MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mikro-RNA-Expression in induzierten pluripotenten Stammzellen zu vergleichen, nämlich in retinalen pigmentierten Epithelzellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet wurden, und in fetalen retinalen pigmentierten Epithelzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst IPS-Zellen und fetale RPE kultiviert und expandiert werden.

Der zweite Schritt besteht darin, die iPS-Zellen in Pigmentepithelzellen (RPE) zu differenzieren. Anschließend wird die RNA aus den iPS-Zellen, den iPS-RPE-Zellen und den fetalen RPE-Zellen isoliert. Der letzte Schritt umfasst die Durchführung einer microRNA-Microarray-Analyse an den RNA-Proben sowie die Auswertung der Daten.

Schließlich wird die Pfad- und Netzwerkanalyse verwendet, um differentiell exprimierte Mikro-RNAs zu identifizieren, die in mehrere zelluläre Netzwerke involviert sind, einschließlich Proliferation und Zellzyklusprogression. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Visionforschung zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Mikro-RNAs bei der Regulation der Differenzierung in reife retinale Pigmentepithel-(RPE-)Zellen, Zellzyklusprogression, Proliferation und Seneszenz spielen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf Therapien, die aus Stammzellen abgeleitetes retinale Pigmentepithel verwenden, um erkranktes oder geschädigtes RPE zu ersetzen, da die Optima-Passagennummer der für die Therapie verwendeten Zelle bestimmt werden kann.

Obwohl dieses Thema Einblicke in die Faktoren geben kann, die die Differenzierung von RRP aus IPS regulieren, kann es auch auf andere Organsysteme angewendet werden, wie beispielsweise die Differenzierung anderer, für die Schilddrüse spezifischer Zelltypen aus IPS. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die induzierten pluripotenten Stammzellen mit etwa 350 Zellkolonien pro Vertiefung in M tester one-Medium auf eine frisch beschichtete Platte ansäen, und lassen Sie die IPS-Kolonien vier bis fünf Tage lang in Kultur wachsen.

Dann alle drei Tage das M-Tesser-Eins-Medium durch vier Milliliter Differenzierungsmedium ersetzen und die Hälfte des Mediums durch frisches Differenzierungsmedium wechseln. Die pigmentierten Herde so weit wachsen lassen, dass sie manuell aus der Kultur herauspräpariert werden können, was etwa 40 bis 50 Tage dauert. Anschließend mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze um die pigmentierten Kolonien herumschneiden und diese anheben.

Sammeln und vereinen Sie die dissezierten Kolonien in einem 15-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie fünf Milliliter DMMF-12-Medien zu den vereinten RPE-Zellen hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 ×g. Entfernen Sie anschließend das Medium, resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation.

Entfernen Sie das Medium vom Zellpellet. Bereiten Sie dann eine Einzelzelllösung vor, indem Sie das gepoolte I-P-S-R-P-E mit 0,25 % TRIPSIN EDTA fünf bis zehn Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis Zellklumpen in Einzelzellen aufgelöst sind. Spülen Sie die I-P-S-R-P-E-Zellen mit I-P-S-R-P-E-Medium aus und säen Sie die gesammelten Zellen auf eine frische, mit Matrigel beschichtete Platte in vier Milliliter I-P-S-R-P-E-Medium aus. Kultivieren Sie die Zellen drei Wochen vor der Passage und erneuern Sie das Medium alle drei Tage durch frisches I-P-S-R-P-E-Medium für das Experiment.

Die I-P-S-R-P-E-Zellen bei 100.000 Zellen pro Quadratzentimeter ansäen und die Zellen dann 17 Tage nach der Aussaat zur Gewinnung undifferenzierter IPS-Zellen sammeln. Die Zellen so lange kultivieren, bis undifferenzierte Kolonien im Zentrum dicht erscheinen. Sobald dies beobachtet wird, die Kolonien mit D-M-E-M-F-12-Medium spülen und anschließend die IPS-Zellen mit Accutase in Einzelzellen dissoziieren.

Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten bei 300 G. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Milliliter D-M-E-M-F-12-Medien, um fetale RPE zu gewinnen. Spülen Sie fetale RPE-Zellkulturen zuerst mit D-M-E-M-F-12. Dann lösen Sie die Zellkulturen mithilfe von 0,25 % TRIPSIN-EDTA fünf bis 10 Minuten lang in Einzelzellen auf, bei 37 Grad Celsius.

Sammeln Sie die fetalen RPE-Zellen in einem 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 ×g. Anschließend den Überstand abpipettieren und das Zellpellet in zwei Milliliter D-M-E-M-F-12-Medium resuspendieren.

Sammeln Sie die I-P-S-R-P-E-Zellen am Tag 17. Nach der dritten und fünften Passage waschen Sie die I-P-S-R-P-E-Zellen zweimal mit PBS und bereiten eine Einzelzell-Suspension durch Inkubation mit einem Milliliter 0,25 %iger Trypsin-Lösung fünf bis zehn Minuten bei 37 °C vor. Anschließend neutralisieren Sie das Trypsin mit zwei Millilitern eiskaltem I-P-S-R-P-E-Medium und sammeln die Zellen in einem 15-Milliliter-Konischglas.

