Name: EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von Saccharomyces cerevisiae Nar1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Erfahren Sie die EPR-Wächter-Redox-Titration zur Charakterisierung von Cofaktoren in Saccharomyces cerevisiae Nar1. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von Mittelpunktpotentialen redoxaktiver Zentren in komplexen Proteinen.

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Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von der Dutch National Research School Kombination, Katalyse durch Chemical Design (NRSC-Katalyse) Kontrollierte unterstützt. Dr. HY Steensma und Dr. GPH van Heusden an der Universität Leiden sind für ihre Unterstützung bei der rekombinanten Expression von S. anerkannt cerevisiae Nar1.

1. Vorbereitung der Einrichtung und Lösungen <ol><li> Bereiten Pufferlösung, die 100 mM Tris, 250 mM NaCl und 10% Glycerin bei pH 8,5. Entlüften Sie die Puffer durch Spülen mit Argon. Führen Sie den Puffer in einer anaeroben Kammer. </li><li> Teilen Sie den Puffer in zwei Bereiche. Zu einer Portion (Puffer A) in 1 mM DL-Dithiothreit (DTT, M r 154.25 g / mol) und 1 mM L-Cystein. Der andere Teil (Puffer B) enthält keine Reduktionsmittel. </li><li> Bereiten Oxidations- und Reduktionslösungen. Auffüllen auf 1 ml Lösung von 2, 20 und 200 mM Kaliumferricyanid (FIC, M r 329,26 g / Mol) und Natriumdithionit (SD, M r 174.11 g / mol) in anaeroben Puffer B. </li><li> Bereiten Vermittler Mischung wie folgt: <ol><li> Hinzufügen 160 uM von jedem der folgenden Redoxmediatoren und 50 mM NaCl Puffer B: N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E &#39;0 0,276 V) , 2,6-Dichlorphenol-Indophenol(DCIP, M r 290,08 g / mol, E &#39;0 0,217 V), Phenazinethosulfat (PES, M r 334,4 g / mol, E&#39; 0 0,055 V), Methylenblau (M r 319,85 g / mol, E &#39; 0 0,011 V), Resorufin (M r 235,17 g / mol, E &#39;0 -0,051 V), Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, E&#39; 0 -0,125 V), 2-Hydroxy-1,4-naphtaquinone ( M r 174.15 g / mol, E &#39;0 -0,145 V), Anthrachinon-2-sulfonat (M r 328,28 g / mol, E&#39; 0 -0,225 V), Phenosafranin (M r 322,8 g / mol, E &#39;0 -0,252 V), Safranin O (M r 350,84 g / mol, E &#39;0 -0,280 V), Neutralrot (M r 288,8 g / mol, E&#39; 0 -0,340 V), Benzylviologen (M r 409,4 g / mol, E &#39;0 -0,350 V) und Methylviologen (M r 257,16 g / mol, E&#39; 0 -0,440 V). </li><li> Wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie, die Vermittler zu schützens aus Licht. </li></ol></li><li> Herstellung von 10 mg / ml S. cerevisiae Strep-Tags Nar1 Protein (181 &amp; mgr; M r 55,2 kDa) in Puffer A Express S. cerevisiae Nar1 in E. coli als Strep-markierte Protein mit Hilfe eines pET24a Expressionsvektor. Reinige das Protein in einer anaeroben Kammer mit Strep-Tactin Chromatographiemedium (IBA) und reinigt unter Verwendung einer Protein-Reinigungssystem wie Akta Reiniger (GE Healthcare). </li><li> Bereiten Sie die Redoxtitration Setup in einer anaeroben Kammer wie folgt: <ol><li> Schließen Sie eine Ag / AgCl-Referenzelektrode und eine Platindrahtelektrode in das Titriergefäss. Verbinden Sie die beiden Elektroden mit einem Voltmeter, die von mV bis V messen kann </li><li> Legen Sie einen kleinen Rührstab. </li><li> Stellen Sie das Titriergefäss über einem Magnetrührer. </li><li> Füllen Sie das Titriergefäß mit Puffer B, Mittler-Mix-Lösung und Proteinlösung auf bis zu 2 ml, das heißt, um Endkonzentrationen von 72 &amp; mgr; M-Protein und 38 &amp; mgr; M von jedemVermittler. Hinweis: in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration und der erforderliche Mediatorkonzentrationen der Mengen der drei Lösungen angepasst werden. </li><li> Rühre 30 Minuten und schalten Sie das Voltmeter. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 10 saubere Quarzglasrohre EPR. Einführung der Rohre in der anaeroben Kammer. </li><li> Füllen Sie eine kleine (ca. 200 ml) mit flüssigem Stickstoff Dewar mit flüssigem Stickstoff. </li></ol> 2. Führen Sie Redoxtitration <ol><li> Warten, bis das Potential der Lösung stabil ist. Hinweis: In der Praxis bedeutet dies, dass das Potenzial driftet weniger als 1 mV pro Minute. </li><li> Notieren Sie sich das Potenzial durch das Voltmeter angegeben. </li><li> Zeichnen Sie die erste Probe von 200 ul und spritzen in ein EPR-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen mit einem Gummistopfen und entfernen Sie den Schlauch aus dem anaeroben Kammer. </li><li> Frieren Sie das Rohr in Flüssigstickstoff, wie folgt: Vorsicht! Dies muss langsam erfolgen, da sonst das Rohr zu brechen. <ol><li> Führen Sie zuerst die tip des Rohrs in den flüssigen