebenenfalls, um die ordnungsgemäße Betäubung erhalten, sondern Overd vermeidenose. </li><li> Aufrechterhaltung des Tieres bei 37,0 ° C mit einem Heizkissen bei chirurgischen Operation Bildgebungssitzung und der ersten Stunde nach dem Erwachen aus der Narkose. </li><li> Um die Augen der Maus vor dem Austrocknen zu schützen, gelten Auge Schmiermittel. </li><li> Verwalten Dexamethason (Rapidexon Tierarzt, 2 mg / kg) durch subkutane Injektion zu Entzündungen und Hirnödem reduzieren. </li><li> Schmerzstill (zB Ketoprophene intraperitoneal) bis zu 30 Minuten vor oder unmittelbar nach der Operation. Wenn das Tier zeigt keine Schmerzen Symptome, wie Zurückhaltung zu bewegen, zu essen oder zu trinken, oder Gewichtsverlust, Speichelfluss, Piloerektion oder abnormale Atemgeräusche nach der Operation, wiederholen Sie die Injektion von Analgetikum. </li><li> Rasieren Sie die Maus &#39;Kopf mit einem Schermaschine (siehe Materialien und Equipment). Vermeiden Sie Beschädigungen der Barthaare. </li><li> Behandeln Sie die Haut auf dem Kopf der Maus mit 70% Ethanol-Lösung zur Reinigung der rasierten Bereich. </li><li> Mit OP-Schere (siehe Materialien undEquipment) und Pinzetten (siehe Materialien und Equipment), schneiden Sie die Haut von der Mittellinie zwischen den Ohren an der Stirn. </li><li> Vorsichtig abkratzen das Bindegewebe mit einer stumpfen Klinge mikro auf den Schädel befestigt. </li><li> Schieben Haut Grenzen seitwärts und leicht in klanglicher Öffnungen des Schädels für Kopf und Haut Fixierung ziehen Ohr Bars. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit sterilem PBS und Behandlung der Operationsstelle am Kopf der Maus die mit 0,5% Chlorhexidindigluconat, dann trocknen die Schädeloberfläche mit einer Kombination von sterilen Wattestäbchen und Druckluft. </li></ol></li><li> Zufügung der Verletzung stechen <ol><li> Positionieren Sie ein kleines Tier stereotaktischen Instrument mit einem Tierhalter (siehe Materialien und Equipment). </li><li> Einstellen der Position des Binokular neben dem stereotaktischen Instrument auf der Oberfläche des Tierschädel konzentrieren. </li><li> Mit einem Binokular, suchen Sie die Bregma Punkt auf dem Schädel. </li><li> Identifizieren Sie die region von Interesse, wobei die stereotaktischen Koordinaten. HINWEIS: Vermeiden Sie die Bereiche von Interesse, die direkt über oberflächliche Rindengefäße befinden. Zerstörung dieser kann stark auf die Trauma Progression. </li><li> Positionieren Sie den 30 G Nadel über der gewählten Region und markieren Sie die Zielseite durch Kratzen der Schädeloberfläche. </li><li> Bohren Sie den Schädel mit allen möglichen Vorkehrungen, um unnötige Verbreiterung der betroffenen Knochenfläche zu vermeiden. Verwenden Sie einen High-Speed-chirurgische Bohrer (siehe Materialien und Equipment) unter dem Mikroskop. Stoppen bohren, wenn Flüssigkeit in das gebohrte Bereich angezeigt. </li><li> Berühren Sie den unteren Rand der gebohrt und mit der Nadel. </li><li> Tauchen die Nadel glatt in das Gehirn (Einfügungsgeschwindigkeit 5-10 mm / min), die der Tiefe von 0,5-2,0 mm entsprechend den Koordinaten der Schwanz an der Applikationsstelle. </li><li> Entfernen Sie die Nadel sofort nach Erreichen der gewünschten Tiefe (Rückzugsrate von 5-10 mm / min) und wischen das Blut nach dem Stich mit einem kleinen Tampon erscheinen (see Materialien und Ausrüstung). </li><li> Führen Sie die Mikroinjektion von 100 uM Sulforhodamin 101 oder eine andere Verbindung von Interesse in der Läsion unter Verwendung einer Mikropumpe (WPI) und 10 ul Hamilton-Spritze montieren mit Glaspipette. HINWEIS: Bei der Herstellung der Glaspipette aus Borosilikatglas Kapillare, schärfen die Spitze zu einem Durchmesser von 10-20 um. </li><li> Infuse 250-1,500 nl der Injektionslösung mit einer Geschwindigkeit von 5.2 nl / sec. HINWEIS: Lassen Sie die Pipette nach dem Ende der Infusion für mindestens 5 min in Hirnparenchym, entfernen Sie sie dann langsam und vorsichtig, um Lösung Abfluss zu verhindern. </li></ol></li><li> Kraniotomie für chronische Hirn Fenster <ol><li> Bohren Sie den Schädel sanft und vorsichtig, um einen Kreis Fenster um die verletzte Stelle zu machen. Verwenden Fenster Durchmesser von 3-3,5 mm. </li><li> Einen Tropfen Cortex-Puffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2 und 2 mM MgSO 4 in destilliertem H 2 O), um die wi deckenNDOW. </li><li> Platzieren Sie einen runden Deckglas (# 1.5 Dicke) auf der Schädelfenster. </li><li> Entfernen Sie den Überschuss der Kortex Puffer um das Deckglas. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Polyacryl-Kleber (siehe Materialien und Equipment). HINWEIS: Sicherstellen, dass der Klebstoff nicht an der oberen Oberfläche des Deckglases aufgebracht. Wenn das Deckglas mit Klebstoff verschmutzt, warten Sie, bis das Glas stabil auf den Schädel geklebt und der Kleber auf der Glasoberfläche trocken wird, dann vorsichtig die verunreinigenden Kleber mit einem Mikroklinge. </li><li> Warten Sie 5 Minuten, bis der Leim trocknen lassen. </li><li> Mit den Ohr Bar Höhe schrauben, passen Sie die Kopfposition, so dass der Metallhalterung platziert werden können. </li><li> Eine kleine Menge von Polyacryl-Kleber auf dem Ring der Stahlhalter (siehe Materialien und Equipment). </li><li> Kleben Sie den Ring der Stahlhalter an der Deckglas mit der Metallhalterung Handgriff nach hinten gerichtet. </li><li> Warten Sie 5 Minuten, bis der Leim trocknen lassen. </li><li> Mix Zahnzement (siehe Materialien und Ausrüstung) mit Polyacryl-Kleber in einem 3,5 cm-Petrischale (oder analog) zu zähflüssig Bedingungen zu erreichen. </li><li> Abdichtung der Ränder der Schädel Fenster mit dem Zement + Leim-Gemisch und der Abdeckung der freiliegenden Oberfläche des Schädels mit der gleichen Mischung auf die Haut Grenze. </li><li> Warten Sie 15 min bis der Zement + Leim-Gemisch trocknen lassen und dann entfernen Ohr Bars. </li><li> Führen Sie zwei-Photonen-Anregung mikroskopischen (TPEM)-Bildgebung für die Region von Interesse und einer Regelzone, wie es im Protokoll Nr. 3 beschrieben. </li><li> Nach der Bebilderung ermöglichen das Tier aus der Narkose auf einem Heizkissen erholen und halten Sie sie in einem individuellen Käfig unter Beobachtung bis zur vollständigen Genesung. Nassfutter gegeben, um Kau-und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern. </li></ol></li></ol> 2. Brain Injury Imaging Durch die ausgedünnten Schädel <ol><li> Anästhesierende Tiere und die Vorbereitung des Operationsfeldes <ol><li> Anesthetize die Maus und bereiten sie für die Trauma-Induktionwie in Schritt 1.1 beschrieben. </li></ol></li><li> Schädel Ausdünnung und Zufügung der Verletzung stechen <ol><li> Positionieren Sie ein kleines Tier stereotaktischen Instrument mit dem Tierhalter (siehe Materialien und Ausrüstung). </li><li> Einstellen der Position eines Binokular neben dem stereotaktischen Instrument auf dem Tierschädel Oberfläche zu fokussieren. </li><li> Suchen