Name: qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie qPCR zur empfindlichen Detektion von Zytomegalievirus-DNA in formalinfixierten, paraffinembeddeden Gastrointestinalbiopsien eingesetzt wird. Diese Methode bietet eine zuverlässige Alternative zu konventionellen Färbetechniken.

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Wir erkennen an, Amy Thomasson für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Manuskript, und Fredrik Skarstedt und Ryan Christy für ihre Bemühungen bei der Vorbereitung der Zahlen.

Mit der Zustimmung des Institutional Review Board wurde eine Suche des elektronischen Labor-Datenbank durchgeführt, um in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Blöcken, die Fälle von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion bei gastrointestinalen (GI) Biopsien durch Histopathologie diagnostiziert (Hämatoxylin und identifizieren Eosin (H &amp; E) und / oder Immunhistochemie (IHC)). 1. Gewebeverarbeitung aus FFPE GI Biopsie Gewebe <ol><li> FFPE GI Biopsie Gewebeblöcke Sammeln für Cytomegalovirus (CMV) quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Diese Blöcke werden bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Pre-Etikett 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Block eindeutige Identifikationsnummer. </li><li> Sperren Sie die Mikrotom Handrad. </li><li> Setzen Sie die Gewebeblock in die Kassette Klemme. </li><li> Mit einem frischen, unbenutzte Klinge, richten Sie den Block an den Messerwinkel am Mikrotom. </li><li> Stellen Sie die Mikrotom bis 10 um dicke Schnitte geschnitten. </li><li> Entsperren thE Handrad und vorab der Block in Richtung der Klinge. </li><li> Cut 5 Sektionen des Blocks bei 10 um dicke Abständen, so dass jeder Schnitt in einer Schriftrolle von Gewebe zu rollen. Stellen Sie sicher, dass jede Rolle enthält eine angemessene Vertretung der gewünschten Biopsie Gewebe. </li><li> Sperren Sie die Mikrotom Handrad. </li><li> Mit Pinzette, legen alle fünf Schriftrollen von Gewebe in der Pre-markierten Zentrifugenröhrchen, wobei darauf geachtet, das Buch nur durch die Manipulation Paraffin, um Potenzial für eine Kreuzkontamination zu verringern. Lassen Sie die Kappe auf dem Rohr und setzen Sie ihn wieder auf den Rost. </li><li> Entfernen Sie die Gewebeblock aus dem Mikrotom. </li><li> Entfernen und Entsorgen der Klinge. </li><li> Dekontaminieren keine Flächen oder Geräte, die in Kontakt mit dem früheren Gewebe kommen kann. </li><li> Legen Sie eine frische, unbenutzte Klinge in den Messerhalter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,14 für jeden zusätzlichen Block zu verarbeiten. Die Mikrozentrifugenröhrchen von Geweberollen enthalten, können bei Raumtemperatur bis zur tim gespeichert werdene der DNA-Extraktion. </li></ol> 2. DNA-Extraktion aus FFPE Scrolls of GI Biopsie Gewebe HINWEIS: Dieses Protokoll wird von der Packungsbeilage des FFPE Gewebe DNA-Extraktions-Kits (: siehe Material Safety Data Sheet (MSDS) VORSICHT) angepasst. <ol><li> 1 ml Xylol (ACHTUNG: siehe Sicherheitsdatenblatt) zu jeder Probe Mikrozentrifugenröhrchen. Den Deckel schließen und kräftig vortexen für 10 Sekunden. </li><li> Fahren Sie mit der DNA-Extraktion, wie insbesondere in Produktbeilage des Herstellers mit den folgenden Modifikationen beschrieben. </li><li> Fügen Sie zuerst 6 ul der internen Kontrolle (IC) zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Nach dem ATL / Proteinase K-Lyse-Inkubation bei 56 ° C für 1 h, Inkubation bei 99 ° C für 30 Minuten, anstatt 90 ° C für 1 Stunde. </li><li> Während der abschließenden DNA-Elution Schritt, vorsichtig zu öffnen, den Deckel des DNA-Reinigungskolonne und gelten 50 ul destilliertem DNAse / RNAse-freies Wasser in der Mitte der Membran, anstatt buffer ATE. HINWEIS: In der Packungsbeilage für die geeignete Lagerung und Vorbereitung der Reagenzien. DNA sollte von allen 5 FFPE Rollen extrahiert werden. Führen alle Zentrifugationsschritte bei Raumtemperatur (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR für CMV <ol><li> Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verfahren <ol><li> Generieren Sie ein Excel-Arbeitsblatt für die PCR-CMV-Testlauf. Diese Excel-Tabelle berechnet die Gesamtmenge jedes Reagenz notwendig