Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gift zu extrahieren und Giftdrüsen aus Spinnen für transkriptomische und proteomische Studien zu sezieren, indem zunächst die Geräte und Reagenzien vorbereitet werden, die zum Sammeln von Gift durch elektrische Stimulation benötigt werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Narkosespinne mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop zu immobilisieren. Als nächstes wird die Spinne mit Strom gepulst und das freigesetzte Gift mit einem Mikrokapillarröhrchen aufgefangen.

Der letzte Schritt besteht darin, zwei bis drei Tage später die Giftdrüsen der Spinne zu sezieren. Letztendlich wird die Massenspektrometrie oder andere proteomische Analysen des Giftes verwendet, um die Sequenzen der konstituierenden Giftproteine zu zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Giftsammlung schwer zu erlernen sind, da sie eine Abfolge koordinierter Aktionen erfordern, die schnell und dennoch sorgfältig ausgeführt werden müssen.

Schließen Sie zunächst ein Netzkabel des Elektrostimulators an eine Steckdose an und schließen Sie das externe Fußpedal an einen externen Signaleingang an. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass sich der Polaritätsschalter im Normalmodus befindet, und verbinden Sie die positive Elektrode mit dem roten Ausgangsanschluss des Elektrostimulators und verbinden Sie die negative Elektrode mit dem schwarzen Ausgangsanschluss. Stellen Sie dann den Stimulator auf die folgenden empfohlenen Anfangseinstellungen ein.

Testen Sie den Elektrodenausgang, indem Sie Krokodilklemmen an den Messleitungen des Plus- und Minus-Volt-Messgeräts anbringen. Schalten Sie dann den Netzschalter des Stimulators ein und geben Sie mit dem Fußpedal Strom ab. Bereiten Sie die federleichte Pinzette vor, indem Sie einen Zacken mit flüssigem Kunststoff beschichten und vier Stunden warten, bis die Beschichtung getrocknet ist, wickeln Sie nach dem Trocknen des Kunststoffs 15 Millimeter der gegenüberliegenden Spitze des AP-Zackens fest mit einer einzigen Schicht Baumwollnähgarn ein und befestigen Sie den Faden, indem Sie das Ende zu einem Knoten binden.

Schneiden Sie dann mit einer scharfen Schere die Spitze einer stumpfen Injektionsnadel ab, die klein genug ist, um die Spinne nicht zu verletzen, aber groß genug, um ein Verstopfen zu vermeiden. Glätten Sie die Öffnung mit Schleifpapier und befestigen Sie die Nadel an einer Vakuumabfallfalle. Positionieren Sie dann die federleichte Pinzette horizontal in einer fest geschlossenen Position mit einer mit Vinyl überzogenen zweizinkigen Klemme, die an einem Magnetfuß unter dem Sichtfeld eines Präpariermikroskops befestigt ist, wobei der kunststoffbeschichtete Zacken oben und der gewindebeschichtete Zacken unten ist.

Befestigen Sie als Nächstes eine positive Elektroden-Krokodilklemme an der unteren Zinke stromaufwärts des Fadens und befestigen Sie eine negative Krokodilklemme an der stumpfen Metallvakuumnadel. Legen Sie dann die positive Elektrode auf den Pinzettenstift zwischen Faden und Krokodilklemme und die negative Elektrode auf die stumpfe Vakuumnadel. Um den Stromkreis des Voltmeters zu testen, drücken Sie das Fußpedal, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Strom erkannt wird, und entfernen Sie die Leitungen, während Sie eine Schutzbrille tragen.

Bereiten Sie mehrere Mikrokapillarröhrchen für die Giftsammlung vor. Legen Sie als Nächstes einen Eindeckkittstreifen in eine Petrischale und legen Sie die Mikrokapillaren auf den Streifen. Halten Sie mit einer behandschuhten Hand ein einzelnes Mikrokapillarröhrchen an einem Ende und halten Sie das andere Ende mit einer sterilen Metallzange über eine Bunsenbrennerflamme und ziehen Sie das Ende von der Flamme weg, um eine längliche Spitze zu erzeugen, während Sie das andere Ende in einer stationären Position halten, untersuchen Sie die Mikrokapillarenden unter einem Präpariermikroskop und erzeugen Sie mit einer sterilisierten Metallzange eine kleine abgeschrägte Öffnung am gezogenen Ende.

Verschließen Sie die Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Um mit der Immobilisierung der Spinne zu beginnen, schalten Sie das Gas der CO2-Kammer ein. Übertragen Sie dann die Spinne mit einer langen Metallzange aus dem geschlossenen Auffangfläschchen aus Kunststoff in die CO2-Kammer.

Halte die Spinne fünf bis 10 Minuten in der Kammer und überprüfe, ob sich die Spinne nicht mehr bewegt. Er stieß ihn sanft mit einer langen Pinzette an. Verwenden Sie dann eine Transferpipette mit Kochsalzlösung, um den Faden auf der Pinzette zu befeuchten.