Sie die Bregma Punkt auf dem Schädel mit dem Binokular, identifizieren Sie den Bereich des Gehirns auf der Grundlage stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden, und markieren Sie ihn durch Kratzen. HINWEIS: Schädel Ausdünnung Position sollte nicht über oder in der Nähe Schädelnähte befinden, wie der Schädel Stabilität ist in diesen Gebieten gefährdet. Darüber hinaus sind große kortikale oder Hirnhautgefäße und Hirnhaut unterhalb der Schädelnähte liegt wahrscheinlich Bildartefakte verursachen. </li><li> Legen Sie die Metallhalterung mit Kleber über den Bereich von Interesse auf des Tieres Schädel beschichtet, mit leichtem Druck und 5 Minuten warten, bis die Metallhalterung ist fest mit dem Schädel geklebt. </li&gt; <li> Mix Zahnzement (siehe Materialien und Ausrüstung) mit Polyacryl-Kleber in einem 3,5 cm-Petrischale (oder analog) zu zähflüssig Bedingungen zu erreichen. </li><li> Verschließen Sie die Grenzen der Metallhalter mit dem Zement + Leim-Gemisch und decken die freigelegte Oberfläche des Schädels mit der gleichen Mischung bis auf die Haut Grenze. </li><li> Warten Sie 15 min bis der Zement-und Leim-Gemisch trocknen lassen. </li><li> Spülen des ausgedünnten Schädel-Region und den umgebenden Teilen des Metallhalters mehrere Male mit PBS, so dass die Reste der nicht polymerisierten Klebstoff weggewaschen. HINWEIS: Es ist entscheidend, um eine stabile Befestigung der Schädel auf den Halter zu gewährleisten. Dies ermöglicht die Herstellung Stabilität während der Bildgebung. </li><li> Mit dem hohen Vergrößerungsmodus des binokularen Mikroskop, entfernen oberen Schichten der Schädelknochen mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, einen ausgedünnten Schädel Bereich von ~ 0,5 bis 1,5 mm Durchmesser erstellen. Mit Druckluft beim Bohren der Knochenreste zu entfernen. Führen Sie die Bohrungen intermittently während der Durchforstung Verfahren, um reibungsbedingten Überhitzung zu vermeiden. Kühlen Sie den Bohrer mit der Lösung bei Raumtemperatur und Puffer regelmäßig gelten für den verdünnten Bereich, um Wärme zu absorbieren. HINWEIS: Um Schäden an der Rinde zu vermeiden, nicht über große Regionen zu bohren (&gt; 1,5 mm) bis auf eine dünne Schicht (&lt;50 um). HINWEIS: Das Nagetier Schädel Knochenstruktur besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen von einer dicken Schicht von spongiösen Knochen getrennt. Tiny Hohlräume der Spongiosa Form konzentrischer Kreise und Kanälchen, der Blutgefäße enthalten. Verwenden der Mikrobohrer, um sowohl die externe kompakten Knochenschicht und das meiste des schwammigen Schicht zu entfernen. Störung der Blutgefäße innerhalb des spongiösen Knochen kann zu Blutungen führen. Verwenden Hämostase Kollagenschwamm, diese Blutung zu stoppen. </li><li> Verwenden Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Bildgebung zu untersuchen, ob die Mehrheit der spongiösen Knochen entfernt wurde. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Verdünnung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die restlichen Knochen ist thFlimmern als 50 um in diesem Stadium der Herstellung. </li><li> Geben Sie einen Tropfen warmen Puffer (35-37 ° C) auf der Oberseite des verdünnten Bereich. Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Klinge oder Micro Finishing Bur weiter entfernen Knochenschichten und eine glatte Fläche von ~ 700 um im Durchmesser mit Knochendicke von ~ 20 um. In diesem Schritt ist es hilfreich, sich wiederholenden SHG Bildgebung durchführen und messen regelmäßig die Knochendicke. </li><li> Führen TPEM Bildgebung für die Region von Interesse und einer Regelzone. </li><li> Stellen Sie die Kopfposition mit den Ohr Bar Höhe Schrauben in einer Weise, die verdünnten Bereich ist streng horizontal angeordnet. Positionieren Sie die Nadel über dem ausgedünnten Region und stellen Sie sicher, dass es keine große Schiffe unter der Ziel-Website. </li><li> Einen Läsion durch Eintauchen der Nadel in das Gehirn, um die Tiefe von 0,5-2,0 mm aus verdünnten Schädeloberfläche und entsprechend den Koordinaten der Schwanz an der Applikationsstelle. </li><li> Entfernen Sie die Nadel und Blutungen unterdrücken nach t erscheinener akuten Hirnschädigung mit blutstillende Tampons (siehe Materialien und Ausrüstung). Warten Sie, bis Blutgerinnsel bilden und Gefäß Pulsation an der Verletzungsstelle anhält. </li><li> Führen Sie die Mikroinjektion von 100 uM Sulforhodamin 101 oder eine andere Verbindung von Interesse in der Läsion, wie in Abschnitt 1.2.10 beschrieben. </li><li> Führen TPEM Bildgebung, um die Schädigung Progression und Erholung zu überwachen, wie im Protokoll Nr. 3 beschrieben. </li><li> Nach der Abbildung, lassen Sie das Tier das Bewusstsein aus der Narkose auf einem Heizkissen wieder zu erlangen. Das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen und sie wieder in ihre Heimatkäfig erst nach vollständiger körperliche Erholung. </li></ol></li></ol> 3. Imaging <ol><li> Legen Sie das Tier unter dem Mikroskop durch das Anbringen der Metallhalterung auf den speziell angefertigten Rahmen. </li><li> Für die Bildgebung, verwenden Sie z. B. die FV1000MPE Zwei-Photonen-Mikroskop mit Mai Tai DeepSee Laser-und XLPLN 25X NA 1.05 Wasserimmersionsobjektiv für in vivo-Zwei-Photonen-optimiert sindImaging. </li><li> Identifizieren Sie die Läsion unter dem Mikroskop mit Weitfeld-Fluoreszenz-Modus. Verwenden Sie lange Passfilter zu Hirngefäßsystem zu visualisieren, und wählen Sie die Kontrollzone nach dem beobachteten Muster der Blutgefäße. </li><li> Um das Bild zu der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Signal, Abstimmung der Femtosekunden-Laser auf die 800 nm Wellenlänge und sammeln das emittierte Licht mit der 380-410 nm Bypass-Filter. Für Fluoreszenz-Imaging, verwenden Sie den Bandpassfilter (515-560 nm) emittiert Licht zu sammeln und die folgenden Wellenlängen verwendet werden, um die Fluoreszenz erregt: GFP-860 nm, 950 nm-YFP. </li><li> Verwenden FluoView Software für Bildaufnahme. </li><li> Shop-Koordinaten eines jeden ROI für nachfolgende wiederholende Bildgebung. Bild die gleiche ROIs im Laufe der Zeit und passen Koordinaten jedes Mal um das Bild zu Überschneidungen zu maximieren. </li><li> Analysieren Sie Bilder mit der entsprechenden Software (zB. ImageJ). Rekonstruktionen hier vorgestellt wurden mit Imaris Software. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hirn-Trauma ist eine plötzliche, unvorhersehbare Ereignis. Hier, das Tiermodell, die ein Spektrum von in menschlichen Patienten nach einer Hirnschädigung wie Neurodegeneration, die Beseitigung von Dendriten, Gehirn-Ödem, Glia-Narben, Blutungen in der Hirnrinde verbunden mit Brenn Subarachnoidalblutung und erhöhte Durchlässigkeit der beobachteten pathologischen Veränderungen reproduziert beschreiben wir Blut-Hirn-Schranke. Um Primär-und Sekundär Pathogenese, sowie Rückgewinnung nach dem Trauma zu untersuchen, wurde diese...