sind, um den Master-Mix mit Mg. Er multipliziert die Menge von jedem Reagenz, die pro Probe (siehe unten) mal der Anzahl der Proben und Kontrollen plus eins (um den Verlust durch Pipettieren zu kompensieren). <ol><li> Gehören die folgenden Reagenzien in jeder PCR-Reaktion in der Höhe angegeben: Reagens0; Menge pro Probe CMV-LC-Master-Mix Fläschchen 12,5 ul Mg-Lösung gelben Phiole 2,5 ul Gesamtvolumen 15,0 ul </li></ol></li><li> Fügen Sie bei jedem Test, führen Sie ein Wasser oder keine Zielkontrolle (NTC), Negativkontrolle, einen niedrigen positiven Kontrolle, eine hohe positive Kontrolle und entweder QS3 oder QS4 und alle Patientenproben. Die Kapillaren sollte in dieser Reihenfolge gesetzt werden. </li><li> Der Kühlblock erhalten, die spezifisch für die Echtzeit-PCR-Instrument, das bei 4 ° C gelagert wird Legen Sie die entsprechenden Kapillaren in den Kühlblock. Die Oberfläche der Kapillaren nicht berühren. Verwenden Sie immer Handschuhe bei der Handhabung der Kapillaren. </li><li> Richten Sie alle Polymerase-Kettenreaktionen in einer sauberen Haube nicht mit der Verstärkung der Produktion verunreinigtts. <ol><li> Entfernen Sie die richtige Anzahl von Master-Ampullen aus dem PCR-Kit, um alle Patientenproben, plus 5 Kontrollen zu testen. Lassen Sie die Master-Fläschchen, Mg-Lösung und PCR-Wasser Tauwetter in den Kühlblock. Jeder Master-Fläschchen enthält genügend Reagenzien für 12 Tests. </li><li> Vorsichtig vortexen die Stamm Fläschchen und schnell drehen sie in der Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Die Inhalte der einzelnen Master-Fläschchen in einem Fläschchen, und sanft wieder Wirbel. </li><li> Kombinieren Sie den Master-Mix-und Mg-Lösung in den auf dem PCR-Arbeitsblatt angegeben in einem einzigen sterilen Mikrozentrifugenröhrchen beträgt. </li><li> Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot Master-Mix mit Mg in jede Kapillare, mit Ausnahme der Kapillare in Position 5, die für die Quantifizierung Standard (QS) ist. </li></ol></li><li> Bewegen Sie den Kühlblock die Kapillaren und Master-Mix enthalten, mit Mg von der sauberen Haube zu einer Verarbeitungs Kapuze. </li><li> In 2 ul der internen Kontrolle (IC) auf die verbleibenden 30 ul Mastermischen mit Mg. Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot in die Kapillare in Position 5 (Position für die QS). </li><li> Pipette 10 ul Wasser, Kontroll-DNA oder Proben-DNA in den geeigneten Kapillarrohr. Verschließen Sie die Kapillaren mit dem Capping-Tool. </li><li> Nehmen Kühlblock / Proben auf der Echtzeit-PCR-Instrument. </li></ol></li><li> Programmieren Sie die Echtzeit-PCR-Instrument (siehe Tabelle 1) </li><li> Amplifikation und Detektion auf der Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt <ol><li> Melden Sie sich auf dem Computer </li><li> Klicken Sie doppelt auf das Gerätesymbol und melden Sie sich in der Software. </li><li> Schalten Sie den Echtzeit-PCR-Instrument </li><li> Klicken Sie auf &quot;CMV / EBV&quot; aus der Frontscheibe. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Assistenten, Makro. </li><li> Wählen Sie die Box, um einen Selbsttest durch, wenn sie von der Software dazu aufgefordert werden. Ein Selbsttest muss einmal pro Tag das Gerät im Einsatz durchgeführt werden. </li><li> Nennen Sie den Lauf. </li><li> Stellen Sie die Probenzahl in der oberen befindet left Ecke der Seite auf die Summe der Kontrollen und Patienten im Vorfeld enthalten und die Identifizierungsnummer jeder Patientenprobe. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Unter &quot;Sample-Typ&quot;, weisen Sie den entsprechenden Probentyp für den Standard. </li><li> Geben Sie die zu erwartenden Konzentrationen für die Quantifizierung Standard (QS). </li><li> Entfernen der Kapillarröhrchen an dem Kühlerblock und sie in der entsprechenden Position in dem Karussell (Kühlblock Probe Nr. 1 ist in Position 1 auf dem Karussell angebracht werden, etc.). </li><li> Legen Sie das Karussell in die Zentrifuge und Start drücken des Instruments. </li><li> Öffnen und entfernen Sie die Zentrifuge Karussell. </li><li> Legen Sie das Karussell in die Echtzeit-PCR-Instrument. Schließen Sie den Deckel. </li><li> Drücken Sie &quot;Start Ausführen&quot;. </li><li> Die Echtzeit-PCR-Instrument wird jede Position für eine Probe zu prüfen. Sie vom Instrument weg gehen nicht bis diese Prüfung abgeschlossen ist, vorallem wenn eine der Kapillaren nicht in dem Karussell. Das Instrument wird dies beachten und fragen, ob der Lauf fortgesetzt werden. Antwort ja vor der Abreise. </li><li> Nachdem der Lauf beendet ist, schließen Sie den Bericht, der generiert wurde. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Absolute Quantifizierung&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil neben Farbe Compensation. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie die Farbkorrektur&quot; aus der Drop-Down-Feld. </li><li> Wählen Sie das aktuelle Farbkompensationsdatei auf der Flucht an. </li><li> Klicken Sie auf OK, wenn die Box erscheint. </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil von Standard-Kurve. </li><li> Wählen Sie &quot;extern&quot; aus der Drop-Down-Menü. </li><li> Wählen Sie den aktuellen externen Standardkurve Datei, klicken Sie dann auf OK. </li><li> Schauen Sie sich jede Kurve unter der Absolute Quantifizierung Menü, um sicherzustellen, dass Kurven vorhanden und nicht flache Linie sind, wenn eine Konzentration zugeordnet ist. Die absolute Quantifizierung für die 705/Back 530 wird automatisch analysiert. </li></ol></li><li> Qunalität Steuer <ol><li> Erzeugen Sie eine neue Standardkurve, wenn eine neue Charge von Reagenzien empfangen wird, oder alle sechs Monate, je nachdem, was häufiger ist. </li><li> In 10 ul jeder Standard-zum Master-Mix mit Mg. Betrachten Sie die mit dem Kit wie zuvor extrahierten DNA enthalten Standards. </li><li> 1 ul der internen Kontrolle für jeden Standard an den Master-Mix mit Mg bei der Erzeugung der Standardkurve verwendet, um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Sie IC an den Master-Mix mit Mg für den Leerwert-Kontrolle (NTC) nicht hinzu. </li><li> Bereiten Sie ein NTC und drei Wiederholungen von Quantifizierung Standards QS 4, 3, 2, 1, und einer 1:10-Verdünnung von QS4 für den Lauf um die Standardkurve zu erzeugen, insgesamt in 16 Datenpunkten. </li><li> Wählen Sie &quot;Replikat&quot; in der Drop-Down-Menü für die wiederholte Standards </li><li> Wählen Sie Kanal 530/back keine, und schalten Sie die Farbkompensation bei der Analyse der Sicht, </li><li> Unter &quot;Standard Curve (In Run)&quot; wählen Sie &quot;Speichern unter Exinternen &quot;und benennen Sie die Kurve. Geben Sie den Kommentar &quot;als Standardkurve aufgetragen&quot; beim Speichern. </li><li> Grafik die Ergebnisse. Die daraus resultierende Linearitätskoeffizient muss ≥ 0,81 werden. </li><li> Für die tägliche Abfahrten, sind eine Kopie des QS3 oder QS4 als Kontrolle in der Flucht. Die aktuelle externe Standardkurve kann während der Analysephase in den Lauf eingeführt werden. </li><li> Führen Kontrollen: keine DNA Kontrolle, Negativkontrolle, niedrige und hohe positive Kontrollen. Erwartete Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer angepasst. </li><li> In einer IC zu jeder Probe und während der DNA-Extraktion zu kontrollieren. </li><li> Wenn eine der Kontrollen fallen außerhalb des Bereichs, notieren Sie die Ergebnisse inakzeptabel und verweisen den Test für die Fehlersuche. </li></ol></li><li> Die Häufigkeit der Kontrollen <ol><li> Fügen Sie in jedem Lauf: ein NTC, negativ, schwach positiv, hohe positive und Standardsteuerung. </li></ol></li></ol> Hinweis: Der zulässige Grenzwerte für Kontrollen. Keine Spitzen sollten beobachtend für die ohne Vorlage (NTC) und Negativkontrollen. Peaks sollte in der 530-Kanal vorhanden sein und die erwarteten Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer für den niedrigen und hohen positiven Kontrollen angepasst.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Viele Labormethoden sind für die Diagnose des Cytomegalovirus (CMV)-Infektion, darunter Serologie, Viruskultur, Molekularbiologie Virämie Assays, Histologie von Biopsiematerial und, wie kürzlich gezeigt, molekulare Tests von Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsie verfügbar Gewebe 5,6. Serologie, einst eine tragende Säule der Diagnose, nur zuverlässig identifiziert Belichtung und nicht gut mit akuten CMV-Infektion 7 korrelieren. Viruskultur, sowohl konventionelle als frühe Antig...