Stickstoff. </li><li> Warten Sie, bis ein Zischen zu hören ist. Hinweis: Dies kann bis zu 10 Sekunden dauern. </li><li> Langsam fügen Sie den Rest der Röhre, so dass das Musterteil vollständig untergetaucht ist. </li></ol></li><li> Hinzufügen eines kleinen aliquoten 1-2 ul der 2 mM SD zu der Lösung in das Titriergefäss um das Potential der Lösung auf -0,6 V. abzusenken Hinweis: Wenn mehr als 10 &amp; mgr; l und hinzugefügt werden, der dem 20-mM-Lösung zu wechseln. Da es sehr schwierig ist, auf einen bestimmten Potentialwert poise werden die Ist auf dem Voltmeter zeichneten Werte notiert und verwendet, um die Titrationskurve zu konstruieren. </li><li> Zeichnen Sie eine Probe, wie in Schritt 2,3 bis 2,5 beschrieben. </li><li> Notieren Sie sich die tatsächliche Potenzial durch das Voltmeter angegeben. </li><li> Oxidationsmittel hinzuzufügen, bis das Potential von ca. 50 mV erhöht. Beginnen Sie, indem Sie einen kleinen aliquoten 1-2 ul der 2 mM FIC Lösung. Wenn mehr als 10 &amp; mgr; l und hinzugefügt werden, der dem 20-mM-Lösung zu wechseln. </li><li> Notieren Sie how viel der Lösungen wurde hinzugefügt. Hinweis: Dies ist notwendig, um für die Probenverdünnung während der Titration zu korrigieren. </li><li> Zeichnen Sie ein Muster wie in der Schritte 2,3-2,5 beschrieben. </li><li> Notieren Sie sich die tatsächliche Potenzial durch das Voltmeter angegeben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,9 und 2,12, bis das Potential Bereich von -0,6 V bis 0,2 V abgedeckt wurde und alle 10 EPR Röhren sind jeweils mit 200 ul gefüllt. Hinweis: Da das Volumen mit jedem Rücknahmen zu verringern ist die Positionierung der Elektroden muss unter Umständen angepasst werden, einen guten Kontakt mit der Lösung ohne Störung des Rühren. Es kann schwierig sein, das Potential nach der Entnahme der letzten Probe und damit das Potential dieser Probe möglicherweise weniger genau zu messen. </li><li> Wahlweise speichern die gefrorenen EPR Proben in flüssigem Stickstoff bis die EPR-Messungen stattfinden kann. </li></ol> 3. Messen Titration Samples Mit EPR-Spektroskopie und Datenanalyse <ol><li> Nehmen EPR-Spektren der verschiedenenTitration Proben wie folgt: <ol><li> Verwenden Sie eine Hochvakuumpumpe, um einen Quarz Kryostat auf &lt;10 -5 bar zu evakuieren. </li><li> Schalten Sie die Wasserkühlung des EPR Magnet. Öffnen die Strömung von trockener Luft durch das EPR Höhle. </li><li> Einschalten der Stromversorgung des Magneten und dem Rechner des EPR. </li><li> Führen Sie einen Frequenzkalibrierungsprogramm. Stellen Sie die EPR-Messparameter. Schließen Sie den Kryostaten auf das flüssige Helium-Dewar. Kühlen Sie den Hohlraum mit 9-16 K. </li><li> Einführung der EPR Probe in den Hohlraum. Notieren Sie sich die EPR-Spektrum. </li></ol></li><li> Identifizieren Sie die verschiedenen Arten EPR und verwenden Sie den besten Spektren, um die Signale zu quantifizieren. Erreichen EPR Quantifizierung durch doppelte Integration des Spektrums und Vergleich mit dem Spektrum von einer externen Kupferstandardlösung 10 mM CuSO 4/10 mM HCl / 2 M NaClO 4. 8 </li><li> Stellen Sie die Titrationskurve wie folgt: <ol><li> Zeichnen Sie die EPR-Signalamplitude in einem g-Wert, der charakteristisch für die para istmagnetische Spezies von Interesse gegen das Potenzial. </li><li> Ändern Sie das EPR-Signal Amplitudenskala, ein Spin / Molekül Skala mit Hilfe der EPR Quantifizierung von Schritt 3.2. </li><li> Korrigieren der Signalamplitude von jeder Probe für die Verdünnung, die durch die Zugaben von Oxidations- oder Reduktionsmittel stattgefunden hat. </li><li> Korrigieren das Potential für die Mittelpunktpotential der Ag / AgCl-Referenzelektrode. Anmerkung: Die Ag / AgCl Referenzelektrode (mit gesättigter KCl) ein Mittelpunktpotential von 0,194 V gegen die Standardwasserstoffelektrode (SHE) bei 25 ° C. Deshalb, wenn das Potential auf dem Voltmeter circa -0.6 V, das Potential mit Bezug auf die SHE -0,4 V. </li></ol></li><li> Setzen Sie das Signal an die Nernst-Gleichung wie folgt: Für eine Spezies, die paramagnetische im reduzierten Zustand ist: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> Für eine Spezies, die paramagnetischen in oxidized Zustand: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> Für eine Spezies, die paramagnetischen in einem Zwischenzustand ist: <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> Diese Gleichungen gelten für Redox-Reaktionen, bei denen ein Elektron übertragen wird, so dass n = 1. E = Potenzial in Volt E m = Mittelpunktpotential in Volt F = Faraday-Konstante = 96.480 C · mol -1 R = Gaskonstante = 8,314 J · K -1 · mol -1 T = Temperatur in Kelvin </li></ol>