Akute Hirnverletzung ist eine bedeutende Problem der öffentlichen Gesundheit mit hoher Inzidenz von Verletzungen in Autounfälle, Stürze oder Überfällen und hohen Prävalenz von chronischen Folge Behinderung. Therapeutische Ansätze zur Behandlung von Hirnverletzungen bleiben völlig symptomatisch, wodurch die Effektivität der präklinischen, OP-und Intensivpflege Begrenzung. Das macht die sozialen und wirtschaftlichen Auswirkungen der Hirnschädigung besonders schwer. Aus einer Vielzahl von Gründen fehlgeschlagen meisten klinischen Studien zu einer Verbesserung der Erholung nach einer Hirnschädigung Verwendung neuer therapeutischer Ansätze zu demonstrieren. Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für eine Phase, in der Wirksamkeit von Medikamenten bei Patienten mit Hirnverletzungen vorhergesagt werden. Derzeit mehreren etablierten Tiermodellen von Kopfverletzungen vorhanden sind, einschließlich gesteuert kortikalen Auswirkungen ein, Fluid-Percussion-Verletzung 2, dynamische Verformung kortikalen 3, Gewicht-Drop4, 5 und Foto Verletzungen. Eine Reihe von experimentellen Modelle wurden verwendet, um bestimmte morphologische, molekulare und Verhaltensaspekte von Kopftrauma-assoziierten Pathologie zu studieren. Allerdings ist kein einziges Tiermodell bei der Validierung neuer therapeutischer Strategien ganz erfolgreich. Entwicklung von zuverlässigen, reproduzierbaren und kontrollierten Tiermodell der Gehirnverletzung notwendig ist, um die komplexen pathologischen Prozessen zu beurteilen. Die neuartige Kombination aus den neuesten mikroskopische Imaging-Technologien und genetisch kodierte Fluoreszenz Reporter bietet eine beispiellose Gelegenheit, um alle Phasen der Hirnschädigung, die primäre Verletzung sind, die Verbreitung der Primärverletzung, Sekundärschädigung und Regeneration zu untersuchen. Insbesondere ist in vivo Zweiphotonenmikroskopie eine eindeutige nicht-lineare optische Technologie, die Echtzeit-Visualisierung von zellulären und subzellulären Strukturen auch in tiefen kortikalen Schichten von Nagetier Gehirn ermöglicht. Verschiedene Arten von Zellen und orgaNelles können gleichzeitig durch die Kombination verschiedener Fluoreszenzmarker abgebildet werden. Mit diesem leistungsstarken Werkzeug können wir dynamische morphologische und funktionelle Veränderungen in lebenden Gehirn unter posttraumatischen Bedingungen zu visualisieren. Die Vorteile der in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie in das Studium Hirn-Verletzungen wurden vor kurzem von Kirov und Kollegen 6 demonstriert. Mit einem milden fokalen kortikalen Kontusion Modell zeigten diese Autoren, dass dendritische akuten Verletzung in der perikontusionelle Kortex wird durch den Rückgang der lokalen Blutfluss verknüpft. Außerdem zeigten sie, dass die metabolisch beeinträchtigt Kortex um die Quetschung Ort wird durch die Ausbreitung Depolarisation beschädigt. Diese Sekundärschaden betroffen synaptischen Schaltungen, so dass die Folgen von Schädel-Hirn-Verletzungen schwerer. Hier schlagen wir vor, die Methode der stereotaktischen stechen mit einer Spritzennadel, die bei gleichzeitiger Anwendung topischer Arzneimittel kombiniert werden könnte, als eine fortgeschrittene Modell für lokale GehirnVerletzungen und als Werkzeug zur pathophysiologischen Folgen von akutem Trauma im Gehirn von Säugetieren in vivo zu studieren.

