Name: Verwendung von Shigella flexneri Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Untersuchung von Autophagie-Zytoskelett-Interaktionen bei Shigella flexneri-Infektionen in Zellkultur und Zebrafisch-Larven. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeit-Visualisierung von Septin-Käfigen.

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Arbeit im Labor SM wird durch ein Wellcome Trust Forschung Career Development Fellowship [WT097411MA] unterstützt.

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
<li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li>
<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bei der Überwachung von Autophagie und das Zytoskelett in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen, können die in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Protokolle für eine Vielzahl von Gewebekulturzelltypen angewendet werden. Darüber hinaus, um die Autophagie folgen (zB ATG8 / LC3 + ve Autophagosomen) und Zytoskelett (zB., Actin Schwänze, septin Käfige) Dynamik in Echtzeit während der Infektion mit Shigella Live-Bildgebung können Gewebekulturzellen transient mit GFP transfiziert werden, RFP- oder GFP-markierten Konstrukte wie zuvor beschrieben, 7,8. (. Dh in der Regel für die Echtzeit-Analyse bedenkt, dass Shigella können 5-30% der HeLa-Zellen bei 100 eindringen wünschenswert: 1 MOI), den Anteil der Zellen, die durch Shigella infiziert zu erhöhen, direkt hinzufügen 400 ul Shigella (OD 600 = 0,3 0,6), um Zellen in 2 ml MEM (Serummangel) und warten Sie mindestens 1,5 Stunden nach der Infektion für eine ausreichende Bakterieneintrag, die Flucht aus dem Phagosom, Replikation, autophagy Anerkennung und septin Käfighaltung. Alternativ kann man die M90T Shigella AFAI Stamm, der das Adhäsin AfaE exprimiert und haben viel höhere Invasion Fähigkeiten in epithelialen Zellen im Vergleich zu dem Stamm 28 M90T verwenden. Zu beachten ist, die M90T AFAI Stamm wurde noch nicht in vivo unter Verwendung von Zebrafisch getestet. Platten von Shigella-Kolonien können bei 4 ° C für 2-3 Tage gehalten und für verschiedene Experimente verwendet werden. Im Laufe der Zeit wurden Kolonien von Shigella, die die Virulenz-Plasmid können die Kongorot absorbieren und erscheinen verloren haben, ihre Virulenz-Plasmid beibehalten haben. Aus diesem Grund empfehlen wir, frische Bakterienbestände verwenden, wenn möglich. Bei der Überwachung der Zellbiologie der Infektion in vivo, in den Abschnitten 3 und 4 verwenden Wildtyp-AB-Linie Zebrafisch beschriebenen Protokollen. Um Shigella -leukocyte Wechselwirkungen zu überwachen, können transgenen Zebrafischlinien verwendet werden, zB MPX: GFP oder Lyz: DsRed, um visuelleize Neutrophilen 19,29,30 oder MPEG1: mCherry zu Makrophagen 19,31 visualisieren. Autophagie in vivo sichtbar zu machen, kann das GFP-transgenen Linie Lc3 Zebrafisch 19,24 verwendet werden, wie in Abschnitt 3.8 beschrieben. Autophagie in vivo zu stören, hat die effektive Dosis Morpholino Oligonukleotid experimentell geprüft werden auf der Grundlage ihrer Effizienz Transkript Spleißen oder Proteintranslation zu hemmen. Es ist ratsam, eine Titration Experiment durchzuführen und die Erschöpfung durch RT-PCR (für Splice Morpholino-Oligonukleotid) bestätigen oder durch SDS-PAGE (für die translationale Morpholino-Oligonukleotid) 32. RNA-Isolierung aus Zebrafisch Embryonen oder Larven können mit Hilfe Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion werden. Um Protein aus Zebrafisch-Larven (8 bis 15 Larven / Rohr) zu extrahieren, mechanisch zu homogenisieren mit einem Stößel in 200 ul Lysepuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% Octylphenol Ethylenoxid Kondensate, und Protease-Inhibitor). Zentrifugenröhrchen bei 19.000 × g bei 4 ° C für 15 min und den Überstand in ein neues Röhrchen. Hinzufügen Laemmli-Puffer und Erwärmung der Probe bei 95 ° C für 15 min. Lysate können bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt, und kann durch Western-Blot wie in Abschnitt 2.3 beschrieben, bewertet werden. Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die in vivo Anwendung Droge. Analyse mittels Morpholino-Oligonukleotide mit etablierten Medikamenten ergänzt werden, um die Autophagie (zB Rapamycin und Bafilomycin) zu manipulieren. Nicht infizierten und / oder infizierten Larven können mit Rapamycin (1,5 uM) oder Bafilomycin (80 nM) in E2 verdünnt und autophagischen Fluss kann durch Western-Blot wie in 25,33 beschrieben, bewertet werden behandelt werden. Die Folge der Autophagie Manipulation auf das Ergebnis der Infektion und das Überleben der infizierten Larven, wie in Abschnitt 3.5 beschrieben ausgewertet werden. Neben dem Studium WirtszelleDeterminanten, in vitro und in-vivo-Protokolle können angewendet werden, um bakterielle Determinanten für die Autophagie Anerkennung erforderlich beurteilen, mit bakteriellen Mutanten-Stämme, die unterschiedlich von Autophagie erkannt