Zentrifugieren Sie das Gefäß fünf Minuten bei 300 × g und aspirationieren Sie anschließend den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern Markierungspuffer aus dem Mikroperlen-Kit. Zentrifugieren Sie die I-P-S-R-P-E-Zellsuspension im Markierungspuffer bei 300 × g für fünf Minuten. Danach aspirationieren Sie den Überstand und resuspendieren erneut.

Suspendieren Sie das Zellpellet in einer Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro 100 Mikroliter Puffer zum Anfärben aus dem Mikroperlen-Kit. Geben Sie 10 Mikroliter anti-TRA-1-60-PE-Antikörper pro zwei mal 10 hoch sechs Zellen hinzu. Mischen Sie gründlich und inkubieren Sie dann 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Markierungspuffer pro zwei mal 10 der sechs Zellen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten bei 300 ×g. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und resuspendieren das Zellpellet in 80 Mikroliter Markierungspuffer pro zwei mal 10 hoch sechs Zellen.

Dann 20 Mikroliter anti-PE-markierte Mikroperlen pro zwei mal 10 hoch sechs Zellen hinzufügen. Gut mischen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Pro zwei mal 10 hoch sechs Zellen ein Milliliter Färbe-Puffer hinzufügen, zehn Minuten bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand abpipettieren.

Suspenderen Sie dann das Zellpellet in 500 Mikrolitern Markierungspuffer und sortieren Sie die TRA-1-60-negativen Zellen in einem magnetischen Zellsortiergerät, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Lysieren Sie die Zellen, indem Sie jede Probe durch eine kommerziell erhältliche Mikrozentrifugen-Homogenisiersäule (Mini-Spin-Säule), die für Nukleinsäure-Minipräparationen konzipiert ist, laufen lassen. Extrahieren Sie dann die gesamte RNA aus den iPS-Zellen, I-P-S-R-P-E und fötalen RPE-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen RNA-Extraktionskit, das zur Erhaltung kleiner RNA-Moleküle entwickelt wurde.

Verwenden Sie ein NanoDrop-Spektrophotometer, um die Gesamtkonzentrationen an RNA zu bestimmen. Erstellen Sie eine Excel-Datei mit einer Liste der Mikro-RNAs, die mindestens eine zweifache Unterschiedlichkeit in der Expressionshöhe zwischen den Proben-Gruppen aufwiesen. Melden Sie sich danach bei dem Online-Programm zur Analyse von RNA-Wegen an und laden Sie die Excel-Datei hoch. Wählen Sie „flexibles Format“ als Dateiformat und Agilent aus der Auswahlliste für den Identifier.

Geben Sie unter der Überschrift „Rohe Daten“ ein. Weisen Sie die ID der Sondenspalte und die Beobachtung eins sowie das Log-Verhältnis der Log-Verhältnisspalte zu. Wählen Sie für alle anderen Spalten „Ignorieren“.

Wählen Sie die Parameter für die Analyse wie folgt aus: Vertrauenswürdigkeit, experimentell beobachtet, nur direkte und indirekte Beziehungen einschließen sowie endogene Chemikalien berücksichtigen. Wählen Sie die Ingenuity-Wissensdatenbank als Referenzmenge aus. Anschließend wählen Sie die Datenbank der Referenzmoleküle.

Dies umfasst Daten aus allen Arten, allen Zelllinien und Geweben sowie allen Mutationen. Nachdem alle Parameter ausgewählt wurden, führen Sie die Netzwerkanalyse durch Auswahl von Netzwerken durch. Anschließend wählen Sie überlappende Netzwerke aus und klicken dann auf ein Netzwerk von Interesse, um die Ergebnisse anzuzeigen.

IPS-Zellen, die zu I-P-S-R-P-E-Zellen differenziert wurden, wiesen das klassische RPE-Phänotyp hexagonaler pigmentierter Zellmorphologie auf, das mit dem von fetalen RPE-Zellen vergleichbar ist. Der Vergleich des Mikro-RNA-Expressionsprofils undifferenzierter IPS-Zellen mit I-P-S-R-P-E-Zellen zeigte eine Hochregulation von 47 Mikro-RNAs und eine Herunterregulation von 36 Mikro-RNAs, während fetale RPE-Zellen im Vergleich zu I-P-S-R-P-E-Zellen 61 Mikro-RNAs hochreguliert und 49 herunterreguliert zeigten. Die Pfadanalyse mit der Ingenuity IPA-Software ergab, dass die Zielgene der differentiell exprimierten Mikro-RNAs an zellulären Prozessen wie zellulärer Entwicklung, Wachstum und Zellzyklus beteiligt waren. Diese Analyse zeigte außerdem, dass Mikro-RNAs, die in okularen Geweben in vivo exprimiert werden, in I-P-S-R-P-E- und fetalen RPE-Zellen im Vergleich zu IPS-Zellen angereichert waren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontamination und Degradation der RNA-Proben zu vermeiden.

Andere Methoden wie die R-T-P-C-R können durchgeführt werden, um das Ausmaß der Mikro-RNA-Expression in jedem Zelltyp nach der Anwendung zu bestätigen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Sehforschung den Weg, um die Rolle von Mikro-RNAs bei Differenzierung und Zellzyklusprogression in rrp zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RPE aus IPS ableitet und das Mikro-RNA-Expressionsprofil von I-P-S-R-P-E mit dem von IPS-Zellen und fötalem RPE vergleicht.