<table><tbody><tr><td>2A-sa Dumb Pinzette, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; in Nadel</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>Tiertrimmer, Rasiermaschine</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Binokularmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Biologischer Temperaturregler mit Edelstahl-Heizkissen</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe mikrochirurgische Klinge</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatrohr mit Filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Für die Herstellung von Glaspipetten</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidindigluconat</td><td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Zahnzement</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Einmalbohrmaschinen</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco ' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ealing Mikroelektrodenabzieher</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Vertikalabzieher für die Herstellung von Glaspipetten</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Foredom Bohrersteuerung</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom Mikromotor-Handstück</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesieplattform für Mäuse</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>Montiert auf stereotaktischem Instrument</td></tr><tr><td>Hämostase Kollagenschwamm</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol Tierarzt</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metallhalter</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Abrichtzange, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>Mikrospritze zum Befüllen von Kapillaren</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Spritze 10 &mu; l</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton Spritze</td></tr><tr><td>Vliestupfer 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Chirurgische Tampons</td></tr><tr><td>Polyacrylkleber</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Rundes Glasdeckglas&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 Dicke&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument für Kleintiere</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting Adapter für Maus und Neugeborene Ratte</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Zusammengebaut auf stereotaktischem Instrument.</td></tr><tr><td>Student Irisschere, gerade 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin 101</td><td>Molekulare Sonden</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 Mikrospritzenpumpe und Micro 4 Mikrospritzenpumpe Controller</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>Mikroinjektor und Controller</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun Tierarzt</td><td></td></tr></tbody></table>