Als nächstes holst du die betäubte Spinne aus der CO2-Kammer, indem du sie an ihren Vorderbeinen aufhebst. Bewegen Sie die betäubte Spinne mit einer stumpfen Präparierzange und behandschuhten Händen zu dem federleichten Pinzettengerät. Trennen Sie dann die Zacken der geschlossenen federleichten Pinzette und platzieren Sie die Kopfzinken der Spinnen zwischen den Zinken.

Lassen Sie die Zacken schließen, um sicherzustellen, dass die Spinne fest an Ort und Stelle gehalten wird, aber nicht zerquetscht wird. Stellen Sie schnell sicher, dass die Spinne mit der Rückenseite nach unten auf dem fadenbeschichteten Zacken platziert wird und die Bauchseite des Autos der Kunststoffbeschichtung zugewandt ist, während die positive Elektrode an der unteren Zacke befestigt bleibt. Stellen Sie anschließend die Vergrößerung, den Fokus und die Lichtquelle des Präpariermikroskops ein, bis die Spinnen und ihre Reißzähne deutlich sichtbar sind. Um mit dem Sammeln des Giftes zu beginnen, schalten Sie das Vakuum ein und besprühen Sie die Spinnengrube mit Wasser.

Mit einer zweiten Spritzennadel mit stumpfer Spitze saugen Sie das Wasser mit einer Vakuumnadel ab, um Verunreinigungen zu entfernen. Berühren Sie dann die Vakuumnadel mit der negativen Elektrode mit dem Rostrum der Spinne und geben Sie mit dem Fußpedal einen Impuls ab. Die Beine der Spinne ziehen sich zusammen und das Gift ist in Form von klaren Tröpfchen sichtbar, die aus den Reißzähnen austreten.

Bei Bedarf das Aufwürgen wegvakuumen. Sammeln Sie dann mit der Mikrokapillarspitze Gifttröpfchen und geben Sie die Kapillarspitze in ein 0,5 Milliliter Röhrchen mit Wasser, das in die Kapillare gesaugt wird. Vermeiden Sie es, die Spinne mit der Kapillare zu durchstechen und die Kapillare mit Seide und Klebstoff von den Spints zu verunreinigen.

Befestigen Sie anschließend die Transferspritze mit Schlauchadapter an der Mikrokapillare am Ende gegenüber der Auffangspitze und geben Sie die Giftlösung zurück in das Röhrchen und legen Sie das Röhrchen auf Eis, lagern Sie gifthaltige Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Wenn du fertig bist, wenn du mit dem Sammeln des Giftes fertig bist, stelle ein offenes Plastikauffangfläschchen mit seiner Kappe in die Nähe der Spinne. Für einen schnellen Transfer fassen Sie die Beine der Spinne vorsichtig mit einer stumpfen Präparierzange in der einen Hand und öffnen Sie vorsichtig die federleichte Pinzette mit der anderen Hand.

Schieben Sie dann die Spinne mit einer stumpfen Pinzette in das Auffangfläschchen. Und zwei bis drei Tage nach der Giftsammlung schnell die Kappe schließen, die Spinne in einer CO2-Kammer betäuben, dann einen flüssigen Stickstoffträger befüllen und neben ein Präpariermikroskop stellen. Reinigen Sie den Präparierbereich und die Pinzette mit RNA

Füllen Sie dann eine kleine Petrischale mit einem x salzhaltigen Natriumcitrat und legen Sie sie unter das Präpariermikroskop. Übertragen Sie als Nächstes die Spinne aus der CO2-Kammer in die Petrischale und verwenden Sie eine Pinzette, um den Kopfknochen schnell vom Bauch zu trennen. Halten Sie dann den Kopfknochen mit einer Pinzette unter das Präpariermikroskop und positionieren Sie die Zeche im Blickfeld.

Schneiden Sie mit den scharfen Enden einer zweiten Pinzette die Kutikula ab, die die Karabasis seitlich mit den Seitenseiten der Zeche verbindet. Fassen Sie die Zeche mit der zweiten Pinzette und ziehen Sie sanft hin und her, bis die Giftdrüsen herausgezogen sind. Dauert nicht länger als 15 Minuten.

Trennen Sie die Drüsen von der Zeche und geben Sie sie in ein kryosicheres 0,5-Milliliter-Röhrchen. Platzieren Sie das geschlossene Röhrchen in flüssigem Stickstoff und integrieren Sie massenspektrometrische Techniken mit Sequenzdatenbanken, die aus der Giftdrüse CD NA generiert wurden. Bibliotheken ermöglichten die Identifizierung von Giftproteinen. Das unfähige Peptid Laro war eines von 36 Proteinen, die mittels Massenspektrometrie aus dem Gift der Schwarzen Witwe identifiziert wurden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Spinnen wie Schwarzen Witwen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen getroffen werden sollten.