Name: Automatisierte Analyse von dynamischen Ca 2 + Signale in Bildsequenzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte ROI-Analyse zur Untersuchung endothelialer Calciumaktivität in Schweinekoronararterien. Diese Methode ermöglicht schnellere, umfassendere und weniger fehleranfällige Ergebnisse als manuelle Verfahren.

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Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Institutes of Health unterstützt Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 und MOP-93676.

1. Fahrzeug Dissection und Imaging <ol><li> Ernte-Gewebe aus heimischen Jugend Schweine wie in Martens et al 27 beschrieben. Zeigen geerntet Schweine rechten Herzkammer in ein Polydimethylsiloxan (PDMS) unten Dissektion Schale mit HEPES-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PSS). <ol><li> Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sezieren und entfernen ein Segment des linken vorderen absteigenden Koronararterie (~ 8 mm Länge, 0,5 mm Durchmesser) vom umgebenden Gewebe mit einer Pinzette und Schere Frühjahr durch die Gefäßsegment Entfernen aus den umliegenden Herzgewebeschichten. HINWEIS: Achten Sie auf die Gefäßwand nicht durchstechen. </li><li> Legen Sie ein PDMS-Block (1 x 0,5 x 0,5 cm) in die Dissektion Gericht, und verwenden Sie eine Nadel, um es auf den Boden zu fixieren. Schneiden Sie ein etwa 40 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht in zwölf ~ 0,3 cm lange Segmente bilden Mikropins, und diese in die Schüssel. Mit einer Pinzette, sichern eine Ende des Gefäßsegments zu dem Block mit einem micropin. </li><li> Kleine Feder Schere vorsichtig in das Gefäßlumen und längs geschnitten auf einer Seite des Schiffes, um es vollständig zu öffnen. Richten Sie die geöffnet Gefäßsegment mit dem Endothel auf. </li><li> Verwenden Sie die restlichen Mikropins, um die Grenzen des geöffneten Gefäßsegment zu sichern, um zu blockieren, so dass das Schiff bildet ein flaches Rechteck. HINWEIS: Mikropinlösung Spitzen sollten bis 90 ° gebogen und bündig mit der Blockoberfläche eingesetzt werden. Es sollte darauf geachtet werden, um das Schiff Zubereitung ohne Überdehnung strecken; endgültige Breite sollte ~ 1,5 Mal die Start ungedehnten Breite werden. </li><li> Bereiten ein kleines Volumen (ca. 1 ml) von Fluo-4.00 Beladungslösung durch Mischen von Fluo-4 AM (10 &amp;mgr; M), gelöst in DMSO mit Pluronic (0,03%) in einer HEPES-gepufferten PSS (enthaltend in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 Glucose) und stecken Sie den ganzen Block in die Ladelösung für etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. </li><li> Nach dem Laden, waschen Sie den Block in HEPES gepuffertPSS für 5-10 min. </li><li> Montieren Sie den Block auf 50-100 um dicken Abstandshalter in einem Deckglas untere Kammer enthält HEPES gepuffert PSS. HINWEIS: Metallstifte können als Abstandhalter verwendet werden, und sicherzustellen, dass das Gefäßsegment nach unten und in die Abstandshalter nicht berühren. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf der Stufe eines inversen Mikroskops für die konfokale Bildgebung ausgestattet ist, und sich auf die endotheliale Zellschicht. </li><li> Capture-Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen der basalen relativen Fluoreszenz für ~ 3 min bei 20-facher Vergrößerung und einer Bildrate von ~ 8 Bilder pro Sekunde mit der konfokalen Bildsequenzerfassung Software. </li><li> Nach ca. 3 Min. Aufzeichnungs basale Fluoreszenz, ersetzen HEPES gepuffert PSS-Lösung mit dem gleichen Volumen (~ 1 ml) von Substanz P (100 pM) in HEPES gepuffert PSS und Rekord für eine addtional 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Automatisierte Analyse <ol><li> Render-Bild-Sequenz (en) von fluoreszierenden Kalzium-Aktivität aus konfokalen Erfassungssoftware als 8-Bit-, grayscale. &quot;tif&quot;-Format-Dateien ohne angelegte Informations. </li><li> Offene ImageJ, klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot; im Datei-Menü, und wählen Sie die entsprechende Bildsequenz in der Explorer-Fenster, um die Bildsequenz (en) in ImageJ anzuzeigen. </li><li> Bestimmen Sie einen entsprechenden ROI Durchmesser mit Hilfe der rechteckige ROI-Tool, um die oberen und unteren Grenzen der räumlichen Ausbreitung der Aktivität innerhalb der Bildsequenz (en) zu schätzen. HINWEIS: Die mittlere rechteckige Durchmesser ist die richtige Wahl für ROI Durchmesser. </li><li> Erstellen Sie einen neuen Ordner auf der Festplatte des Computers, und fügen Sie die Bildsequenz (en) in den Ordner-Verzeichnis. </li><li> In ImageJ, klicken Sie auf das Fenster &quot;Plugins&quot;, dann klicken Sie auf &quot;LC_Pro &#39;, um die Analyse zu starten. </li><li> Geben Sie den Durchmesserwert ROI und wählen Sie den Filter Schwellenwert (entweder 0,05 oder 0,01). </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Drogenbehandlung&quot; Kästchen und unmittelbar vor und nach der Droge wurde hinzugefügt (in Sekunden) in die Zeitpunktwerte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, undgeben Sie die Bildsequenz-Verzeichnis in den Datei-Explorer-Fenster. </li></ol> 3. Grafische Ausgabe <ol><li> Laden R-Version 3.0.2 von <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Öffnen Sie die 32-Bit-Version von R. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;Open Skript&quot; und wählen Sie die &#39;traceplot.R &quot;R-Skript zur Erzeugung grafischer Versuchsberichte. </li><li> Installieren Sie die Kalibrierung, und gplots Pakete mit &#39;Pakete&#39;, &#39;Installieren von Paketen &quot;, und die Auswahl der zweckdienlichen Pakete. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;change directory&quot;-Befehl, und verwenden Sie das Explorer-Fenster auf das Verzeichnis, das auf die Analyse LC_Pro Ausgang entspricht wählen. </li><li> Klicken Sie auf das Skript-Fenster und dann die &#39;laufen alle &quot;zu befehlen, das Skript auszuführen. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Entschlüsselung komplexer Ca 2 +-Signale auf zellulärer Ebene und mehrzelligen strengen experimentellen und analytischen Ansätze erfordern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, bei dem zeitaufgelöste konfokale Bildsequenzen von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz an einer automatisierten Analyse identifiziert und quantifiziert statistisch relevanten Ca2 +-Signale in intakten Zellfelder Im speziellen Fall dargestellt unterworfen, wurde isoliert eine Arterie Segment aus Schweineherz, merken geöf...

Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül second messenger und zytosolischen Ca 2 +-Spiegel sind stark reguliert. Die intrazelluläre Ca2 +-Signale sind komplex und umfassen isolierten Transienten, Schwingungen, Wellen-und Pflanzgut 1-4. Räumliche und zeitliche Steuerung von Ca 2 + wird gedacht, um physiologische Signal Spezifität zugrunde liegen und damit die Analyse von Ca 2 +-Signalmuster ist von großem Interesse für die Ermittler in mehreren Feldern fünf. Ca 2 +-Indikator-Farbstoffe, wie Fluo-4 und Fura-2 werden üblicherweise verwendet, um intrazelluläre Ca 2 +-Signale mit Fluoreszenzmikroskopie 5-12 messen. 16 - typischerweise werden zeitliche Ca 2 +-Signale als zeitabhängige Änderung der mittleren Fluoreszenz innerhalb einer benutzerdefinierten Bereich oder Region von Interesse (ROI) 5,6,13 ausgewertet. Derzeit ist die manuelle ROI-Analyse sowohl zeitaufwendig und arbeits inSpannender, weil es erfordert, dass Benutzer viele ROIs identifizieren und sich wiederholende Berechnungen 17-19. Diese Techniken können auch mit erheblichen Benutzerfehler, einschließlich Einführung der künstlichen Signalarten und den Ausschluss von niedriger Amplitude oder diffuse Signale 18,20. Automatisierte ROI Erkennungsalgorithmen sind zuvor unter Verwendung einer Vielzahl von statistischen Methoden, um eine optimale Platzierung ROI ermitteln implementiert worden, aber sie haben im Allgemeinen eine Analyse der Zeilen oder Pseudo-Zeilenbilder, die Analyse auf eine einzige räumliche Dimension in der Zeit 17 begrenzt begrenzt, 19-22. Darüber hinaus sind viele bestehende Algorithmen nicht aus, um die Vielfalt der Ca 2 +-Freisetzung aus Ereignissen, die periodisch, lokalisierten Transienten ausbreitende Wellen 23,24 Bereich umfassen. Umfassende Bewertung der physiologischen Ca2 +-Signale wird oft durch die Anwesenheit von signifikanten Bild Artif komplizierthandeln, dass verwechselt Signal-Rausch-Diskriminierung in vielen experimentellen Systemen. Zuvor eine automatisierte ROI-Erkennungsalgorithmus Lösung Ca 2 +-Signal Transientenerkennung, als Plugin für NIH ImageJ Software implementiert (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wurde entwickelt und validiert 25,26. Dieser Algorithmus, genannt LC_Pro, wurde entwickelt, um zu erkennen und zu analysieren ROIs umfassenden Ca 2 +-Signal-Transienten in zweidimensionalen Zeitraffer-Bildsequenzen. Hier eine praktische Versuchsprotokoll und repräsentative Demonstration einer Anwendung des Algorithmus in Schweineherzkranzarterie Endothel vorgesehen ist, mit zusätzlichen Postprocessing mit der Open-Source-Software R statistische Verarbeitung zu brauchbaren grafischen Ausgabe zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Sezierschale</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>Elastomer-Kit, muss in Schalen eingegossen werden</td></tr><tr><td>HEPES-gepuffert PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES säure</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>AM Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Metallstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas-Bodenkammer</td><td></td><td></td><td>Speziell entwickeltes</td></tr><tr><td>konfokales Spinning-Disc-Mikroskop</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download bei: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro Plugin für imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download unter: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">download unter: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">download unter: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