akute brain trauma in mäusen gefolgt durch längs zwei-photonen-imaging

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Obwohl akute Hirntrauma führt oft von Kopf Schäden in verschiedenen Unfällen und betrifft einen wesentlichen Anteil der Bevölkerung, gibt es keine wirksame Behandlung für die es noch nicht. Einschränkungen der derzeit verwendeten Tiermodelle behindern Verständnis der Pathologie-Mechanismus. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht das Studium Zellen und Gewebe im intakten Tier Gehirne in Längsrichtung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir zwei Modellen der akuten Hirnverletzung untersucht mittels Zwei-Photonen-Bildgebung von Hirnzellverhalten bei posttraumatischen Zuständen. Eine ausgewählte Hirnregion ist mit einer scharfen Nadel, um ein Trauma einer kontrollierten Breite und Tiefe in das Hirnparenchym erzeugen verletzt. Unsere Methode verwendet stereotaktischen stechen mit einer Spritzennadel, die bei gleichzeitiger Anwendung Drogen kombiniert werden können. Wir schlagen vor, dass diese Methode kann als erweitertes Tool zur zellulären Mechanismen der pathophysiologischen Folgen eines akuten Traumas im Gehirn von Säugetieren zu untersuchen <em&gt; In vivo. In diesem Video kombinieren wir akuten Hirnschädigung mit zwei Präparaten: Schädelfenster und Schädel Verdünnung. Wir diskutieren auch Vorteile und Grenzen der beiden Präparate für Multisession-Bildgebung von Hirnregeneration nach Trauma.

1) chronische Hirn Fenster und 2) Schädel Ausdünnung, für posttraumatische Gehirnbildgebung in transgenen Mäusen: Wir haben zwei Betriebsabläufe optimiert. Schematische Darstellung der Versuchspräparate ist in Fig. 1 dargestellt. Traumatische stechen durch Stahlnadel von 0,3 mm Außendurchmesser (30 G) an den Bohrbrunnen (Abbildung 1A) aufgebracht. Eine erfolgreiche Vorbereitung Schädelfenster ermöglicht die Abbildung in Tiefen bis zu 650 um unter der Pia-Oberfläche (Abbildung 1B...