<ol><li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLippard%2C+SJ+%22Principles+of+Bioinorganic+Chemistry%22">Principles of Bioinorganic Chemistry</a>. , University Science Books. (1994).</li>
<li>Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).</li>
<li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+Electrokinetics%3A+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li>
<li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li>
<li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+%28Hildenborough%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li>
<li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li>
<li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+%28CIA%29+System%3A+Factors%2C+Mechanism%2C+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li>
<li>Aasa, R., Vänngård, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes%5BTitle%5D)+AND+%22A+Reexamination.+J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li>
<li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nar1p%2C+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases%2C+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li>
<li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li>
<li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarase+A+from+Escherichia+coli%3A+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li>
<li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+Redox+Chemistry%3A+a+Re-evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li>
<li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+biomolecular+chemistry%22%5BJournal%5D)">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Reihe von 13 Redoxmediatoren ermöglicht eine Redoxgleichgewicht in der Lösung im Bereich von -0.45 bis +0,3 V gegen SHE (Tabelle 1 und Abbildung 3). Weit oberhalb und unterhalb dieser Potentiale alle Mediatoren entweder vollständig reduziert oder vollständig oxidiert und somit keine weitere Äquilibrierung mit den redox-aktiven Zentren des Proteins erfolgen kann. Dies ist ein wichtiger Begriff, wie in der Literatur manchmal Redoxtitrationen sind mit nur zwei oder drei Vermittler durc...