Interpretation von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion in klinischen Proben ist von entscheidender Bedeutung. CMV ist ein Mitglied der Unterfamilie Betaherpesvirinae von Herpesviren. Ähnlich wie bei anderen Herpesviren, hat die Fähigkeit, CMV dauerhafte oder latente Infektion zu etablieren, gekennzeichnet durch einen Mangel der aktiven Virusreplikation 1. Reaktivierung des Virus kann in Zeiten von Stress oder andere Immunsuppression auftreten, was zu aktiver Virusreplikation, gekennzeichnet durch Virion Mitteilung, die von Krankheitsmanifestationen 2-4 begleitet sein kann. Gastrointestinale (GI) CMV-Erkrankung Symptome sind häufig Bauchschmerzen und / oder Blut im Stuhl ein. Die Diagnose der CMV Gastroenteritis durch Histologie nutzt Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E), um virale CMV Einschlüsse identifizieren. In Fällen, in denen der klinische Verdacht hoch noch keine offensichtlichen Einschlüsse beobachtet werden, ist der Immunhistochemie (IHC) häufig als Ergänzung Testverfahren verwendet. Jedoch IHCkann auch durch nicht-klassische selten auftretenden Zellfärbungsmuster (zweideutig) behindert werden, so dass die Interpretation erschweren (Abbildung 2) 5. Es wurde versucht, aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) GI Biopsiegewebe und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) auf CMV in GI Biopsien erkennen extrahierten DNA zu verwenden. Diese Technik hat sich gezeigt, wertvoll bei der Detektion von CMV in GI Biopsien werden und ist besonders nützlich in zweideutigen IHC Färbung Fällen 5,6. Auch hat qPCR auch gezeigt, dass auch mit zusätzlichen klinischen CMV Testdaten zu korrelieren, wenn es 6 ist verfügbar. Verwendung von qPCR bei der Aufdeckung von CMV kann auf frühere Diagnose und Behandlung in Fällen, in denen der klinische Verdacht auf CMV ist hoch führen, aber H &amp; E-und CMV-IHC negativ sind.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Mikrofugenröhrchen</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit Wellenschliff</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>62086-1S</td><td>Mikropinzette MF-1</td></tr><tr><td>Tischzentrifugen (Mikrofuge)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 Gallone</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Supplement Kit</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Zentrifuge</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Kühlblock</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler Verschließwerkzeug</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Farbkompensationskit</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Kapillaren</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Klingen</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge niedriges Profil</td></tr></tbody></table>