Akute Hirn-Trauma ist eine schwere Verletzung, die keine angemessene Behandlung bis heute hat. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht Studium in Längsrichtung den Prozess der akuten Hirntrauma Entwicklung und Untersuchung therapeutische Strategien bei Nagern. Zwei Modelle des akuten Hirn-Trauma untersucht mit in vivo Zwei-Photonen-Imaging von Gehirn werden in diesem Protokoll demonstriert.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Hallo, ich bin Michel iv, ein Postdoktorand am Neurowissenschaftszentrum der Universität Helsinki. Hallo, ich bin Hel Stein, eine Doktorandin an der Universität Helsinki. In diesem Video beschreiben wir eine Methode zur Applikation eines lokalen akuten Traumas auf das Maushirn zur anschließenden Bildgebung des Verhaltens von Gehirnzellen und der posttraumatischen Bedingungen mittels Lichtmikroskopie.Ein akutes Hirntrauma ist eine schwere Pathologie, die einen erheblichen Teil der Bevölkerung in Industrieländern betrifft. Die Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht die Untersuchung von Zellen im Gewebekontext im lebenden Nagetierhirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung eines akuten Hirntraumas durch einen stereotaktischen Einstich mit einer Spritzennadel, gefolgt von einer Zwei-Photonen-Bildgebung des Verhaltens von Hirnzellen und der posttraumatischen Bedingungen.Die Methode der stereotaktischen Verursachung einer lokalen Gehirnverletzung ist ein Werkzeug, um die pathophysiologischen Folgen eines akuten Traumas zu untersuchen. Im Säugetiergehirn kann ein bestimmter Hirnbereich gezielt mit einer scharfen Nadel verletzt werden, um ein Trauma gewünschter Breite und Tiefe im Gehirnparenchym zu erzeugen. In diesem Video verwenden wir eine akute Hirnverletzung in Kombination mit einem Kranielfenster oder einer Schädelverdünnung, gefolgt von einer Zwei-Photonen-Bildgebung von Neuronen und Gliazellen im traumatisierten Gehirn.Alle hier vorgestellten Experimente werden gemäß den Vorschriften der Universität Helsinki für Tierversuche durchgeführt; die Maus wird durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin und Zine anästhesiert. Ein Hautstück wird entfernt, um den Schädel freizulegen, und das Tier wird anschließend mithilfe von Ohrstangen auf dem beheizbaren Tisch, der mit dem stereotaktischen Manipulator verbunden ist, fixiert. Eine Spritze mit einer Stahlkanüle mit einem Durchmesser von 0,3 Millimetern wird an der Mikroinjektionsvorrichtung befestigt.Die Mikroinjektionsanlage ermöglicht es uns, mit einem Binokularmikroskop einen gezielten traumatischen Einstich in einen definierten Bereich des Gehirns durchzuführen. Dazu lokalisieren wir den Bregmapunkt am Schädel. Mithilfe stereotaktischer Koordinaten bestimmen wir den interessierenden Bereich. An der markierten Stelle bohren wir vorsichtig und behutsam mit einem chirurgischen Hochgeschwindigkeitsbohrer in den Schädel. Wir führen den Stich in das gebohrte Bohrloch ein und tauchen die Nadel kurz für 0,5 bis zwei Millimeter tief in das Gehirn ein, ausgehend von der Ebene des Bodens des Bohrlochs. Ein bemerkenswerter Vorteil dieser Methode besteht darin, dass wir DI oder Wirkstoffe in dasselbe kleine Bohrloch injizieren können und somit Lösungen gezielt an die Verletzungsstelle abgeben können. Zur Applikation von Lösungen in die Großhirnrinde verwenden wir einen Mikroinjektor mit elektronischer Steuerung und einer 10-Mikroliter-Spritze, die an einen stereotaktischen Manipulator angeschlossen ist.Wenn die Spitze der Glaspipette die Oberfläche des Gehirns berührt, tauchen wir sie um 0,5 bis einen Millimeter tiefer ein. Anschließend injizieren wir mithilfe des Mikroinjektor-Controllers 0,5 bis zwei Mikroliter der D- oder Wirkstofflösung in das Gehirn mit einer Geschwindigkeit von fünf Nanolitern pro Sekunde. Danach wird vorsichtig um die Verletzungsstelle herum gebohrt und das runde Knochenteil entfernt.Die Gehirnoberfläche wird mit einem Kortexpuffer gespült und ein dünner runder Deckel wird auf die Schädelfensteröffnung gelegt. Der Deckel wird mit Polyacrylamidkleber versiegelt und der Stahlhalter wird darauf geklebt. Um eine feste Befestigung des Schädelfensters am Schädel sicherzustellen, wird Zahnzement rund um den Halter angebracht.Die anästhesierte Maus wird am Zwei-Photonen-Mikroskop befestigt, und die Zellen werden am Verletzungsort im lebenden Gehirn abgebildet. Dieses Bild wurde drei Stunden nach der Hirnverletzung aufgenommen. Der Verletzungsort ist im Gehirn einer transgenen Maus dargestellt, die in Astrozyten unter dem GFAP-Promotor GFP exprimiert.Neben den grün fluoreszierenden, GFP-exprimierenden Astrozyten färben viele Astrozytenzellen rot durch die Injektion von Sulforhodamin 101. Die weißen Fasern stellen das Signal der zweiten harmonischen Erzeugung dar und visualisieren vermutlich die Faserstrukturen in der extrazellulären Matrix. Die zweite harmonische Erzeugung erweist sich als wertvolles Hilfsmittel zur Abgrenzung der Verletzungsstelle.Das Signal wird von nicht zentral-symmetrischen Strukturen wie Proteinfasern emittiert und erfordert keine exogene Anfärbung. Das Signal der zweiten harmonischen Erzeugung ist an der Gehirnoberfläche am intensivsten und dringt nicht tief in das Gehirnparenchym ein. In diesem Bild ist die Ansammlung aktivierter Mikroglia an der Verletzungsstelle zu erkennen.Die Mikrogliazellen sind grün dargestellt und die Erzeugung des zweiten harmonischen Signals erscheint in Grau. In der Nähe der Verletzungsstelle weisen aktivierte Mikrogliazellen