Auffällig ist, dass die grundlegenden chemischen Prozesse Erhaltung des Lebens auf diesem Planeten, die Photosynthese, die Stickstoff-Fixierung und die Atmung, werden von großen Proteinkomplexen, die eine breite Palette von organischen und anorganischen Redox-Cofaktoren katalysiert. Es wurde geschätzt, dass etwa 30% aller Proteine ​​eines oder mehrere Metall-Cofaktoren enthalten. 1,2 Identifizierung und Charakterisierung der Redox-Cofaktoren können durch direkte Elektrochemie (zB Proteinfilm Voltammetrie) oder Redox-Titration festgestellt werden. Die beiden Techniken ergänzen sich in ihrer Art und Anwendbarkeit. Voltammetrie bietet schnelle Bestimmung der Mittelpunktspotentiale und Elektronentransfer Kinetik der Kofaktoren, die mit einer Elektrodenoberfläche reagieren kann. 3,4 Normalerweise funktioniert gut für den Elektronentransfer-Proteinen wie Cytochrom c oder Ferredoxin. Und es funktioniert manchmal komplexer Proteine, die an einer Elektrodenoberfläche immobilisiert wurden. Detaillierte Kenntnisse über dieNatur Kofaktoren im Protein zur Verfügung stehen, da die Voltammogramm nicht geben keine direkte Information über die Identität der Co-Faktor. Redoxtitrationen sind mühsam durchzuführen und erfordern mg Proteinmengen. Sie bieten jedoch Informationen über die Mittelpunktpotential, und die Identität des Cofaktors. 5 ferner in einer einzigen Titration mehrere Cofaktoren in einem Protein kann überwacht werden. Das Prinzip einer Redoxtitration ist, dass die redoxaktive Protein oder Enzym chemisch reduziert oder oxidiert. Um sicherzustellen, dass die Co-Faktoren mit den Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel Redoxmediatoren werden verwendet, reagieren. Diese Redoxmediatoren reagieren auch mit einer Elektrode, so daß das Potential der Lösung gemessen werden kann. Die Mediatoren wirken als Redox-Puffer und äquilibrieren zwischen den Cofaktoren in dem Protein und der Elektrode. Nach chemisch poising das Potential auf den gewünschten Wert, wird eine Probe gezogen und schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren await weiteren Analyse mit spektroskopischen Methoden. EPR-Spektroskopie ist insbesondere in dieser Hinsicht nützlich, da sie zur quantitativen Messung paramagnetischen Metallzentren oder organische Reste sein. Die Redox-Titration kann in zwei Richtungen durchgeführt werden: von niedrig zu hoch oder von hoch auf niedrig Mittelpunktpotential. Die Wahl ist abhängig von der Stabilität der Cofaktoren im Studium. Oft ist es ratsam, auf niedrigem Potential starten und Oxidationsmittel, um schrittweise erhöhen das Risiko. Dies wird als ein oxidatives Titration und wird hier beschrieben. Hier zeigen wir die Redox-Titration des Eisen-Schwefel-Cluster mit Protein Nar1 aus Saccharomyces cerevisiae. Dieses Protein beteiligt ist, wahrscheinlich als Gerüstprotein, im Cytosol-Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese-Maschinerie (CIA-Weg). 6,7

