In ovo Elektroporation von Hühnerembryonen

Die Elektroporation ist ein Verfahren, das benutzt wird, um fremdes genetisches Material in Zellen einzufügen. Die Elektroporation von Hühnerembryos in dem Ei, auch in ovo Elektroporation genannt, ist ein wertvolles Werkzeug für Entwicklungsbiologen, da die Ablieferung von genetischem Material direkt in spezifische Gewebe lokalisiert werden und zu spezifischen Zeitpunkten erfolgen kann.  Dieses Video führt die grundlegenden Prinzipien der in ovo Elektroporation ein, beschreibt die wesentlichen Schritte dieses Verfahrens, und erklärt wie die Methode benutzt werden kann, um biologische Prozesse in der Entwicklung zu untersuchen.

Am Anfang wiederholen wir die grundlegenden Prinzipien der Elektroporation, um herauszufinden wie dieses Verfahren für das Einfügen von DNA in eine Zelle benutzt werden kann.

Zuerst benutzt man die Mikroinjektion, um die DNA in der Nähe von einer Zelle von Interesse abzuliefern. Die DNA kann die Plasmamembran jedoch nicht durchdringen, um in die Zelle hinein zu gelangen.

Um dieses Problem zu lösen, verwendet man einen elektrischen Strom, der die Stabilität der Membran zerstört, wodurch Poren entstehen. Eine zweite Folge dieses elektrischen Feldes ist die Wanderung der negativ geladenen DNA hin zu der positiven Elektrode. Als Ergebnis werden nur Zellen auf der Seite der Injektionsstelle, die näher an der positiven Elektrode liegen, mit der DNA transfiziert.

Nun dass ihr die grundlegenden Prinzipien versteht, sprechen wir darüber, wie man Embryos für die Elektroporation vorbereitet. Wenn man Embryos verwendet, die älter als das Hamburger-Hamilton Stadium 20 sind, ist es besser die Küken außerhalb der Schale, oder ex ovo, zu kultivieren, um besseren Zugriff auf die Gewebe zu erhalten. Dieses Video konzentriert sich auf die Elektroporationen von Embryos im Frühstadium, die sich in der Schale, also in ovo, entwickeln.

Um anzufangen sollten die Eier in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C inkubiert werden, bis sie die gewünschte Entwicklungsstufe erreicht haben. Während die Eier im Inkubator sind, bereitet man die Ausrüstung für die Elektroporation und die Injektion vor. Zuerst stellt man Kapillarnadeln durch das Ziehen einer 0.5 mm Glaspipette mit einem Pipettenzieher her. Um die Pipette zu öffnen, platziert man sie unter dem Mikroskop und bricht ein kleines Stück der Spitze ab. Danach bereitet man die Injektionslösung vor, welche die angemessene Verdünnung des Konstrukts und einen Farbstoff, um die Injektionslösung zu visualisieren, enthalten sollte.

Um die Bewegung der Flüssigkeit in der Nadel zu kontrollieren, befestigt man diese an einer durch den Menschen gesteuerte Mundpipette. Alternativ kann die Nadel auch in einen Mikroinjektor geladen werden, welcher verstellbare Luftdruckpulse zur Verfügung stellt. Man füllt die Nadel indem man die Spitze in die Injektionslösung hält und negativen Druck erzeugt.

Zusätzlich zu den Nadeln braucht man auch noch die Elektroden. Diese bestehen aus zwei freiliegenden Drähten, die mit einem Adapter zusammen gehalten werden. Ein Paar Kabel verbinden die Elektroden mir dem Elektropulsgenerator, oder dem Elektroporator, welcher die Pulslänge, die Frequenz und die Spannung kontrolliert. Für die Freihandbedienung kann der Elektroporator auch mit einem Fußpedal aktiviert werden.

Wenn die Eier bereit sind, schneidet man ein Fenster in die Schale und gibt ein paar Tropfen von physiologischer Salzlösung, wie zum Beispiel Hanks, hinzu, um zu vermeiden, dass der Embryo austrocknet. Unter dem Mikroskop platziert man das Ei so, dass das Gewebe von Interesse mit der Nadel erreichbar ist. Dann durchsticht man den Embryo mit der Kapillarnadel und liefert die Lösung unter Anwendung von leichtem Druck ab.

Nun dass wir das Konstrukt injiziert haben, ist es an der Zeit die Elektroporation auszuführen. Man positioniert die Elektroden so, dass sie in die Hank’s Lösung eingetaucht sind und das Gewebe von Interesse zwischen ihnen zentriert ist. Um den elektrischen Strom zu erzeugen, drückt man auf das Fußpedal und schaut nach Blasen, die sich um die Elektroden herum bilden.

Wenn die Elektroporation abgeschlossen ist, entfernt man die Elektroden von dem Embryo und wischt sie mit 70% Ethanol ab. Man gibt ein paar Tropfen der Salzlösung mit zugesetztem Antibiotikum hinzu, um eine Entzündung zu verhindern, und versiegelt das Fenster mit Klebeband. Zum Schluss legt man die Eier vor der Phänotypanalyse zurück in den Inkubator damit sich die Embryos weiter entwickeln.

Nun dass wir alles über die in ovo Elektroporation gelernt haben, schauen wir uns einige Beispiel an, wie Forscher dieses Verfahren in der Entwicklungsforschung anwenden.

Als erstes kann die Elektroporation verwendet werden, um die Genexpression durch die Ablieferung von „knockdown“ Konstrukten, abzuschalten. In diesem Beispiel wurden Zellen des sich entwickelnden Neuronalrohrs mit Genabschaltkonstrukten elektroporiert. Die Embryos konnten sich dann weiter entwickeln, und die Axonbewegungsbahnen wurden zwischen normalen und abgeschalteten Proben verglichen, um die genetische Kontrolle des Axonenwachstums zu untersuchen.

Auf der anderen Seite kann die in ovo Elektroporation auch benutzt werden, um ein Protein in einer Untermenge von Zellen zu exprimieren, indem man ein Plasmid mit einem proteinkodierenden Gen und einem Promoter, also einer Sequenz, an die sich die RNA polymerase bindet, um die Transkription zu beginnen, einfügt. Hier fügen Forscher ein einzelnes Gen in Zellen des embryonalen Hirns ein. Die Gewebefärbung, durch welche das Proteinprodukt dieses Gens nachgewiesen werden kann, und Marker von spezifischen neuronalen Subpopulationen zeigen, dass das elektroporierte Gen die neuronale Entwicklung verändert.

DNA Konstrukte, die für fluoreszente Proteine kodieren, können auch mittels der Elektroporation eingefügt werden, um die Zellen und Strukturen in der Entwicklung zu visualisieren. Das ermöglicht die Echtzeitabbildung von komplexen Prozessen, wie zum Beispiel der Entwicklung des Rückenmarks, wodurch man neue Einblicke in die Dynamik der Zellbewegungen mit der Zeit erreichen kann.

Das war die Einführung in die in ovo Elektroporation von JoVE, welche eine nützliche Methode ist, um genetisches Material in Küken abzuliefern. Dieses Video behandelte die grundlegenden Prinzipien der Elektroporation, die Schritte, welche nötig sind, um Küken zu injizieren und zu elektroporieren, und einige Anwendungen dieses Verfahrens in der aktuellen Entwicklungsforschung. Danke für eure Aufmerksamkeit.