eine charakteristische Morphologie mit wenigen verzweigten Fortsätzen auf, während die Schädeloberfläche präpariert wird. Verwenden Sie stereotaktische Koordinaten, um das zu bildgebende Hirnareal zu lokalisieren, und markieren Sie es mit einem Stift.Vermeiden Sie Interessenbereiche, die sich direkt über den Schädelhalterungen befinden, da der Schädel in diesen Bereichen weniger stabil ist und da die darunterliegenden großen Gefäße in den Hirnhäuten die Bildqualität beeinträchtigen würden. Platzieren Sie die mit Klebstoff gekennzeichnete Schädelhalterung durch leichtes Andrücken auf dem gewünschten Bereich des Schädels des Tieres. Anschließend wird Zement um die Halterung gegeben und etwa fünf Minuten gewartet, bis die Schädelhalterung fest am Schädel befestigt ist.Spülen Sie die Öffnung des Schädelhalters mehrmals mit PBS, um den restlichen, nicht polymerisierten Klebstoff zu entfernen. Dünner unter einem Binokularmikroskop einen kreisförmigen Bereich des Schädels, typischerweise 0,5 bis 1,5 Millimeter im Durchmesser, über der interessierenden Region. Der Mausschädel besteht aus zwei dünnen Schichten von Kompaktknochen und einer dazwischenliegenden dicken Schicht von Spongiosa. Der schwammige Knochen enthält winzige Hohlräume, die in konzentrischen Kreisen angeordnet sind, sowie zahlreiche Kanälchen, die Blutgefäße enthalten. Während des Ausdrehens wird die äußere Schicht aus kompaktem Knochen und der größte Teil des schwammigen Knochens entfernt. Unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrers Druckluft beim Bohren einsetzen, um Knochenpartikel wegzublasen. Das Bohren intermittierend durchführen, um eine durch Reibung verursachte Überhitzung des Knochens zu vermeiden.Kühlen Sie den langweiligen Teil in der Flüssigkeit, der bei Raumtemperatur gehalten wird, und tragen Sie regelmäßig den Cortexpuffer auf den Ausdünnungsbereich auf, um die Wärmeentwicklung zu beobachten. Während des Ausdünnungsvorgangs kann es zu Blutungen aus den Gefäßen kommen, die durch den schwammigen Knochen verlaufen. Diese Blutungen hören normalerweise innerhalb weniger Minuten von selbst auf.Verwenden Sie die Abbildung mittels zweiter Harmonischer Erzeugung, um sicherzustellen, dass der Großteil des schwammigen Knochengewebes entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Schädeldicke noch mindestens 50 Mikrometer betragen. Tauchen Sie den Schädel in einen Tropfen Cortex-Puffer ein und setzen Sie das Dünnschliffverfahren fort, indem Sie eine mikrochirurgische Klinge oder einen mikrofeinen Fräser verwenden, um im Endstadium des Dünnschliffprozesses eine sehr dünne und glatte Präparation mit einer Dicke von etwa 20 Mikrometern und einem Durchmesser von 700 Mikrometern herzustellen. Untersuchen Sie die Präparation dabei wiederholt mittels zweiter Harmonischer Erzeugung.Der gewählte Bereich kann vor und nach der Verletzungsinduktion abgebildet werden. Es sollten mehrere verschiedene Bereiche des dünnen Bereichs abgebildet werden, um mögliche, durch die Operation verursachte Artefakte für die Traumainduktion auszuschließen. Positionieren Sie die Nadel über dem dünnen Bereich.Stellen Sie sicher, dass sich keine größeren Gefäße darunter befinden. Tauchen Sie die Nadel entsprechend den Koordinaten der Einstichstelle 0,5 bis zwei Millimeter in das Gehirn ein. Entfernen Sie die Nadel und unterdrücken Sie eine nach der akuten Hirnverletzung auftretende Blutung. Mit einem hämostatischen Tampon warten, bis Blutgerinnsel gebildet sind und die Pulsation an der Verletzungsstelle nachlässt. Lösungen, die beispielsweise Schwefelrumine 1 0 1 oder andere Farbstoffe enthalten, können auf die gleiche Weise wie oben bei der Herstellung des Schädel-Fensters gezeigt in die Verletzungsöffnung injiziert werden. Im Gegensatz zum Schädel-Fenster bei der Schädelverdünnungspräparation kann die Verletzungsstelle wiederholt für die Applikation von Wirkstoffen und Farbstoffen zugänglich gemacht werden.Die Aufrechterhaltung der Sterilität bei allen Eingriffen trägt dazu bei, den ausgedünnten Bereich transparent zu halten, indem Entzündungen verhindert werden. Hier sehen Sie die Verletzungsstelle nach der Schädelknochenausdünnung abgebildet. Auf dem linken Bild ist die Verletzungsseite erkennbar, die 20 Minuten nach dem Trauma von mit YFP markierten Dendriten kortikaler Neuronen umgeben ist.Die rechte Aufnahme zeigt denselben Bereich des Gehirns beim selben Tier fünf Tage nach dem Trauma. In diesem Bild sehen Sie ein weiteres Beispiel der zweiphotonenmikroskopischen Bildgebung des Gehirns. Nach dem Ausschleifen des Schädels kann der Knochen über das Signal der zweiten harmonischen Generation, dargestellt in Grau, sichtbar gemacht werden.Im linken Panel sind die Mikroglia grün dargestellt. In diesem experimentellen Aufbau können die Mikroglia unter dem Knochen um die Verletzungsstelle herum beobachtet werden, wie im rechten Panel gezeigt. In der vorliegenden Studie verwendeten wir sowohl die chronische Schädelkammer als auch die Präparation mit dünnerem Schädelknochen, um das Zellverhalten unter posttraumatischen Bedingungen im lebenden Gehirn zu untersuchen.Beide Methoden weisen bestimmte Vorteile und Einschränkungen auf. Das chronische Schädelwindow bietet eine bessere Auflösung, tiefere Penetration in das Gehirngewebe und die Möglichkeit mehrerer Bildgebungssitzungen. Andererseits ist bei der Schädeldünnung die Wahrscheinlichkeit geringer, dass eine Entzündung am Bildgebungsort ausgelöst wird, und es können wiederholt Wirkstoffe und Farbstoffe appliziert werden.

