Name: Automatisierte Analyse von dynamischen Ca 2 + Signale in Bildsequenzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte ROI-Analyse zur Untersuchung endothelialer Calciumaktivität in Schweinekoronararterien. Diese Methode ermöglicht schnellere, umfassendere und weniger fehleranfällige Ergebnisse als manuelle Verfahren.

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Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Institutes of Health unterstützt Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 und MOP-93676.

1. Fahrzeug Dissection und Imaging <ol><li> Ernte-Gewebe aus heimischen Jugend Schweine wie in Martens et al 27 beschrieben. Zeigen geerntet Schweine rechten Herzkammer in ein Polydimethylsiloxan (PDMS) unten Dissektion Schale mit HEPES-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PSS). <ol><li> Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sezieren und entfernen ein Segment des linken vorderen absteigenden Koronararterie (~ 8 mm Länge, 0,5 mm Durchmesser) vom umgebenden Gewebe mit einer Pinzette und Schere Frühjahr durch die Gefäßsegment Entfernen aus den umliegenden Herzgewebeschichten. HINWEIS: Achten Sie auf die Gefäßwand nicht durchstechen. </li><li> Legen Sie ein PDMS-Block (1 x 0,5 x 0,5 cm) in die Dissektion Gericht, und verwenden Sie eine Nadel, um es auf den Boden zu fixieren. Schneiden Sie ein etwa 40 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht in zwölf ~ 0,3 cm lange Segmente bilden Mikropins, und diese in die Schüssel. Mit einer Pinzette, sichern eine Ende des Gefäßsegments zu dem Block mit einem micropin. </li><li> Kleine Feder Schere vorsichtig in das Gefäßlumen und längs geschnitten auf einer Seite des Schiffes, um es vollständig zu öffnen. Richten Sie die geöffnet Gefäßsegment mit dem Endothel auf. </li><li> Verwenden Sie die restlichen Mikropins, um die Grenzen des geöffneten Gefäßsegment zu sichern, um zu blockieren, so dass das Schiff bildet ein flaches Rechteck. HINWEIS: Mikropinlösung Spitzen sollten bis 90 ° gebogen und bündig mit der Blockoberfläche eingesetzt werden. Es sollte darauf geachtet werden, um das Schiff Zubereitung ohne Überdehnung strecken; endgültige Breite sollte ~ 1,5 Mal die Start ungedehnten Breite werden. </li><li> Bereiten ein kleines Volumen (ca. 1 ml) von Fluo-4.00 Beladungslösung durch Mischen von Fluo-4 AM (10 &amp;mgr; M), gelöst in DMSO mit Pluronic (0,03%) in einer HEPES-gepufferten PSS (enthaltend in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 Glucose) und stecken Sie den ganzen Block in die Ladelösung für etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. </li><li> Nach dem Laden, waschen Sie den Block in HEPES gepuffertPSS für 5-10 min. </li><li> Montieren Sie den Block auf 50-100 um dicken Abstandshalter in einem Deckglas untere Kammer enthält HEPES gepuffert PSS. HINWEIS: Metallstifte können als Abstandhalter verwendet werden, und sicherzustellen, dass das Gefäßsegment nach unten und in die Abstandshalter nicht berühren. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf der Stufe eines inversen Mikroskops für die konfokale Bildgebung ausgestattet ist, und sich auf die endotheliale Zellschicht. </li><li> Capture-Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen der basalen relativen Fluoreszenz für ~ 3 min bei 20-facher Vergrößerung und einer Bildrate von ~ 8 Bilder pro Sekunde mit der konfokalen Bildsequenzerfassung Software. </li><li> Nach ca. 3 Min. Aufzeichnungs basale Fluoreszenz, ersetzen HEPES gepuffert PSS-Lösung mit dem gleichen Volumen (~ 1 ml) von Substanz P (100 pM) in HEPES gepuffert PSS und Rekord für eine addtional 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Automatisierte Analyse <ol><li> Render-Bild-Sequenz (en) von fluoreszierenden Kalzium-Aktivität aus konfokalen Erfassungssoftware als 8-Bit-, grayscale. &quot;tif&quot;-Format-Dateien ohne angelegte Informations. </li><li> Offene ImageJ, klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot; im Datei-Menü, und wählen Sie die entsprechende Bildsequenz in der Explorer-Fenster, um die Bildsequenz (en) in ImageJ anzuzeigen. </li><li> Bestimmen Sie einen entsprechenden ROI Durchmesser mit Hilfe der rechteckige ROI-Tool, um die oberen und unteren Grenzen der räumlichen Ausbreitung der Aktivität innerhalb der Bildsequenz (en) zu schätzen. HINWEIS: Die mittlere rechteckige Durchmesser ist die richtige Wahl für ROI Durchmesser. </li><li> Erstellen Sie einen neuen Ordner auf der Festplatte des Computers, und fügen Sie die Bildsequenz (en) in den Ordner-Verzeichnis. </li><li> In ImageJ, klicken Sie auf das Fenster &quot;Plugins&quot;, dann klicken Sie auf &quot;LC_Pro &#39;, um die Analyse zu starten. </li><li> Geben Sie den Durchmesserwert ROI und wählen Sie den Filter Schwellenwert (entweder 0,05 oder 0,01). </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Drogenbehandlung&quot; Kästchen und unmittelbar vor und nach der Droge wurde hinzugefügt (in Sekunden) in die Zeitpunktwerte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, undgeben Sie die Bildsequenz-Verzeichnis in den Datei-Explorer-Fenster. </li></ol> 3. Grafische Ausgabe <ol><li> Laden R-Version 3.0.2 von <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Öffnen Sie die 32-Bit-Version von R. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;Open Skript&quot; und wählen Sie die &#39;traceplot.R &quot;R-Skript zur Erzeugung grafischer Versuchsberichte. </li><li> Installieren Sie die Kalibrierung, und gplots Pakete mit &#39;Pakete&#39;, &#39;Installieren von Paketen &quot;, und die Auswahl der zweckdienlichen Pakete. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;change directory&quot;-Befehl, und verwenden Sie das Explorer-Fenster auf das Verzeichnis, das auf die Analyse LC_Pro Ausgang entspricht wählen. </li><li> Klicken Sie auf das Skript-Fenster und dann die &#39;laufen alle &quot;zu befehlen, das Skript auszuführen. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Entschlüsselung komplexer Ca 2 +-Signale auf zellulärer Ebene und mehrzelligen strengen experimentellen und analytischen Ansätze erfordern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, bei dem zeitaufgelöste konfokale Bildsequenzen von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz an einer automatisierten Analyse identifiziert und quantifiziert statistisch relevanten Ca2 +-Signale in intakten Zellfelder Im speziellen Fall dargestellt unterworfen, wurde isoliert eine Arterie Segment aus Schweineherz, merken geöf...

Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül second messenger und zytosolischen Ca 2 +-Spiegel sind stark reguliert. Die intrazelluläre Ca2 +-Signale sind komplex und umfassen isolierten Transienten, Schwingungen, Wellen-und Pflanzgut 1-4. Räumliche und zeitliche Steuerung von Ca 2 + wird gedacht, um physiologische Signal Spezifität zugrunde liegen und damit die Analyse von Ca 2 +-Signalmuster ist von großem Interesse für die Ermittler in mehreren Feldern fünf. Ca 2 +-Indikator-Farbstoffe, wie Fluo-4 und Fura-2 werden üblicherweise verwendet, um intrazelluläre Ca 2 +-Signale mit Fluoreszenzmikroskopie 5-12 messen. 16 - typischerweise werden zeitliche Ca 2 +-Signale als zeitabhängige Änderung der mittleren Fluoreszenz innerhalb einer benutzerdefinierten Bereich oder Region von Interesse (ROI) 5,6,13 ausgewertet. Derzeit ist die manuelle ROI-Analyse sowohl zeitaufwendig und arbeits inSpannender, weil es erfordert, dass Benutzer viele ROIs identifizieren und sich wiederholende Berechnungen 17-19. Diese Techniken können auch mit erheblichen Benutzerfehler, einschließlich Einführung der künstlichen Signalarten und den Ausschluss von niedriger Amplitude oder diffuse Signale 18,20. Automatisierte ROI Erkennungsalgorithmen sind zuvor unter Verwendung einer Vielzahl von statistischen Methoden, um eine optimale Platzierung ROI ermitteln implementiert worden, aber sie haben im Allgemeinen eine Analyse der Zeilen oder Pseudo-Zeilenbilder, die Analyse auf eine einzige räumliche Dimension in der Zeit 17 begrenzt begrenzt, 19-22. Darüber hinaus sind viele bestehende Algorithmen nicht aus, um die Vielfalt der Ca 2 +-Freisetzung aus Ereignissen, die periodisch, lokalisierten Transienten ausbreitende Wellen 23,24 Bereich umfassen. Umfassende Bewertung der physiologischen Ca2 +-Signale wird oft durch die Anwesenheit von signifikanten Bild Artif komplizierthandeln, dass verwechselt Signal-Rausch-Diskriminierung in vielen experimentellen Systemen. Zuvor eine automatisierte ROI-Erkennungsalgorithmus Lösung Ca 2 +-Signal Transientenerkennung, als Plugin für NIH ImageJ Software implementiert (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wurde entwickelt und validiert 25,26. Dieser Algorithmus, genannt LC_Pro, wurde entwickelt, um zu erkennen und zu analysieren ROIs umfassenden Ca 2 +-Signal-Transienten in zweidimensionalen Zeitraffer-Bildsequenzen. Hier eine praktische Versuchsprotokoll und repräsentative Demonstration einer Anwendung des Algorithmus in Schweineherzkranzarterie Endothel vorgesehen ist, mit zusätzlichen Postprocessing mit der Open-Source-Software R statistische Verarbeitung zu brauchbaren grafischen Ausgabe zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Sezierschale</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>Elastomer-Kit, muss in Schalen eingegossen werden</td></tr><tr><td>HEPES-gepuffert PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES säure</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>AM Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Metallstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas-Bodenkammer</td><td></td><td></td><td>Speziell entwickeltes</td></tr><tr><td>konfokales Spinning-Disc-Mikroskop</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download bei: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro Plugin für imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download unter: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">download unter: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">download unter: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

automatisierte analyse von dynamischen ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; signale in bildsequenzen

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intrazelluläre Ca 2 +-Signale sind allgemein mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe, und Mikroskopie-Techniken untersucht. Ist die quantitative Analyse von Ca 2 +-Bilddaten jedoch zeitaufwendig und je nach Vorspannung. Automatisierte Signalanalyse-Algorithmen basieren auf Region von Interesse (ROI) Detektion wurden für eindimensionale Zeilen Messungen durchgeführt worden, aber es gibt keine aktuelle Algorithmus optimiert die Identifizierung und Analyse von ROIs in zweidimensionale Bildsequenzen integriert. Hier wird ein Algorithmus für die schnelle Erfassung und Analyse von ROIs in Bildfolgen beschrieben. Es nutzt Ellipsen passen Rauschen gefilterten Signale, um eine optimale Platzierung ROI zu ermitteln, und berechnet Ca 2 +-Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung. Dieser Algorithmus wurde als frei verfügbare Software-Plugin für ImageJ (NIH) durchgeführt. Zusammen mit der Analyse Skripte für die Open-Source-Software R statistische Verarbeitung geschrieben,Dieser Ansatz bietet eine Hochleistungs-Pipeline für die Durchführung schnelle statistische Analyse der experimentellen ausgegeben. Die Autoren schlagen vor, dass die Verwendung dieser Analyseprotokoll wird zu einem vollständigen und unvoreingenommene Charakterisierung der physiologischen Ca 2 +-Signal führen.