werden, zB., Shigella ΔicsA (die Shigella Protein IcsA rekrutiert N-WASP und dann Arp2 / 3 für Aktin Schwanz und septin Käfig Bildung, in seiner Abwesenheit, in seiner Abwesenheit kann es keine Aktin-Schwänze, keine septin Käfige) und ShigellaΔicsB (Shigella vermeidet die Autophagie Antwort über das bakterielle Protein-Effektor ICSB, die die Einstellung von Autophagie Maschinen IcsA verhindert sein kann es mehr septin Käfige, mehr Autophagie) 7,8 sein. Shigella keine natürliche Erreger der Zebrafisch und wächst optimal bei 37 ° C aufweist. Allerdings hat Arbeit, die Virulenzfaktoren für Shigella Invasion erforderlich gezeigt, die Flucht aus dem phagocytic Vakuole und Replikation in den cyTosol ausgedrückt werden und sind funktional in Zebrafisch-Larven bei 28 ° C 19. 28 ° C ist die am häufigsten verwendete Temperatur für Zebrafisch Aufzucht und Standardtemperatur auf Normal Zebrabärblingentwicklung 23 zu gewährleisten. Auffallend sind die großen Ereignisse, die zu pathogenen Bakterienruhr beim Menschen führen (dh Makrophagen-Zelltodes, Invasion und Vermehrung in Epithelzellen, Zell-zu-Zell-Ausbreitung, entzündliche Zerstörung der Wirts Epithel) treu in der Zebrafisch-Modell der Shigella-Infektion wieder 19. Autophagie und Zytoskelett-Gene werden ubiquitär exprimiert und haben eine breite Palette von biologischen Funktionen. Maus-Studien haben gezeigt, dass Knockout von wesentlicher Autophagie 26 oder septin Gene 5 embryonal letalen gezeigt, und es ist wahrscheinlich, dass einige dieser Gene wird auch wichtig für die Zebrafisch-Entwicklung (sein, obwohl dieses Problem durch die Tatsache, dass mehrere Zebrafisch reduziert werden soll,paraloge Gene 33). Wenn ja, gibt es mehrere Alternativen, um dieses Problem, einschließlich (i) der Nutzung von pharmakologischen Reagenzien Autophagie und das Zytoskelett regulieren, (ii) Morpholinos können unten titriert werden, zu überwinden, kann (iii) Knockout von Genen, die für nur bestimmte Zelle ausgelegt werden Typen, und / oder (iv) Gene in autophagischen Erkennung beteiligt, die nicht wesentlich für Tier Entwicklung sind (zB., p62) kann ausgerichtet sein. Während der Zebrafisch ist ein ideales Modellsystem, um die Autophagie und das Zytoskelett während Shigella-Infektion zu untersuchen, werden molekulare Werkzeuge derzeit fehlt. Das Feld muss neue Werkzeuge und Antriebs Zell-spezifische Expression der Proteine ​​von Interesse zu generieren. Niederschlagen Ausdruck der Autophagie / Zytoskelett Gene werden neue Morpholino-Sequenzen erforderlich, und neue Methoden zur Genomtechnik (zB TALEN, CRISPR / Cas9) können ebenfalls verwendet werden. In der Zwischenzeit mehrere Werkzeuge zuvor für Mensch oder Maus-Studien erzeugtgleichermaßen für Zebrafisch arbeiten. Die intrazellulären Bakterien S. flexneri hat als außergewöhnlichen Modellorganismus, um zentrale Fragen in der Biologie, einschließlich der Fähigkeit von Bakterien, die durch das Immunsystem erkannt werden 1,2 adressieren entstanden. Die Wirtszelle beschäftigt Septine auf die Motilität von S. beschränken flexneri und Ziel sie Autophagie, eine kritische Komponente der Zelle autonome Immunität 7,8. Diese Beobachtungen legen nahe, einen neuen Rahmen für die molekulare Autophagie und ihre Fähigkeit, Bakterien abgebaut zytosolischen studieren. Ein großes Problem ist jetzt vollständig entschlüsseln die molekularen und zellulären Vorgänge, und diese Ereignisse in vitro während bakterielle Infektion in vivo analysiert mit relevanten Tiermodellen validiert. Zu diesem Zweck hat der Zebrafisch als wertvolle neue Host für die Analyse von S. etabliert flexneri Infektion 19. Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen können mit hoher Auflösung abgebildet werden, undder Zebrafisch-Modell sollte zum Verständnis der Zellbiologie von Shigella-Infektion in vivo nachzuweisen. Zebrafisch-Larven können verwendet werden, um die Rolle von bakteriellen Autophagozytose der Wirtsabwehr zu untersuchen, und die Arbeit hat gezeigt, dass die Störung Autophagozytose nachteilig in Reaktion auf Shigella Infektion 19 beeinflussen Host Überleben. Die Beobachtungen aus der Studie von Shigella erzeugt, Septin Käfighaltung und Autophagie in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen und in vivo mit Zebrafisch-Larven könnten grundlegende Fortschritte im Verständnis der Wirtsabwehr liefern. Sie könnten auch darauf hin, die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten ausgerichtet. Eine kritische Ziel dieses Berichts ist es, Sinn der molekularen und zellulären Vorgänge in vitro analysiert machen (dh Autophagie, Actin Schwänze, Septin Käfighaltung) während bakterielle Infektion in vivo im Rahmen einer entire Organismus, mit Zebrafisch-Larven. Wenn nicht mit Zebrafisch-Biologie und der Handhabung vertraut ist, kann man in die Tiefe Protokolle für die richtige Haltung Zebrafisch 23 und in vivo Analyse der Zebrafisch-Infektion 19,35 beziehen.