<table><tbody><tr><td>Referenzelektrode (Ag/AgCl)</td><td>Radiometer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemikalien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPR-Spektrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -Tetramethyl-p-phenylendediamin (TMPD) & Middot; (HCl)2</td><td></td><td></td><td>637-01-4</td></tr><tr><td>2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DCIP), Natriumsalz</td><td></td><td></td><td>620-45-1</td></tr><tr><td>Phenazin-Ethosulfat (PES)</td><td></td><td></td><td>10510-77-7</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td></td><td></td><td>122965-43-9</td></tr><tr><td>Resorufin, Natriumsalz</td><td></td><td></td><td>34994-50-8</td></tr><tr><td>Indigodisulfonat (Indigokarmin)</td><td></td><td></td><td>860-22-0</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-1,4-naphtachinon</td><td></td><td></td><td>83-72-7</td></tr><tr><td>Anthrachinon-2-sulfonat Na+ H2O</td><td></td><td></td><td>153277-35-1</td></tr><tr><td>Phenosafranin</td><td></td><td></td><td>81-93-6</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td></td><td></td><td>477-73-6</td></tr><tr><td>Neutralrot</td><td></td><td></td><td>553-24-2</td></tr><tr><td>Benzyl viologen</td><td></td><td></td><td>1102-19-8</td></tr><tr><td>Methyl viologen</td><td></td><td></td><td>1910-42-5</td></tr></tbody></table>

epr wachte redox-titration der cofaktoren von<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Elektronenspinresonanz (EPR) überwacht Redoxtitrationen sind eine leistungsfähige Methode, um die Mittelpunktpotential von Kofaktoren in Proteinen zu bestimmen und in ihrer nachweisbaren Redoxzustand Identifizierung und Quantifizierung der Cofaktoren. Die Technik ist komplementär zur direkten Elektro (Voltammetrie) nähert, wie sie geben keine Information über Elektronentransferraten, aber die Identität und Redoxzustand der Cofaktoren in die untersuchte Protein. Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf jedes Protein, das eine paramagnetische Elektronenresonanz (EPR) nachweisbar Cofaktor. Eine typische Titration benötigt 2 ml Protein mit einem Cofaktor-Konzentration im Bereich von 1-100 uM. Das Protein wird mit einem chemischen Reduktionsmittel (Natriumdithionit) oder Oxidationsmittel (Kaliumferricyanid), um die Probe bei einer bestimmten Potential poise titriert. Ein Platindraht und eine Ag / AgCl-Referenzelektrode auf ein Volt angeschlossenMessgerät, das Potential der Proteinlösung zu messen. Ein Satz von 13 verschiedenen Redoxvermittler verwendet, um zwischen den Redox-Cofaktoren des Proteins und den Elektroden zu äquilibrieren. Proben werden bei verschiedenen Potentialen und der Elektronenspinresonanz-Spektren, charakteristisch für die verschiedenen Redox-Cofaktoren in die Protein gezogen, werden gemessen. Die Handlung der Signalintensität gegenüber dem Potential der Probe wird unter Verwendung der Nernst-Gleichung, um das Mittelpunktpotential des Cofaktors zu bestimmen.

Die Redox-Titration des Eisen-Schwefel-Cluster-enthaltenden Proteins Nar1 aus Saccharomyces cerevisiae, führte zur Identifizierung von drei verschiedenen Kofaktoren: Nar1: a [3Fe 4S] -Cluster, a [4Fe-4S] Cluster und eine einkernige Fe entfernt (Figur 1) . Die EPR-Signale werden durch ihre g-Werte gekennzeichnet: für die [3 Fe-4S] + g z 2.01 g Crossover 2,00 (1B); für die [4Fe-4S] +, g z 2,02 g y 1,93, g x</s...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR) überwachter Redox-Titrationen verschiedene Cofaktoren von Saccharomyces cerevisiae Nar1 zu identifizieren. Redox-Titrationen bieten eine sehr robuste Möglichkeit, Mittelwertpotentiale verschiedener redoxaktiver Cofaktoren in Enzymen und Proteinen zu erhalten.