Eine benutzerdefinierte Algorithmus, LC_Pro, wurde entwickelt und umgesetzt, um die automatisierte Analyse von Ca 2 + durchführen Dynamik auf konfokalen Bildsequenzen. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, nutzt sequentielle Verarbeitungsmodule, die A) erkennen und von dynamischen Websites Spur Ca 2 + der Algorithmus ändern statistischen oben (p &lt;0,01) Lärm, B) definieren Regionen von Interesse (ROI) automatisch am aktiven Zentrum Zentren und C) Berechnen Sie die durchschnittliche...

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die endotheliale Kalziumaktivität in Schweinekoronararterien mittels automatisierter ROI-Analyse zu untersuchen. Dazu werden Schweinekoronararterien präpariert und eröffnet, um in einem zweiten Schritt die endotheliale Kalziumaktivität zu messen. Anschließend wird eine automatisierte ROI-Analyse der erfassten Kalziummessungen durchgeführt, die zu einer zusammengefassten Ausgabe der Kalziumaktivität führt.Die nächsten Software-Skripte werden auf die Ausgabe angewendet, um die Ergebnisse der Kalziumaktivitätsanalyse statistisch auszuwerten und grafisch darzustellen. So erhält man Ergebnisse, die die Parameter der Kalziumsignal-Transiente basierend auf der automatisierten ROI-Analyse und statistischen Verarbeitung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen ROI-Analyse liegt darin, dass die automatisierte Analyse schneller, umfassender und weniger anfällig für Benutzerfehler ist. Bei diesem Verfahren werden die gewonnenen Schweinerightventrikel in eine A-P-D-M-S-Unterseite-Präparierschale gegeben, die mit Pufferlösung für physiologische Kochsalzlösung gefüllt ist.Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop ein Segment der linken absteigenden Koronararterie, indem Sie sie vorsichtig von den umgebenden Herzgewebeschichten ablösen. Achten Sie darauf, die Gefäßwand nicht zu verletzen. Anschließend stellen Sie den PDMS-Block in die Präparierschale und befestigen ihn mit einer Nadel am Boden. Fügen Sie Pufferlösung der Schale hinzu. Schneiden Sie dann einen Wolframdraht mit einem Durchmesser von etwa 40 Mikrometern in zwölf 0,3 Zentimeter lange Segmente, um Mikronadeln herzustellen, und legen Sie diese in die Schale. Befestigen Sie mit der Pinzette ein Ende des Gefäßsegments mit einer Mikronadel am Block. Führen Sie die kleine Feder-Schere vorsichtig in das Gefäßlumen ein und schneiden Sie längs entlang einer Seite des Gefäßes, um es vollständig zu öffnen. Danach richten Sie das geöffnete Gefäßsegment mit dem Endothel nach oben aus. Befestigen Sie die Ränder des geöffneten Gefäßsegments mithilfe der verbleibenden Mikronadeln am Block, sodass das Gefäß eine flache, rechteckige Form bildet.Danach ein Milliliter Fluoreszenz-4:00-AM-Ladepufferlösung herstellen. Den gesamten Block nach dem Beladen für etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln in die Ladepufferlösung geben. Anschließend den Block mit hepesgepuffertem PSS fünf bis zehn Minuten waschen. Danach den Block auf 50 bis 100 Mikrometer dicken Abstandshaltern in einer Kammer mit Deckglasboden, die hepesgepuffertes PSS enthält, montieren.Platzieren Sie die Kammer auf dem Objekttisch eines umgekehrten Mikroskops, das für die konfokale Bildgebung ausgestattet ist, und fokussieren Sie auf die endotheliale Zellschicht mithilfe der Software zur Sequenzaufnahme im konfokalen Modus. Erfassen Sie innerhalb von drei Minuten bei 20-facher Vergrößerung und einer Bildrate von acht Bildern pro Sekunde zeitaufgelöste Aufnahmen der basalen relativen Fluoreszenz. Nach dreiminütiger Aufzeichnung der basalen Fluoreszenz ersetzen Sie die hepesgepufferte PSS-Lösung durch das gleiche Volumen einer 100 Pikomolar Substanz-P-Lösung in hepesgepufferter PSS und nehmen weitere drei Minuten lang die Aufnahmen auf. Erstellen Sie im Rahmen dieses Verfahrens die Bildsequenz der fluoreszierenden Kalziumaktivität aus der konfokalen Aufnahmesoftware als 8-Bit-Graustufen-TIFF-Datei ohne Maßstabsangabe.