Shigella flexneri, ein Gram-negatives Bakterium invasive enteropathogenen, kann von Phagosomen in das Cytosol zu entkommen, und polymerisieren die Host-Aktin-Zytoskelett zu zytosolischen Immunantwort zu entgehen und zu fördern intra-und interzelluläre Bewegung 1,2. Trotz des Verständnisses von Aktin-basierte Motilität in vitro 3,4 haben die Mechanismen beschränken bakterielle Verbreitung in vivo nicht vollständig definiert wurde. Dies ist wichtig für ein besseres Verständnis der angeborenen Immunität und Wirtsabwehr. Septine, eine hoch konservierte Familie von Proteinen unter Metazoen sind Guanosintriphosphat (GTP) bindende Proteine, die in hetero-oligomeren Komplexen zusammen und bilden unpolaren Filamente, die mit zellulären Membranen und Zytoskelett 5,6 verknüpfen. Neuere Arbeiten haben entdeckt, dass infizierte Wirtszellen können Shigella aktinvermittelten Bewegung durch Abschottung Bakterien gezielt zu verhindern autophagy innerhalb Septin Käfige &quot;, enthüllt die ersten zellulären Mechanismus, der Aktin-basierte Motilität 7,8 entgegenwirkt. Eine große offene Feld der Untersuchung liegt nun in Septin Biologie und Infektion. Septin Montage, durch eine Vielzahl von Krankheitserregern hervorgerufen (zB Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kann als ein zentrales Thema in der Wirtsabwehr 5,12 entstehen. Autophagie, eine hoch konservierte intrazelluläre Abbauprozess wird als eine Schlüsselkomponente der Zell-autonome Immunität wegen seiner Fähigkeit, cytosolische Bakterien zum Lysosom 13,14 liefern angesehen. Allerdings ist die Rolle von bakteriellen Autophagie in vivo zu beschränken oder zu fördern bakteriellen Replikations bleibt schlecht verstanden 15,16. Der Zebrafisch (Danio rerio) als ein wirbel Modell für die Untersuchung von Infektionen auf, da sie optisch zugänglich ist,bei den Larvenstadien, wenn das angeborene Immunsystem ist bereits funktionelle 17,18. Neuere Arbeiten haben die Anfälligkeit des Zebrafisch-Larven S. gekennzeichnet flexneri, ein Paradigma für bakterielle Autophagie 15 und hat die Shigella -zebrafish Infektionsmodell verwendet, um die Manipulation der Autophagie für antibakterielle Therapie in vivo 19 studieren. Dieser Bericht bietet neue Tools und Tests zu studieren S. flexneri Wechselwirkungen mit Autophagie und dem Zytoskelett. In einem ersten Schritt, Protokolle zu überwachen Autophagozytose-Zytoskelett Interaktionen mit Shigella-Infektion des humanen epithelialen Zellinie HeLa beschrieben. Um die Rolle der Autophagie-Zytoskelett Interaktionen auf der Shigella Infektionsprozess in vitro zu beurteilen, Methoden Autophagozytose und Zytoskelett-Komponenten (mit siRNA oder pharmakologische Reagenzien) zu manipulieren sind. Neue Arbeit hat gezeigt, dass durch die Verwendung Shigella-Infektion of Zebrafisch-Larven können ähnliche Tests angewendet werden, um die Zellbiologie der Infektion in vivo zu untersuchen. Protokolle zu erstellen und zu infizieren Zebrafisch-Larven detailliert sind, und die Antwort der Gastgeber für Shigella-Infektion in vivo zu beurteilen, Protokolle, um festzustellen Host Überleben und bakterielle Belastung der infizierten Larven vorhanden sind. Methoden, um die Rekrutierung von septin und Autophagie Marker Shigella überwachen (entweder mit festen oder Wohnzebrafisch-Larven) und Methoden, um die Rolle dieser Prozesse in vivo zu testen [mit Morpholino-Oligonukleotide (in 1-4 Zell-Stadium Embryos injiziert) oder pharmakologische Reagenzien ( direkt mit dem Zebrafisch Badewasser zugesetzt)] werden ebenfalls diskutiert. Dieses Arbeitsprogramm wird voraussichtlich Einblick in die für die Kontrolle der Infektion durch cytosolische Wirtsreaktionen erforderlich Mechanismen aus.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillaren aus Borosilikatglas&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>Grober manueller Manipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ziege, Ameise-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI Transfektionsreagenz</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek Glasbodenschale</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM plus L-Alanyl-L-glutamin&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten-Abzieher&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,P-87</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-Tubulin, acetylierter Antikörper&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiharnstoff&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62/SQSTM1 Antikörper</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hartes Eindeckmedium mit DAPI&nbsp;</td><td>Vector Laboratoires</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von<em&gt; shigella flexneri</em&gt; zum autophagie-zytoskelett interaktionen zu untersuchen

