Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Spinnengift zu gewinnen und die Giftdrüsen für transkriptomische und proteomische Untersuchungen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die zur Sammlung des Gifts durch elektrische Stimulation benötigten Geräte und Reagenzien vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird eine Spinne mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop fixiert und anästhesiert. Anschließend wird die Spinne mit Stromimpulsen stimuliert und das freigesetzte Gift mittels einer Mikrokapi­llare aufgefangen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Spinnengiftdrüsen zwei bis drei Tage später zu dissezieren. Abschließend wird die Massenspektrometrie oder eine andere proteomische Analyse des Gifts verwendet, um die Sequenzen der einzelnen Giftproteine aufzuzeigen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Giftgewinnung schwer zu erlernen sind, weil sie eine Abfolge koordinierter Handgriffe erfordern, die schnell, aber dennoch sorgfältig ausgeführt werden müssen.

Verbinden Sie zunächst das Netzkabel eines Elektrostimulators mit einer Steckdose und schließen Sie das externe Fußpedal an einen externen Signaleingang an. Stellen Sie danach sicher, dass der Polaritätsschalter im Normalmodus steht, und verbinden Sie die positive Elektrode mit dem roten Ausgangsanschluss des Elektrostimulators sowie die negative Elektrode mit dem schwarzen Ausgangsanschluss. Anschließend stellen Sie den Stimulator auf die folgenden empfohlenen Anfangseinstellungen ein.

Prüfen Sie die Elektrodenausgabe, indem Sie Krokodilklemmen an die positiven und negativen Voltmeter-Prüfspitzen anschließen. Schalten Sie dann den Stimulator ein und geben Sie mithilfe des Fußpedals Strom ab. Bereiten Sie die Federkraftzwinge vor, indem Sie eine Zange mit flüssigem Kunststoff beschichten und vier Stunden warten, bis die Beschichtung getrocknet ist; nach dem Trocknen wickeln Sie eng 15 Millimeter der der AP gegenüberliegenden Zangenspitze mit einer einzigen Lage Baumwollnähgarn ein und sichern das Garn, indem Sie das Ende zu einem Knoten binden.

Danach mit einer scharfen Schere die Spitze einer stumpfen Hohlnadel abschneiden, die klein genug ist, um die Spinne nicht zu verletzen, aber groß genug, um Verstopfungen zu vermeiden. Die Öffnung mit Schleifpapier glätten und die Nadel an eine Vakuum-Abfallsammlung anschließen. Anschließend die Federkraftzange mit der Spitze horizontal in geschlossener Position mithilfe einer vinylumhüllten zweizinkigen Klammer fixieren, die auf einer magnetischen Unterlage befestigt ist und sich im Sichtfeld eines Stereomikroskops befindet, wobei die mit Kunststoff beschichtete Zinke oben und die mit Faden beschichtete Zinke unten liegt.

Befestigen Sie anschließend eine positive Krokodilklemme an der unteren Zinke stromaufwärts des Fadens und verbinden Sie eine negative Krokodilklemme mit der stumpfen Metall-Vakuumnadel. Bringen Sie dann die positive Leitung an der Zinke der Pinzette zwischen Faden und Krokodilklemme an und die negative Leitung an der stumpfen Vakuumnadel. Um die Stromstärke im Voltmeterkreis zu überprüfen, betätigen Sie das Fußpedal, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Strom nachgewiesen wird, und nehmen Sie danach die Leitungen ab, wobei Sie Schutzbrille tragen.

Bereiten Sie mehrere Mikroküvetten zur Gewinnung des Giftes vor. Platzieren Sie anschließend einen Streifen Montagekitt in einer Petrischale und legen Sie die Mikroküvetten darauf ab. Halten Sie mit einer behandschuhten Hand eine einzelne Mikroküvette an einem Ende fest und greifen Sie das andere Ende mit sterilen Metallpinzetten über einer Bunsenbrennerflamme, ziehen Sie das Ende von der Flamme weg, um eine verlängerte Spitze zu erzeugen, während Sie das andere Ende in ruhiger Position halten. Untersuchen Sie die Enden der Mikroküvetten unter einem Stereomikroskop und erzeugen Sie mit sterilen Metallpinzetten eine kleine abgeschrägte Öffnung am gezogenen Ende.

Schließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie auf Eis. Um die Immobilisierung der Spinne zu beginnen, schalten Sie das Gas im CO2-Kammer ein. Übertragen Sie die Spinne dann mit langen Metallpinzetten aus dem verschlossenen Plastik-Sammelröhrchen in die CO2-Kammer.

Halten Sie die Spinne fünf bis zehn Minuten lang in der Kammer und prüfen Sie, dass sich die Spinne nicht mehr bewegt, indem Sie sie vorsichtig mit langen Pinzetten anstoßen. Befeuchten Sie dann mit einer Transferpipette, die Salzlösung enthält, den Faden an der Pinzette.