qpcr ist eine empfindliche und schnelle methode zur detektion von dna zytomegalieviren in formalin-fixierte, in paraffin eingebettete gewebebiopsie

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Es ist entscheidend, Cytomegalovirus (CMV)-Infektion im Magen-Darm-Trakt (GI) bei immunsupprimierten Patienten zu identifizieren, aufgrund ihrer höheren Risiko für schwere Infektionen. Viele Laborverfahren zum Nachweis von CMV Infektion entwickelt worden, einschließlich der Serologie, Viruskultur und molekularbiologischer Methoden. Oft sind diese Methoden reflektieren systemische Beteiligung mit CMV und nicht spezifisch lokale Gewebe Beteiligung zu identifizieren. Daher wird der Nachweis von CMV Infektion in den GI-Trakt häufig durch herkömmliche Histologie der Biopsiegewebe gemacht. Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung in Verbindung mit der Immunhistochemie (IHC) haben die Hauptstützen der Untersuchung dieser Biopsien geblieben. H &amp; E und IHC manchmal in atypischen (zweideutig) Färbungsmuster führen, was die Interpretation erschweren. Es wurde gezeigt, dass quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zur CMV erfolgreich auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebebiopsie durchgeführt werden, für sehrhohe Sensitivität und Spezifität. Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie qPCR Tests für den Nachweis von CMV in FFPE Biopsiegewebe in einer klinischen Laborumgebung durchzuführen. Diese Methode ist wahrscheinlich von großem Nutzen für die Patienten in Fällen von zweideutigen Färbung für CMV in GI Biopsien sein.

Ein insgesamt 228 Gewebeblöcke wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), die von 91 Cytomegalovirus (CMV)-positiven Fällen mit zweideutigen CMV IHC bestand, wurde basierend auf positive Histologie und Immunhistochemie (IHC), 18, und 79 negative Kontrollen getestet. Wie in Abbildung 2 dargestellt, würde CMV-positiven Fällen typische CMV Viruseinschlüsse (A) und / oder positive IHC-Färbung (B) gezeigt haben. Nicht eindeutige Fälle würden seltenen, nicht-...