automatisierte analyse von dynamischen ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; signale in bildsequenzen

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intrazelluläre Ca 2 +-Signale sind allgemein mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe, und Mikroskopie-Techniken untersucht. Ist die quantitative Analyse von Ca 2 +-Bilddaten jedoch zeitaufwendig und je nach Vorspannung. Automatisierte Signalanalyse-Algorithmen basieren auf Region von Interesse (ROI) Detektion wurden für eindimensionale Zeilen Messungen durchgeführt worden, aber es gibt keine aktuelle Algorithmus optimiert die Identifizierung und Analyse von ROIs in zweidimensionale Bildsequenzen integriert. Hier wird ein Algorithmus für die schnelle Erfassung und Analyse von ROIs in Bildfolgen beschrieben. Es nutzt Ellipsen passen Rauschen gefilterten Signale, um eine optimale Platzierung ROI zu ermitteln, und berechnet Ca 2 +-Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung. Dieser Algorithmus wurde als frei verfügbare Software-Plugin für ImageJ (NIH) durchgeführt. Zusammen mit der Analyse Skripte für die Open-Source-Software R statistische Verarbeitung geschrieben,Dieser Ansatz bietet eine Hochleistungs-Pipeline für die Durchführung schnelle statistische Analyse der experimentellen ausgegeben. Die Autoren schlagen vor, dass die Verwendung dieser Analyseprotokoll wird zu einem vollständigen und unvoreingenommene Charakterisierung der physiologischen Ca 2 +-Signal führen.

Eine benutzerdefinierte Algorithmus, LC_Pro, wurde entwickelt und umgesetzt, um die automatisierte Analyse von Ca 2 + durchführen Dynamik auf konfokalen Bildsequenzen. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, nutzt sequentielle Verarbeitungsmodule, die A) erkennen und von dynamischen Websites Spur Ca 2 + der Algorithmus ändern statistischen oben (p &lt;0,01) Lärm, B) definieren Regionen von Interesse (ROI) automatisch am aktiven Zentrum Zentren und C) Berechnen Sie die durchschnittliche...