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri ist ein intrazelluläres Pathogen, das von Phagosomen entkommen können, um das Zytosol zu erreichen, und polymerisieren die Host-Aktin-Zytoskelett, seine Beweglichkeit und Verbreitung zu fördern. Neue Arbeit hat gezeigt, dass Proteine ​​in Aktin-basierte Motilität beteiligt sind auch die Autophagie, eine intrazelluläre Abbauprozess von entscheidender Bedeutung für die Zell autonome Immunität verbunden. Auffallend ist, können Wirtszellen Aktin-basierte Motilität von S. verhindern flexneri durch Abschottung Bakterien in Septin Käfige &quot;und Targeting sie Autophagie. Diese Beobachtungen zeigen, dass ein vollständigeres Verständnis der Septine, eine Familie von filamentösen GTP-bindende Proteine, werden neue Einsichten in den Prozess der Autophagie bereitzustellen. Dieser Bericht beschreibt Protokolle Autophagie-Zytoskelett Interaktionen von S. verursacht überwachen flexneri in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen und in vivo mit Zebrafisch-Larven. Diese Protokolle ermöglichen Untersuchung der intrazellulären mechanisms, die Verbreitung von Bakterien auf molekularer, zellulärer und ganzen Organismus-Ebene steuern.

Bei Infektion von Gewebekulturzellen in vitro, S. flexneri aus dem Phagosom entkommen und dringen in das Cytosol. Im Cytosol können Wirtszellen, die das Actin-basierte Motilität von Shigella durch Abschottung Bakterien in septin Käfige (1A) zu verhindern. Bakterien septin Käfigen eingeschlossenen kann auch durch Autophagozytose Marker p62 (1B) und LC3 (1C) gekennzeichnet werden. Diese Beobachtungen unterstreichen einen neuen Mechanismus der Immunabwehr, die Verbreitung von Krankheitserregern invasive beschränkt, und auch zeigen, neue Verbindungen zwischen Autophagie und dem Zytoskelett. Auffallend ist, dass die Erschöpfung der Autophagie Marker deutlich reduziert septin Käfighaltung von Bakterien (2A), und die Arbeit hat auch gezeigt, dass der Abbau der Käfighaltung septin Rekrutierung von Autophagie-Marker 8 deutlich reduziert. Somit sind zumindest im Fall von Shigella, septin Kranz und Autophagosom formation können als voneinander abhängige Prozesse betrachtet werden. Anderen zellulären Anforderungen Kompartimentierung von Shigella septin Käfige umfassen Aktin-Polymerisation und Aktomyosin Aktivität (2B). Es gibt keine natürliche Mausmodell der Bakterienruhr, und Untersuchung von Shigella Pathogenese, septin Biologie und bakterielle Autophagie in vivo kann von einem neuen Tiermodell der Infektion, dem Zebrafisch-Larven 19 profitieren. Es ist möglich, Zebrafisch-Larven durch Injizieren Bakterien in verschiedenen anatomischen Stellen zu infizieren, wie intravenöse Injektionen für die Schwanz Überleben Experimente und Schwanzmuskel Injektionen in vivo-Mikroskopie (Abbildung 3A). Abhängig von der Dosis, S. flexneri injiziert im Zebrafisch-Larven können entweder innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion gelöscht werden, oder kann in einer fortschreitenden und letztlich tödlichen Infektion (3B - 3D) führen. Shigella Virulenzfaktoren factors werden bei 28 ° C, die optimale Wachstumstemperatur von Zebrafisch exprimiert und Zebrafisch Infektion mit Shigella ist streng abhängig von seinem Typ III-Sekretionssystem (T3SS) 19, eine wesentliche Determinante der Virulenz in der menschlichen Krankheit. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass der Zebrafisch-Larve eine wertvolle neue Host für die in vivo-Analyse von Shigella-Infektion. Die optische Zugänglichkeit der Zebrafisch-Larven ermöglicht die Visualisierung von septin Käfighaltung in vivo (4A), eine Leistung, die noch nie zuvor mit Säugerwirt Modelle erreicht wurde. Um Beweise zu ergänzen, dass septin Käfige einschließen Bakterien Autophagie in vivo gezielt, kann man transgenen Zebrafischlarven infizieren, die GFP-Lc3 und beobachten Autophagie Marker Rekrutierung Shigella (4B). Für ultrastrucutral Analyse von Shigella Autophagosomen in vivo, elEctron Mikroskopie verwendet werden, um deutlich die cytosolische Sequestration von Bakterien durch Doppelmembran Vakuolen 19 werden. Autophagie wird als eine Schlüsselkomponente der