Dieses Protokoll beschreibt den qPCR-Nachweis von Cytomegalievirus in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Biopsiegewebe, der schnell, sensitiv, spezifisch und nützlich für die Interpretation von mehrdeutigen Hämatoxylin- und Eosin- oder immunhistochemischen Färbemustern ist.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die Empfindlichkeit bei der Detektion von Cytomegalovirus-DNA in gastrointestinalen Biopsien zu erhöhen, insbesondere bei Biopsien, die mit herkömmlichen Färbemethoden zweifelhafte Ergebnisse liefern. Dies wird erreicht, indem zunächst Schnitte („Scrolls“) aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem gastrointestinalem Biopsiegewebe abgeschnitten und gesammelt werden. Anschließend wird die DNA aus den Gewebeschnitten extrahiert, um sie anschließend zu amplifizieren.Die verwendeten spezifischen Primer amplifizieren selektiv jede vorhandene Zytomegalovirus-DNA. Wenn konventionelle Methoden bei gastrointestinalen Biopsiegeweben zweifelhafte Ergebnisse liefern, kann diese empfindliche Methode Zytomegalovirus-DNA nachweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen gängigen Methoden wie Hämatoxylin, Eosin und Immunhistochemie besteht darin, dass keine Interpretation von nicht klassisch erscheinenden Färbemustern erforderlich ist. Auf der Folie, die das Schneiden von gastrointestinalen Biopsiegeweben zeigt, wird Zainab van Horn, eine Histo-Technologin im Labor, außerdem die Nukleinsäure-Extraktion sowie den R-T-P-C-R-Aufbau im Labor demonstrieren.Rebecca Jocelyn Für dieses Protokoll. Halten Sie FFPE-GI-Biopsiegewebeprobenblöcke bereit, die auf zerkleinertem Eis liegen. Beschriften Sie zunächst ein Mikrozentrifugenröhrchen für jeden Probenblock mit der Identifikationsnummer des Gewebeblocks am Mikrotom.Stellen Sie sicher, dass das Handrad verriegelt ist, und führen Sie den Gewebeklotz in die Kassettenklemme ein. Verwenden Sie unbedingt eine neue Klinge, um eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. Es ist entscheidend, dass Sie für Ihre erste Probe eine unbenutzte Klinge verwenden.Wechseln Sie zwischen den Proben zu einer anderen Klinge, um den Mikrotom zwischen den Proben zu dekontaminieren. Richten Sie anschließend den Block auf den Neigungswinkel des Messers aus und stellen Sie die Schnittdicke auf 10 Mikrometer ein. Entsperren Sie nun das Handrad und bewegen Sie den Block in Richtung der Klinge voran.Schneiden Sie fünf Abschnitte des Blockes in 10-Mikrometer-Abständen, wobei jeder Abschnitt zu einer Gewebewickelrolle aufrollt. Stellen Sie sicher, dass jede Rolle eine ausreichende Darstellung des gewünschten Biopsiegewebes enthält. Nachdem die fünf Rollen geschnitten sind, blockieren Sie das Handrad.Beim Übertragen der fünf Schnittserien in das beschriftete Zentrifugenröhrchen sicherstellen, dass die Pinzette nur das Paraffin und nicht das Gewebe berührt. Das Röhrchen verschließen und anschließend den Block aus der Kassettenhalterung entfernen, um Schnittserien der nächsten Probe zu gewinnen. Zuerst die Klinge entfernen und entsorgen.Und bevor eine neue, unbenutzte Klinge eingesetzt wird, deskontaminieren Sie alle Oberflächen, die mit der vorherigen Probe in Kontakt gekommen sein könnten. Bis die Proben weiterverarbeitet werden, können sie bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Das folgende Protokoll ist angepasst von dem FFPE-Gewebe-DNA-Extraktionskit.Stellen Sie sicher, dass Sie das Sicherheitsdatenblatt konsultieren, bevor Sie fortfahren. Geben Sie zunächst einen Milliliter Xylol in jedes Probenröhrchen und wirbeln Sie diese anschließend 10 Sekunden lang kräftig um. Danach befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen.Zunächst geben Sie sechs Mikroliter der internen Kontrolle in jedes Reagenzglas. Danach führen Sie die Inkubation mit A TL Proteinase K bei 56 Grad Celsius für eine Stunde durch. Inkubieren Sie die Proben statt einer Stunde bei 90 Grad Celsius für 30 Minuten bei 99 Grad Celsius.Drittens, beim Abschluss des Elucian-Schritts, anstelle von Puffer, vorsichtig 50 Mikroliter DNA- und RNA-freies destilliertes Wasser in die Mitte der Membran der Elucian-Säule geben. Und schließlich sollten alle Zentrifugationsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Reaktionen in einer sauberen Haube aufbauen, die keine Amplifikationsprodukt-Kontaminanten aus dem Kit enthält.Entnehmen Sie genügend Stammfläschchen und Magnesiumlösung für die Proben sowie fünf Kontrollen. Jedes Stammfläschchen enthält Reagenz für 12 Tests. Nach dem Auftauen schwenken Sie die Stammfläschchen kräftig im Vortex und zentrifugieren sie kurz mit maximaler Geschwindigkeit.Als Nächstes unter Beachtung des PCR-Arbeitsblatts die Magnesiumlösung und die Master-Mix-Lösung mischen. Die Lösungen vorsichtig durch Pipettieren mischen und in den Kühlblock stellen. 15 µL der Mischung in die Testkapillaren im Kühlblock geben, mit Ausnahme der Position fünf.Dieses Kapillarrohr wird für den Quantifizierungsstandard beiseitegestellt. Bringen Sie den Kühlblock mit den Kapillarrohren und der Master-Mix-Lösung mit Magnesium aus dem sterilen Hauben in eine separate Bearbeitungshaube. Geben Sie hier zwei Mikroliter interne Kontrolle zu den verbleibenden 30 Mikrolitern Master-Mix hinzu.Mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und geben Sie 15 Mikroliter dieser Mischung in die Kapillare an Position fünf. Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter Wasser, Kontroll-DNA oder Proben-DNA in die entsprechende Kapillare ein. Nach dem Befüllen verschließen Sie die Kapillaren mit dem Verschlusswerkzeug in der Kapillarzentrifuge.Überführen Sie die Kapillaren vom Kühlblock in die entsprechende Position im Karussellrack. Danach laden Sie das Karussell in die Zentrifuge und führen den Zyklus nach dem Spinnen durch. Überführen Sie das Karussell in die Echtzeit-PCR-Maschine und führen Sie die Reaktion später während der Analyse durch.Zeigen Sie die Daten mithilfe der absoluten Quantifizierung an, um sicherzustellen, dass eine Kalibrierkurve zur Durchführung von Quantifizierungen vorliegt, insgesamt 228. Gewebeproben wurden mittels QPCR auf 91 getestet. Die Proben stammten aus Fällen mit CMV-positiver Histologie und positiver immunhistochemischer Färbung.18 Blöcke zeigten ein zweifelhaftes C-M-V-I-H-C. Die anderen 79 waren negative Kontrollen. CMV-positive Fälle wurden nachgewiesen.Typische CMV-Virusinklusionen und positiver IHC-Nachweis oder zumindest einer der beiden Befunde. Die zweifelhaften Fälle zeigten seltene, nicht klassische Färbungsmuster, während die negativen Kontrollen keine auffällige Histologie oder IHC-Färbung aufwiesen. Von den 91 Gewebeproben, die beim CMV positiv waren, wurden 88 mittels QPCR bestätigt. Von den 71 negativen Kontrollen wurde eine mittels QPCR als CMV-positiv getestet.A. Im Textprotokoll wird die Diskussion über die Biopsien mit zweifelhafter C-M-V-I-H-C-Färbung erläutert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die DNA-Extraktion aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem GI-Biopsiematerial durchführt und anschließend die Detektion von Cytomegalovirus-DNA mittels Echtzeit-PCR durchführt.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