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Forschung

JoVE Journal

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Medizin

In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die...

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Dieses Video zeigt die Verabreichung von traumatischen Hirnverletzungen (TBI) bei Mäusen. Nach der Freilegung des Schädels wird die SHT-Stelle markiert. Die Maus wird dann unter dem TBI-Gerät positioniert. Der Aufprall wird abgegeben, indem der Metallstab angehoben wird und er frei auf den Schlagkörper fallen kann, der in Kontakt mit dem Schädel steht.

Abgabe eines Schädel-Hirn-Traumas an ein Mäusegehirn

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Athleten absorbieren mehrere hundert milde traumatische Hirnverletzungen (mTBI) / Gehirnerschütterungen jedes Jahr; Die Konsequenz dieser auf das Gehirn ist jedoch schlecht verstanden. Daher bietet ein Tiermodell von Einzel- und Wiederholungs-MTBI, das konsequent repliziert klinisch relevante Symptome bietet die Mittel, um die Studie von MTBI und Gehirnerschütterung voranzutreiben.

Ein Mausmodell der einzelnen und repetitiven milden traumatischen Gehirnverletzung

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Das Protokoll beschreibt ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma in einem Mausmodell. Insbesondere wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Induktion einer leichten Mittellinien-geschlossenen Kopfverletzung und die Charakterisierung des Tiermodells vollständig erläutert.

Elektromagnetisch gesteuertes Closed-Head-Modell für leichtes Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Pseudofracture, eine reproduzierbare Mausmodell der sterile Muskel-Skelett-Verletzungen, können zur Beurteilung der späten Begriff posttraumatische Immunantwort. Dieser Artikel beschreibt die verfahrensrechtlichen Ausführung des Modells Schritt für Schritt, einschließlich des Potenzials für experimentelles Modell Kombinationen Studie Polytrauma ermöglichen.

Pseudofracture: eine akute periphere Gewebe Trauma-Modell

Erfahren Sie eine Methode zur Induktion akuter Hirntraumata bei Mäusen mit anschließendem Zwei-Photonen-Imaging. Diese Technik ermöglicht die Beobachtung von Zellverhalten in vivo und liefert wertvolle Einblicke für die Traumaforschung.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

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