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Redoxeigenschaften eines Enzyms oder Proteins zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Arbeits- und eine Referenzelektrode, die mit einem Voltmeter verbunden sind, in ein Redox-Titrationsgefäß über einem magnetischen Rührer eingeführt werden. Im zweiten Schritt werden Proteinpuffer und eine Mischung verschiedener Redoxmediatoren dem Titrationsgefäß zugegeben. Anschließend werden ein chemisches Reduktions- und Oxidationsmittel verwendet, um das Potential auf verschiedene Werte einzustellen, und Elektronenspinresonanz- oder EPR-Proben werden entnommen. Der letzte Schritt besteht darin, EPR-Spektren der Proben aufzuzeichnen und Titrationkurven zu erstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der vollständigen Telemetrie liegt darin, dass komplexe Proteine mit mehreren unterschiedlichen Cofaktoren leicht analysiert werden können.Um dieses Verfahren zu beginnen, verbinden Sie die Silber-Chlorid-Bezugselektrode und einen Platindraht mit einem Redox-Titrationsgefäß. Anschließend schließen Sie beide Elektroden an ein Voltmeter an, das Werte von Millivolt bis Volt messen kann. Geben Sie einen kleinen Rührstab hinzu und stellen Sie das Titrationsgefäß auf einen magnetischen Rührer.Füllen Sie als Nächstes das Titrationgefäß mit der zuvor hergestellten Puffer-B-Mediator-Mischlösung und Proteiniösung bis zu einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern, um Endkonzentrationen von 72 µM Protein und jeweils 38 µM an jedem Mediator zu erreichen. Nach 30-minütigem Rühren schalten Sie das Voltmeter ein. Geben Sie 10 saubere Quarz-EPR-Röhrchen in eine anaerobe Kammer.Füllen Sie dann einen kleinen Flüssigstickstoffbehälter mit flüssigem Stickstoff. Warten Sie, bis das Potential der Lösung stabil ist, und notieren Sie das anschließend vom Voltmeter angezeigte Potential. Entnehmen Sie die erste Probe von 200 Mikrolitern und injizieren Sie sie in ein EPR-Röhrchen.Verschließen Sie das Reagenzglas mit einem Gummistopfen und nehmen Sie es aus der anaeroben Kammer heraus. Gefrieren Sie das Reagenzglas, indem Sie die Spitze langsam in flüssigen Stickstoff eintauchen. Sobald ein Zischgeräusch zu hören ist, führen Sie den Rest des Reagenzglases langsam weiter ein, sodass der Probenbereich vollständig untergetaucht ist. Geben Sie ein bis zwei Mikroliter einer zuvor hergestellten zweimillimolaren Natrium-Tite-Lösung zu der Lösung im Titriergefäß, um das Potential der Lösung auf minus 0,6 Volt zu senken. Notieren Sie nach dem Entnehmen einer Probe das tatsächliche Potential, das das Voltmeter anzeigt, um das Potential um etwa 50 Millivolt zu erhöhen. Geben Sie ein bis zwei Mikroliter einer zuvor hergestellten zweimillimolaren Natriumcyanid-Lösung hinzu.Um EPR-Spektren der verschiedenen Titrationssproben aufzuzeichnen, evakuieren Sie einen Quarzkryostaten auf weniger als 10 hoch minus fünf bar. Schalten Sie mit einer Hochvakuumpumpe die Wasserkühlung des EPR-Magneten ein und öffnen Sie anschließend den Durchfluss von trockener Luft durch den EPR-Resonator. Nachdem Sie die Stromversorgung für den Magneten und den Computer des EPR-Geräts eingeschaltet haben, führen Sie das Frequenzkalibrierungsprogramm aus.Stellen Sie nach Fertigstellung die EPR-Messparameter ein. Schließen Sie anschließend die flüssiges Helium enthaltende Dose an das Kryostat an, um den Hohlraum auf neun bis 16 Kelvin abzukühlen. Führen Sie die EPR-Probe in den Hohlraum ein und nehmen Sie dann das EPR-Spektrum auf.Schließlich wird die EPR-Signalamplitude bei einem G-Wert, der charakteristisch für die untersuchte paramagnetische Spezies ist, gegen ein Potenzial aufgetragen. Ein drei-Eisen-vier-Schwefel-Cluster, ein vier-Eisen-vier-Schwefel-Cluster und ein mononuklearer Eisenkomplex wurden als redoxaktive Cofaktoren identifiziert. Bei der Quantifizierung der EPR-Signale in nar zeigte sich, dass der vier-Eisen-vier-Schwefel-Cluster und der mononukleare Eisenkomplex in etwa äquimolar mit ungefähr 60 % der Proteinkonzentration vorliegen, während der Anteil des drei-Eisen-vier-Schwefel-Clusters lediglich 5 % beträgt. Der drei-Eisen-vier-Schwefel-Cluster ist höchstwahrscheinlich ein Abbauprodukt und unvollständiger Cluster. Die mittleren Potenziale der verschiedenen Cofaktoren wurden für das mononukleare Eisenzentrum zu +0,003 Volt bestimmt.Koppeln Sie negative 0,125 Volt für das Drei-Eisen-vier-Schwefel-Kupplungspaar und zwischen negative 0,45 und negative 0,50 Volt für das Vier-Eisen-vier-Schwefel-Kupplungspaar. Das niedrige Potential des Vier-Eisen-vier-Schwefel-Clusters zeigt an, dass er keine Redoxrolle im Protein übernimmt, da es äußerst schwierig wäre, den Cluster zu reduzieren. Das mononukleare Eisenzentrum kann im Cytoplasma reduziert oder oxidiert werden, wodurch eine Redoxrolle dieses Zentrums möglich ist.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Titration in oxidierender oder reduzierender Richtung durchgeführt werden kann. Die beste Wahl hängt von der Stabilität des Cough-Faktors unter verschiedenen Redoxzuständen ab.