Öffnen Sie dann ImageJ. Klicken Sie im Dateimenü auf „Öffnen“ und wählen Sie im Explorer-Fenster die entsprechende Bildsequenz aus. Um die Bildsequenz in ImageJ anzusehen, bestimmen Sie ein geeignetes ROI, indem Sie mit dem rechteckigen ROI-Werkzeug die oberen und unteren Grenzen der räumlichen Ausbreitung der Aktivität innerhalb der Bildsequenz abschätzen. Erstellen Sie anschließend einen neuen Ordner auf der Festplatte des Computers und fügen Sie die Bildsequenz in das Verzeichnis des Ordners ein.In ImageJ klicken Sie auf das Fenster „Plugins“. Klicken Sie dann auf „LC Pro“. Um die Analyse zu starten, geben Sie den ROI-Durchmesser ein und wählen Sie den Filter-Schwellenwert nach dem Wort aus.Klicken Sie auf das Kontrollkästchen für die Drogenbehandlung und geben Sie die Zeitpunktwerte unmittelbar vor und nach der Zugabe der Droge ein. Klicken Sie dann auf „OK“ und geben Sie das Verzeichnis der Bildsequenz im Datei-Explorer-Fenster ein. Laden Sie in diesem Schritt die R-Version 3.0 0.2 herunter und installieren Sie sie.Danach öffnen Sie die 32-Bit-Version von R. Klicken Sie dann auf Datei. Öffnen Sie anschließend das Skript und wählen Sie das Spurdiagramm-RR-Skript zur Erstellung grafischer Versuchsberichte aus. Installieren Sie die Pakete calibrate und gpls, indem Sie Pakete auswählen.Installieren Sie die Pakete und wählen Sie danach die entsprechenden Pakete aus. Klicken Sie auf Datei, dann auf den Befehl Verzeichnis wechseln und nutzen Sie das Explorer-Fenster, um das Verzeichnis auszuwählen, das der lc pro-Analyse-Ausgabe entspricht. Klicken Sie anschließend auf das Skriptfenster und dann auf den Befehl Alles ausführen, um das Skript hier auszuführen.Die Zeitrafferaufnahmen einer Eingabebildsequenz mit einem basal erfassten Intervall, gefolgt von einem durch Substanz P stimulierte Erfassungsintervall, sind als Graustufen-Zeitraffersequenzen dargestellt. Die besten Lyseereignisse für die basal und stimulierte Intervalle wurden mit lc Pro dargestellt, und die zeitabhängigen skalierten Intensitätskurven aus jedem automatisch positionierten ROI sind hier gezeigt. Histogramme der Peakamplitude, Dauer bei halber Maximalhöhe und maximale räumliche Ausbreitung sowohl für die Kontroll- als auch für die durch Substanz P stimulierte Ereignisse aus einem repräsentativen Experiment wurden erstellt. Unter Verwendung von R zur grafischen Aufbereitung der Ausgabedaten von lc Pro.Bemerkenswerterweise erhöhte die Stimulation mit Substanz P die Anzahl der Ereignisse und verursachte eine signifikante Rechtsverschiebung der medianen Amplitude und Dauer, wie durch einen Mann-Whitney-U-Test gezeigt wurde. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Bildartefakte aufgrund von Fokusebenenverschiebungen oder falschen Kontrasteinstellungen so gering wie möglich zu halten, da diese die Analyseergebnisse erheblich beeinflussen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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