In diesem Video wurden die mit MCPyV-Virionen infizierten Zellen einer in situ Hybridisierungskettenreaktion unterzogen, um MCPyV-spezifische Genome nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die DNA-HCR-Technik mit FISH kombiniert, um die MCPyV-DNA in infizierten menschlichen Hautzellen sichtbar zu machen.

HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Bereitgestellt wird ein Protokoll zur Entwicklung eines Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays zur Quantifizierung der Anfangskonzentration von DNA-Proben unter Verwendung eines Thermocyclers oder eines Mikroskops und einer Tischheizung. Ebenfalls beschrieben wird die Entwicklung einer internen Positivkontrolle. Skripte werden für die Verarbeitung von Echtzeit-Fluoreszenzrohdaten bereitgestellt.

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

Designer-Chromosomen des Synthetic Yeast Genome-Projekts, Sc2.0, können von ihren nativen Gegenstücken mit Hilfe eines PCR-basierten Genotypisierungsassays namens PCRTagging unterschieden werden, der einen Anwesenheits-/Abwesenheitsendpunkt hat. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Echtzeit-PCR-Nachweismethode für die PCRTag-Genotypisierung.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion-Analyse kombiniert mit reversen Transkription (RT-qPCR) wurde weithin zur Messung der RNA-Virusinfektionen. Hier präsentieren wir Ihnen einen direkten RT-qPCR-Assay, erfordern keine RNA Reinigungsstufe, entwickelt für die Quantifizierung von mehreren RNA-Viren, einschließlich Dengue-Virus.

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Identifizierung von Mechanismen, die Schädigung der Muskulatur ist von entscheidender Bedeutung. Hier präsentieren wir die histologische Technik zur Herstellung Paraffin eingebetteten und Gefrierschnitten von Drosophila Brustmuskeln. Dies ermöglicht die Analyse von Muskel-Morphologie und Lokalisation von Proteinen und anderen Zellbestandteilen Muskel.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Erfahren Sie, wie qPCR zur empfindlichen Detektion von Zytomegalievirus-DNA in formalinfixierten, paraffinembeddeden Gastrointestinalbiopsien eingesetzt wird. Diese Methode bietet eine zuverlässige Alternative zu konventionellen Färbetechniken.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie (Video) | JoVE Journal

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

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