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Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu...

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Low-Bereich (L-Band, 1,2 GHz) Elektron paramagnetischen Resonanz mit löslichen Nitroxyl und Trityl Sonden wird zur Beurteilung der physiologisch wichtigen Parameter in den Tumor Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs gezeigt.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

In diesem Artikel beschreiben wir elektrochemische, Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz und ultravioletten, sichtbaren und nahinfraroten Spectroelectrochemical Methoden für die Analyse organischer Verbindungen für Anwendung in der organischen Elektronik.

Mithilfe von zyklischer Voltammetrie, UV-Vis-NIR und EPR Spectroelectrochemistry organische Verbindungen analysieren

Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Dieses Protokoll beschreibt einen vergleichenden Assay, der mitochondriale komplexe Aktivitäten CI+CIII und CII+CIII in Gegenwart oder Abwesenheit von Na+ verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu untersuchen.

Innere Empfindlichkeit der mitochondrialen Membran gegenüber Na+ zeigt teilweise segmentierte funktionelle CoQ-Pools

In dieser Studie wird eine Methodik zur Untersuchung xenobiotischer Effekte auf die mitochondriale Funktion mittels respirometrischer und enzymatischer Assays vorgestellt. Es untersucht die Modulation der Elektronentransportkette in verschiedenen Spezies und bietet Einblicke in die gezielte Entwicklung von Biopestiziden gegen durch Insektenvektoren übertragene Krankheiten.

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Die mitochondriale Atmung in ganzen Hefezellen ist ein wertvoller Indikator für die Bioenergetik der Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um diesen Phänotyp zu quantifizieren, das auf verschiedene Hefearten anwendbar ist.

Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

Erfahren Sie die EPR-Wächter-Redox-Titration zur Charakterisierung von Cofaktoren in Saccharomyces cerevisiae Nar1. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von Mittelpunktpotentialen redoxaktiver Zentren in komplexen Proteinen.

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von

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