Als Nächstes die betäubte Spinne aus der CO2-Kammer nehmen, indem man sie an den vorderen Beinen anfasst. Mit stumpfen Präparationspinzetten und behandschuhten Händen die betäubte Spinne auf die Leichtkraft-Zangenvorrichtung übertragen. Danach die Zinken der geschlossenen Leichtkraftzange auseinanderziehen und den Kopfbrustteil der Spinne zwischen die Zinken platzieren.

Lassen Sie die Zinken zusammenschließen, um sicherzustellen, dass die Spinne festgehalten wird, aber nicht zerquetscht wird. Stellen Sie schnell sicher, dass die Spinne mit der Carapax-Dorsalseite nach unten auf der mit Faden beschichteten Zinke ruht und die Ventralseite der Spinne zur Kunststoffbeschichtung zeigt, während die positive Elektrode weiterhin an der unteren Zinke befestigt ist. Anschließend stellen Sie die Vergrößerung, den Fokus und die Lichtquelle des Stereomikroskops so ein, dass die Augen und Fänge der Spinne deutlich sichtbar sind. Um die Giftgewinnung zu beginnen, schalten Sie das Vakuum ein und besprühen Sie das Spinnencollarium mit Wasser.

Entfernen Sie mithilfe einer zweiten stumpfen Kanüle mit Saugkanüle das Wasser, um Verunreinigungen zu beseitigen. Berühren Sie anschließend mit der Vakuumkanüle, die mit der negativen Elektrode verbunden ist, das Rostrum der Spinne und geben Sie über das Fußpedal einen Impuls ab. Die Beine der Spinne ziehen sich zusammen, und das Gift wird als klare Tröpfchen sichtbar, die aus den Giftzähnen austraten.

Regurgitieren Sie gegebenenfalls unter Vakuum ab. Sammeln Sie dann die Gifttröpfchen mit der Mikrokappillare und überführen Sie die Kappillare in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen mit Wasser, das in die Kappillare aufgesaugt wird. Vermeiden Sie, die Spinne mit der Kappillare zu verletzen, und verhindern Sie eine Kontamination der Kappillare mit Seide und Klebstoff aus den Spinnenbeinen.

Befestigen Sie anschließend die Transferspritze mit dem Schlauchadapter am Mikrokappillar am Ende gegenüber der Sammelspitze, geben Sie die Venomsolution zurück in das Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen zur Aufbewahrung der Venoms enthaltenden Röhrchen auf Eis bei minus 80 Grad Celsius. Wenn die Venomsammlung abgeschlossen ist, stellen Sie ein offenes, leeres Plastiksammelröhrchen zusammen mit seinem Deckel in die Nähe der Spinne. Um eine schnelle Übertragung durchzuführen, greifen Sie vorsichtig mit stumpfen anatomischen Pinzetten, die in einer Hand gehalten werden, die Beine der Spinne und öffnen Sie vorsichtig mit der anderen Hand die leichtgewichtigen Pinzetten.

Dann schieben Sie die Spinne mit einer stumpfen Pinzette in das Sammlungsfläschchen. Und verschließen Sie den Deckel schnell, zwei bis drei Tage nach der Giftgewinnung betäuben Sie die Spinne in einer CO2-Kammer, füllen anschließend einen flüssigen Stickstoffträger und stellen ihn neben ein Stereomikroskop. Reinigen Sie den Bereich für die Dissektion und die Pinzette mit RNA weg.

Füllen Sie dann eine kleine Petrischale mit einem x Salin-Natriumcitrat und stellen Sie sie unter das Stereomikroskop. Übertragen Sie anschließend die Spinne aus der CO2-Kammer in die Petrischale und trennen Sie mit einer Pinzette schnell das cephalische Thax vom Abdomen. Halten Sie danach das cephalische Thax mit der Pinzette unter dem Stereomikroskop fest und positionieren Sie die Collierie im Sichtfeld.

Verwenden Sie die scharfen Enden eines zweiten Pinzettenpaares, um die Kutikula, die das Carabasum mit den seitlichen Abschnitten des Collieriums verbindet, seitlich zu durchtrennen. Greifen Sie das Collierium mit dem zweiten Pinzettenpaar und ziehen Sie vorsichtig hin und her, bis die Giftdrüsen herausgezogen sind. Dies sollte nicht länger als 15 Minuten dauern.

Trennen Sie die Drüsen vom Kollik und überführen Sie sie in ein kryosicheres 0,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das verschlossene Röhrchen in flüssigen Stickstoff, wobei Massenspektrometrie-Techniken mit aus Drüsen-cDNA generierten Sequenzdatenbanken kombiniert werden. Die Bibliotheken ermöglichten die Identifizierung von Giftproteinen. Laro inept Peptid war eines von 36 Proteinen, die aus dem Gift der Schwarzen Witwe mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit Spinnen wie der Schwarzen Witwe äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen sollten bei Durchführung dieses Verfahrens stets getroffen werden.