Zell-autonome Immunität und einem entscheidenden Abwehrmechanismus gegen Bakterien intracytosolic 14-16 angesehen. Autophagie-Funktion in vivo zu charakterisieren, kann p62 Morpholino-behandelten Zebrafisch-Larven eingesetzt werden. Im Unterschied zur Kern Autophagie Maschinen [zB., Die Autophagie 36 verwandte Proteine ​​(ATG) 26], ist p62 nicht essentiell für die Entwicklung von Wirbeltieren und damit 27 Zebrafisch-Larven können in der Regel vor der Infektion zu entwickeln. Auffallend ist, dass p62-verarmten Larven mit S. beimpft flexneri Ergebnis signifikant erhöhte Sterblichkeit und eine erhöhte bakterielle Belastung 19. In Abstimmung mit in-vitro-Arbeiten zeigen, dass septin Kranz ist interdependent mit Autophagosom Bildung 7,8 wird septin Rekrutierung Shigella deutlich in p62-verarmten Larven reduziert ( <strong&gt; 4C). Diese Daten zeigen, daß Zebrafisch Überleben hängt von p62-vermittelten Autophagozytose intrazelluläre bakterielle Infektion zu kontrollieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Die septin Käfig in vitro. (A) HeLa-Zellen wurden mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT9 und Phalloidin markiert und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 1 um. (B) HeLa-Zellen infiziert mit S. flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen p62 und SEPT2 beschriftet und durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 1 um. (C) HeLa-Zellen mit GFP-ATG8 / LC3 transfiziert, mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT2 von Fluoreszenzlicht km markiert und bebildertMikroskopie. Maßstabsleiste, 1 um. Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 7 modifiziert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Cellular Anforderungen für Shigella -septin Käfig Bildung. (A) HeLa-Zellen wurden mit Kontroll behandelt (CTRL), p62, ATG5, ATG6 oder ATG7 siRNA. Ganz Zelllysaten von siRNA-behandelten Zellen wurden für GAPDH, p62, ATG5, ATG6 oder ATG7 immungeblottet, um die Effizienz von siRNA Erschöpfung (oben) zeigen. siRNA-behandelten Zellen wurden mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, festgelegt, und für die quantitative Mikroskopie markiert. Graphen (unten) stellen den Mittelwert ± SEM% innerhalb von Shigella SEPT2 Käfige aus n ≥3 Experimente pro Behandlung. (B) HeLa-Zellen wurden mit S. infiziert flexneri, mit DMSO behandelt, Cytochalasin D (CytD), Latrunculin B (LATB), Nocodazol (Noco) oder blebbistatin (Bleb) und nach 4 h 40 min wurden fixiert und für die quantitative Mikroskopie bezeichnet. Diagramme stellen den Mittelwert ± SEM der% Shigella innerhalb SEPT2 Käfige aus zwei unabhängigen Experimenten pro Behandlung. Diese Zahlen wurden aus Mostowy et al 7 geändert. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Der Zebrafisch-Modell von Shigella-Infektion. (A) Bilder, um die Orientierung des Zebrafisch-Larve unter dem Stereomikroskop zu veranschaulichen. (Links) Zebrafisch-Larven 72 Stunden nach der Befruchtung wurden seitlich in der Einspritzplatte mit ihrer Rückenseite nach der Injektionsnadel positioniert. (Mitte) Infektion der Blutbahn wurde von inj durchgeführtektierende die Bakterien (rot-Lösung) in die Schwanzvene, hinter der urogenitalen Öffnung. (Rechts) Infektion in den Schwanz Muskel wurde durch Injektion der Bakterien (rote Lösung) über einen Somitengeführt. (B) Überlebenskurven von 72 Stunden nach der Befruchtung Larven mit verschiedenen Dosen von S. spritzt flexneri und bei 28 ° C für 48 Stunden nach der Infektion inkubiert. Die effektive Impfstoff wurde entsprechend niedrig (&lt;10 3 CFU, offene Kreise), mittlere (~ 4 x 10 3 CFU, offene Dreiecke) oder hoch (~ 10 4 CFU, offene Quadrate) eingestuft. Bedeuten% ± SEM (horizontale Balken) von n ≥3 Experimente pro Inokulum Klasse. (C) Aufzählung von lebenden Bakterien in Homogenaten aus einzelnen Larven zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion durch Ausstreichen auf LB gemessen Hinweis, nur Larven mit der Infektion sind in Aufzählung Analyse einbezogen überlebt. Mittelwert ± SEM (horizontale Balken) ebenfalls dargestellt. (D) Verteilung der GFP-Shigella bestimmt durchLive-Bildgebung mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit einem niedrigen, mittleren oder hohen Dosis Impfstoff (Schwanz intravenöse Injektionen). Overlay-Transmissionsbild (grau) und GFP-Fluoreszenz (grün) (B) -. (D) Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 19 geändert. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Die Zellbiologie der Shigella-Infektion in vivo. (A) Zebrafisch-Larven wurden in den Schwanz Muskel mit GFP-Shigella (niedrige Dosis) für 24 Stunden, fest, mit Antikörpern gegen SEPT7 (rot) und GFP-markierten (grün infiziert ) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 5 um. (B) GFP-Lc3 Zebrafisch-Larven mit mCherry- Shigella (mittlere Dosis) für infiziert4 h fixiert, mit Antikörpern markiert gegen mCherry (rot) und GFP (grün) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Oder p62 (rechtes Bild) wurden mit GFP-Morpholinos Shigella 4 Stunden (mittlere Dosis) infiziert, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT7 (beschriftet. Entweder mit Steuer (linkes Bild CTRL) Maßstab, 1,5 um (C) Zebrafisch-Larven behandelt rot) und GFP (grün) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Pfeile markieren einige Beispiele von Shigella in septin Käfige (CTRL) oder nicht eingeschlossen (p62 abgereichertem) ein 4 Stunden nach der Infektion. Maßstabsleiste, 5 um. Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 19 geändert.

Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intrazelluläre Mechanismen zu untersuchen, die die bakterielle Verbreitung während einer Infektion in vitro und in vivo kontrollieren, unter Verwendung von Zellkulturen in Zebrafischlarven. Die in-vitro-Methode beginnt mit der Herstellung von cha flexner, einem gramnegativen und enteroinvasiven bakteriellen Pathogen. Anschließend werden Zellen infiziert, und entweder irna oder pharmakologische Reagenzien werden eingesetzt, um die autophagiebezogene Maschinerie und das Zytoskelett des Wirts während der Infektion zu beeinflussen. Um die durch cha verursachten Wechselwirkungen zwischen Autophagie und Zytoskelett in vivo zu untersuchen, werden Zebrafischembryonen drei Tage nach der Befruchtung infiziert, und zwar für beide Methoden.Der letzte Schritt besteht darin, Gewebe mit Autophagie- und Zytoskelettmarkern zu markieren. Letztendlich werden die Ergebnisse Einblicke in die Mechanismen liefern, die für die Kontrolle der Infektion durch zytoplasmatische Wirtsantworten erforderlich sind. Der Vorteil der Verwendung von Gel zur Untersuchung der bakteriellen Autophagie im Vergleich zu anderen Bakterien wie Listeria liegt darin, dass gezielte Autophagie im Gel auch in eingeschlossenen Käfigen gefangen werden kann.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Autophagie beantworten, beispielsweise welche Rolle das Cytoskelett in der Autophagie spielt und welche Rolle die Autophagie bei der Einschränkung oder Förderung intrazellulärer Bakterien hat. Die Auswirkungen dieser Technik können sich auch auf andere autophagische Prozesse erstrecken, wie beispielsweise die Autophagie von Viren oder Mitochondrien, und könnten zudem therapeutische Implikationen für menschliche Erkrankungen mit einem Septin- oder Autophagie-Anteil haben. Dies sind Demonstrationen an Zebrafischen.Die Infektion mit Shige ist entscheidend, da die Schritte zur Injektion von Zebrafischen mit Bakterien schwer zu erlernen sind, da die Vorbereitung der Nadeln und die korrekte Injektion Zeit und hohe Präzision erfordern. Die Mikroskopie der Zebrafisch-Infektion erfordert Erfahrung für dieses Protokoll. Verwenden Sie den Wildtyp-Stamm von Cha Flexner M nine DT aus einer gefrorenen Glycerin-Stammlösung, streichen Sie die Bakterien auf Congo-Rot-Triptych-Soja-Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Außerdem Hella-Zellen am folgenden Tag in sechs-Well-Platten in MEM-Medium mit 10 % Fötales Kalbserum ansäen. Einen einzelnen Kolonie auswählen und am nächsten Tag über Nacht in TCS-Medium bei 37 Grad Celsius mit Schütteln kultivieren. Unterstämme durch Ansetzen einer 1:80-Verdünnung in frischem TCS herstellen.Wenn die optische Dichte der Unter­kulturen bei 600 Nanometern zwischen 0,3 und 0,6 liegt, sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1000 ×g für fünf Minuten ein. Re­suspendieren Sie dann das bakterielle Pellet in MEM auf dieselbe optische Dichte.Hallo, die Zellen sollten direkt mit einer Multiplizität der Infektion von 100 zu eins infiziert werden. Geben Sie das in MEM verdünnte Chag zu den platzierten Hella-Zellen und stellen Sie das Gesamtvolumen an MEM auf zwei Milliliter pro Vertiefung ein. Um die bakterielle Adhärenz an die Wirtszellen zu maximieren, zentrifugieren Sie die Platten bei 700 ×g für 10 Minuten und inkubieren Sie die Platten anschließend bei Raumtemperatur für 30 Minuten, damit die Bakterien die Zellen nach der Infektionsphase infizieren können.Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal. Um extrazelluläre Bakterien weiter zu entfernen, inkubieren Sie die Zellen basierend auf empirischen Beobachtungen ein bis vier Stunden in frischem MEM mit Gentamycin-haltigem kompletten Medium. Anschließend fixieren und markieren Sie die infizierten Zellen.Bilden Sie sie mittels epifluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie mit einem 63x- oder 100x-Objektiv ab, um die DAPI-markierten Septin-Käfige aufzulösen, die als ringförmige Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 0,6 Mikrometern sichtbar sind und cytosolische Bakterien umgeben, die Aktin polymerisieren. Die Bakterien innerhalb der Septin-Käfige können ebenfalls durch Autophagie-Marker wie p62 und LC3 identifiziert werden. Konzeptionell ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens die Identifizierung bakterieller Autophagosomen und Septin-Käfige in vivo und in vitro, was eine sorgfältige Mikroskopie und Analyse erfordert.Außerdem muss sichergestellt werden, dass die geeignete Anzahl von Ereignissen über mehrere biologische Wiederholungen hinweg analysiert wird, um eine statistische Signifikanz zu gewährleisten, nachdem die Hella-Zellen mit Chila infiziert wurden. Zunächst sollten die Bakterien mindestens zweieinhalb Stunden Zeit erhalten, um in das Cytosol vorzudringen. Anschließend kann die Behandlung mit einem Wirkstoff zur Beeinflussung des Cytoskeletts erfolgen.Geben Sie zwischen ein und fünf Mikroliter verdünnten Wirkstoff-Stammlösung zu jeweils zwei Millilitern Medium mit Zellen als Negativkontrolle hinzu. Behandeln Sie einen Satz von Zellen mit DMSO in MEM und inkubieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten lang, um den autophagischen Fluss der Zellen zu beeinflussen. Verwenden Sie 20 Nanomolar Rapamycin oder 160 Nanomolar Bafilomycin.Im Anschluss die Zellen vier bis zwölf Stunden nach der Behandlung inkubieren. Die Zellen fixieren und markieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Diese Technik modelliert die Geleinfection und die Wechselwirkungen zwischen Autophagie und Cytoskelett in vivo. Um mit der Subkultur zu beginnen und das Gel wie zuvor beschrieben zu sammeln, die Bakterien mit einem XPBS waschen und bei 1000 ×g zehn Minuten lang zentrifugieren.Suspenderen Sie die Bakterien anschließend in 80 Mikrolitern 0,1 % Phenolrot in PBS. Bewahren Sie diese Zubereitung auf Eis auf. Sie sollte etwa 2000 Bakterien pro Nanoliter enthalten, 72 Stunden vor der geplanten Injektion. Sammeln Sie Embryonen von laichenden Zebrafischen, um eventuelle extrazelluläre Kontaminationen zu entfernen.Spülen Sie die Embryonen in E2-Medium mit 0,003 % Bleichmittel zehn Minuten lang. Nach zehn Minuten wechseln Sie zu E2-Medium und spülen die Embryonen fünfmal in E2. Danach füllen Sie 10 cm-Dishs mit 50 Milliliter E2 und bis zu 50 Embryonen. Züchten Sie insgesamt etwa 100 Embryonen bei 28 Grad Celsius, 24 Stunden nach der Befruchtung. Behandeln Sie die sich entwickelnden Embryonen mit 0,003 % Phenothrea in E2, um Melaninbildung zu verhindern, die die Mikroskopie stören würde. Beginnen Sie damit, die 72-stündigen Larven mit einem 200 µg/mL Trica-Bad in E2-Medium zu anästhesieren.Danach mit einem Mikromanipulator und feinen Pinzetten die Spitze der Mikroinjektionsnadel brechen und den Bruch unter dem Mikroskop überprüfen. Laden Sie nun zunächst die Nadel, übertragen einen Tropfen der Bakterienkultur auf ein Deckglas auf dem Mikroskoptisch. Zweitens schalten Sie den Mikroinjektor und die Gasflasche ein.Drittens senken Sie die Nadelspitze in den Tropfen ab. Und viertens füllen Sie die Nadel, um das Überleben von Zebrafischen während einer Cha-Infektion zu bewerten. Verwenden Sie eine intravenöse Injektion mit Hilfe eines feinen Pinsels.Platzieren Sie die anesthetisierten Larven seitlich auf der Injektionsplatte, wobei ihre dorsalen Seiten in Richtung der Nadel zeigen. Nun muss die Nadelspitze nahe der Urogenitalöffnung ausgerichtet sein, wobei das Ziel die Coddle-Vene ist. Danach die Haut durchstechen und einen Bolus von einem Fünftel Nanoliter Bakterien injizieren.Eine erfolgreiche Injektion in die Caudalvene zeigt sich durch die Sichtbarmachung von Phenolrot, das sich entlang der Vene ausdehnt. Technisch gesehen ist die Injektion in die Caudalvene der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens, weshalb Übungs-Zebrafischembryonen erforderlich sind. Die konfokale Mikroskopie kann ebenfalls herausfordernd sein, da die Larven eine geeignete Betäubung erfordern.Nach den Injektionen überführen Sie jede infizierte Larve einzeln in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte, die ein Milliliter E2-Medien enthält. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius und überwachen Sie die Embryonen täglich. Um die Rekrutierung von Septin- und Autophagie-Markern zu visualisieren.Spritzen Sie Ella an lokalisierten Stellen wie dem Schwanzmuskel ein. Bereiten Sie die Injektion der Larven wie im vorherigen Abschnitt gezeigt vor. Positionieren Sie den Zebrafisch seitlich und setzen Sie die Nadel über dem Muskel an.Die Somiten durchbohren dann den Raum zwischen zwei Somiten und injizieren etwa einen Nanoliter Ella. Eine erfolgreiche Injektion in die Schwanzmuskulatur zeigt, dass die injizierte Somit rot gefärbt ist. Aufgrund des Phenolrot-Puffers wurde niedrigschmelzendes 0,1 %iges Agarose in E2-Medium bei 37 Grad Celsius vorbereitet.Geben Sie Tropfen Agarose einzeln in eine Glasbodenkammer. Überführen Sie die injizierten Larven mit einem minimalen Lösungsvolumen auf die Agarosetropfen. Richten Sie sie dort nach Wunsch aus und lassen Sie die Agarose erstarren.Danach die gesamte Schale mit LMA abdecken, gefolgt von E zwei mit Trica. Anschließend alle zwei Minuten über mehrere Stunden hinweg Zacks einnehmen. In infizierten Zellkulturen entweicht Shaila aus dem Phagosome in das Cytosol, wo das Wirtscytoskelett die Bakterien in septinähnlichen Käfigstrukturen umordnen und kompartimentalisieren kann.Bakterien, die in Septin-Käfigen gefangen sind, werden durch Autophagie-Marker wie p62 und LC3 erkannt. Der Zebrabärbling stellt einen wertvollen neuen Wirt für die In-vivo-Untersuchung einer CHA-Infektion dar. Abhängig von der infektiösen Dosis können Zebrabärblinge eine geringe Dosis innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion eliminieren oder im Fall einer hohen Dosis an der Infektion sterben.Die optische Transparenz des Zebrafisches ermöglicht die In-vivo-Visualisierung von Septin-Käfigen, eine Leistung, die mit anderen Wirbeltiermodellen bisher nicht erreicht wurde, um Belege dafür zu ergänzen, dass Septin-Käfige Bakterien einfangen, die für den Autophagieprozess bestimmt sind. GFP-LC3-transgene Zebrafische wurden infiziert, um die Rekrutierung LC3-positiver Autophagosomen zu intrazellulärem Chal in Echtzeit in vivo zu beobachten, um die Autophagie zu charakterisieren. P62-morphant behandelte Larven wurden mit Chal oder Kontrolle injiziert. Morphant-Larven zeigten normale Septin-Käfig-Strukturen.Jedoch war bei den P 62-morpho-behandelten Larven die Rekrutierung von Septin zu Chala verringert, was darauf hinweist, dass P 62 eine essentielle Komponente des Autophagie-Mechanismus ist. Sobald die Infektion gemeistert ist, kann die PHI-Larve innerhalb von ein bis zwei Tagen durchgeführt werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Andere Methoden wie die Genom-Editierung unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems können genutzt werden, um das Zebrafisch-Genom zu verändern. Außerdem können neuartige fluoreszenzmarkierte Zebrafisch-Linien entwickelt werden, um die Dynamik des Autophagie-Zytoskeletts in Echtzeit während der Infektion im Gel mithilfe von Live-Bildgebung nach der Entdeckung zu verfolgen.Der Chaga-Septin-Käfig wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Autophagie und Zytoskelett zu untersuchen, und hat Forschern auf den Gebieten Infektions- und Zellbiologie den Weg geebnet, um neue Funktionen des Zytoskeletts in der Autophagie aufzuklären. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ella äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Labor der Sicherheitsstufe zwei sollten stets getroffen werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

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Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.<br...

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca2 +) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca2 + fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca2 + Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Lernen Sie Methoden zur Untersuchung von Autophagie-Zytoskelett-Interaktionen bei Shigella flexneri-Infektionen in Zellkultur und Zebrafisch-Larven. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeit-Visualisierung von Septin-Käfigen.

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