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die endotheliale Kalziumaktivität in Schweinekoronararterien mittels automatisierter ROI-Analyse zu untersuchen. Dazu werden Schweinekoronararterien präpariert und eröffnet, um in einem zweiten Schritt die endotheliale Kalziumaktivität zu messen. Anschließend wird eine automatisierte ROI-Analyse der erfassten Kalziummessungen durchgeführt, die zu einer zusammengefassten Ausgabe der Kalziumaktivität führt.Die nächsten Software-Skripte werden auf die Ausgabe angewendet, um die Ergebnisse der Kalziumaktivitätsanalyse statistisch auszuwerten und grafisch darzustellen. So erhält man Ergebnisse, die die Parameter der Kalziumsignal-Transiente basierend auf der automatisierten ROI-Analyse und statistischen Verarbeitung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen ROI-Analyse liegt darin, dass die automatisierte Analyse schneller, umfassender und weniger anfällig für Benutzerfehler ist. Bei diesem Verfahren werden die gewonnenen Schweinerightventrikel in eine A-P-D-M-S-Unterseite-Präparierschale gegeben, die mit Pufferlösung für physiologische Kochsalzlösung gefüllt ist.Entfernen Sie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

In Herzmuskelzellen, röhrenförmigen Membranstrukturen intrazellulären Netzwerken. Wir beschreiben optimierte Protokolle für i) Isolierung von Myozyten aus Maus Herz einschließlich der Qualitätskontrolle, ii) Lebendzellfärbung für state-of-the-Art-Fluoreszenzmikroskopie, und iii) die direkte Bildanalyse, um die Komponente Komplexität und die Plastizität der intrazellulären Membran quantifizieren Netzwerken.

Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Wir präsentieren eine Softwarelösung zur halbautomatischen Verfolgung der relativen Proteinkonzentration entlang der Länge der dynamischen zelligen Vorsprünge.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Wir präsentieren ein Protokoll für die Echtzeit-optische Erkennung von einzelnen unbeschriftete Proteine, wie sie von lebenden Zellen abgesondert werden. Grundlage hierfür ist interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, die auf eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Systemen und Konfigurationen angewendet werden können.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Dieses Protokoll enthält Schritte zur Erfassung und Analyse fluoreszierender Kalziumbilder von Gehirnummantelungsperizyten und Blutflussdaten aus nahe gelegenen Blutgefäßen bei anästhesierten Mäusen. Diese Techniken sind nützlich für Studien der Wandzellphysiologie und können angepasst werden, um Kalziumtransienten in jedem Zelltyp zu untersuchen.

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) ist ein Open-Source-ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse, das die Bewegung auf der z-Achse untersucht und den Maximalwert jedes Z-Stapels identifiziert, um die Intensität einer Zelle zum entsprechenden Zeitpunkt darzustellen. Es kann Neuronen trennen, die sich in lateraler (x / y) Richtung, aber auf verschiedenen Z-Ebenen überlappen.

TACI: Ein ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse

In diesem Protokoll stellen wir eine neuartige Technik zur Aufzeichnung und Analyse von Ca2+ -Signalen in intrapulmonalen Venen (kleine Lungenvenen oder PVs) bei physiologischem intraluminalem Druck vor. Die Technik umfasst die Isolierung kleiner PVs, deren Inkubation mit einem Ca2+ -Indikator, ihre Kanülierung und Druckbeaufschlagung, die konfokale Bildgebung von Ca2+ -Signalen und die Datenanalyse.

Bildgebung von Ca2+ -Signalen in kleinen Lungenvenen bei physiologischem intraluminalem Druck

In diesem Bericht schlagen wir eine neue Anwendung von lichthärtenden Dentalharze für Montagesockel von Elektroden oder Mikrodialysesonden in chronischen Experimenten. Dieses Material ermöglicht die direkte Anbindung an die Schädeldecke.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

Erfahren Sie die automatisierte ROI-Analyse zur Untersuchung endothelialer Calciumaktivität in Schweinekoronararterien. Diese Methode ermöglicht schnellere, umfassendere und weniger fehleranfällige Ergebnisse als manuelle Verfahren.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca

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