Name: Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Lernen Sie die elektrische Stimulation zur Spinnengift-Extraktion und Mikrodissektion von Giftdrüsen für proteomische und transkriptomische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Giftprotein-Sequenzen.

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Ich danke den folgenden Personen für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier und Mays Imad. Massenspektrometrie und Proteomik-Daten wurden von der Arizona Proteomics-Konsortium durch NIEHS Zuschuss ES06694 zum SWEHSC, NIH / NCI Zuschuss CA023074 zum AZCC unterstützt und von der BIO5 Institut der Universität von Arizona erworben. Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (Nationales Institut für Allgemeinmedizin) aus Zuschüssen 1F32GM83661-01 und 1R15GM097714-01 Jessica E. Garb vorgesehen.

1. Herstellung von Elektro-Stimulator Vorrichtung <ol><li> Verbinden elektro Stimulator Netzkabel an eine Steckdose und befestigen externen Fußschalter zum externen Signaleingang. Hinweis: Elektrische Leitungen müssen gut isoliert und freiliegenden Metall liefert Strom sollte nicht berührt werden. Wear Latex oder Nitril Handschuhe zum Schutz. Electro-Stimulator Netzschalter sollte in der Position OFF beim Anbringen Netzkabel und Befestigungsdrähte sein. </li><li> Verbinden Sie die positive Elektrode auf rot Ausgangsklemme auf elektro-Stimulator (wenn Polaritätsschalter ist im normalen Modus) und verbinden Sie den negativen Elektrode mit der schwarzen Ausgangsklemme. Hinweis: Jeder Elektrodendraht sollte in einer Krokodilklemme zu beenden. </li><li> Stellen Stimulator mit den folgenden empfohlenen Voreinstellungen: Spannung = 7 V, Frequenz = 1 Impulse pro Sekunde, Delay = 0 Millisekunden Dauer = 200 Millisekunden wechseln Zwillingsimpulse = regelmäßige und Modus-Schalter = off. </li><li> Testausgang von Elektroden durch Anbringen Krokodilklemmen an voltmeter positive und negative Messleitungen. Schalten Sie Stimulator Netzschalter und liefern Strom mit Fußpedal. </li></ol> 2. Vorbereitung der Immobilisierung Pinzetten und anderen Stoffen <ol><li> Tauchen Sie ein Zinken der Federzange in flüssige Kunststoffbeschichtung und warten vier Stunden Beschichtung trocknen lassen. Dicht wickeln 15 mm von der Spitze des gegnerischen Zinke mit einer einzigen Schicht aus Baumwolle Nähgarn, und befestigen Faden durch das Binden Sie das Ende in einem Knoten. Hinweis: Das Gewinde wird verwendet, um eine Salzlösung aufgebracht, die elektrische Leitfähigkeit fördert absorbieren, während die Kunststoffbeschichtung eine Isolierung zu verzögern Strom. </li><li> Cut Spitze stumpfen Injektionsnadel mit einer scharfen Schere und glätten die Öffnung mit Sandpapier. Befestigen Sie die Nadel mit einer Vakuum Siphon (zB Vakuumfilter Kolben) über Schläuche. Hinweis: Die Nadel wird der Sog entfernt Wasser und erbrechen, und dienen dazu, die Schaltung, die durch die Stimulators Elektroden abzuschließen. Die Nadelöffnung must klein genug, um die Spinne nicht schaden können, aber groß genug, um Vakuumlösung ohne zu verstopfen (zB 25 G x 1 ½ im Gauge finden Materialliste). </li><li> Position im Federzange horizontal in einem dicht geschlossenen Position mit einer Vinylummantelung zweigleisigen Klemme an einen Magnetfuß oder festen Standgerät unter Sichtfeld einem Binokular gesichert, mit Kunststoff beschichtet Zinke Pinzette auf und fädeln beschichtet Stift auf der Unterseite. Hinweis: Die Zwei-Säulen-Klemme in einer stationären Position zu der magnetischen Basis durch einen Klemmhalter gehalten (siehe Materialliste). Ein Gummiband kann eng um Zinken der Federzange befestigt werden, neben dem Klammerhalter, um zusätzlichen Druck auf die Federzange in einer geschlossenen Position um die Spinne einmal eingeführt halten hinzuzufügen. </li><li> Bringen positive Elektrode Krokodilklemme an Pinzette &quot;Bottom Zinke vorgeGewinde und befestigen negativen Krokodilklemme an Metallvakuum Nadel stumpf. </li&gt; <li> Testschlussstrom mit Voltmeter, indem positive Leitung auf Pinzette Zinke zwischen Gewinde und Krokodilklemme und Platzierung Minusleitung auf stumpfe Vakuum Nadel. Drücken Sie Fußpedal, um eine ausreichende Strom erkannt wird, und entfernen Sie Leads, wenn genügend Strom erkannt wird. </li><li> Bereiten Sie mehrere Mikrokapillarröhrchen für Gift Kollektion. Halten Sie ein Einzel Mikrokapillarröhre an einem Ende mit einer behandschuhten Hand und am anderen Ende mit sterilem Metallzange, indem die Zange gehaltene Ende horizontal über einem Bunsenbrenner-Flamme. Ziehen Sie am mikrokapillaren mit den Metallzangen von der Flamme weg, um eine längliche Spitze zu schaffen, während das andere Ende in einer stationären Position halten. Hinweis: Schutzbrille tragen als Mikrokapillaren kann leicht brechen. </li><li> Ruhen bereit Mikrokapillaren auf einer Montage putty Streifens in einer Petrischale. Untersuchen mikrokapillaren endet unter einem Binokular und erstellen Sie eine kleine, abgeschrägte Öffnung am Ende zog mit sterilisierten Metallzangen. </li><li> Label variable Anzahl von sterilen 0,5-ml-Röhrchen. Hinzufügen sterile, entionisiertem Wasser auf Rohren steril (beispielsweise 5 &amp; mgr; l entionisiertem Wasser autoklaviert). Schließen Rohre und Ort Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Kochsalzlösung in einem Becherglas und füllen einen zweiten Becher mit autoklaviert Wasser. </li></ol> 3. Immobilisierung von Spider in Zange <ol><li> Schalten Sie CO 2 Tank und übertragen Spinne aus geschlossenen Kunststoffsammelfläschchen (siehe Materialliste) in CO 2 Kammer mit langen Metallzange. Hinweis: Schwarzen Witwen haben gefährliche Gift; immer Handschuhe tragen während dieser Protokoll. </li><li> Halten Spinne in Kammer für 5-10 min oder bis narkotisierten und bewegt sich nicht mehr, wenn sanft mit langen Zangen angestachelt. Verwenden Transferpipette Thread auf Pinzette mit Kochsalzlösung befeuchten. Hinweis: Richtlinien zur CO 2 Anästhesie Parameter für schwarze Witwen, siehe Spagna und Moore 19. </li><li> Abrufen betäubten Spinne von CO 2Kammer, indem man es durch seine Vorderbeine mit stumpfen Dissektionszangen und behandschuhten Händen. Bewegen Sie betäubt Spinne Pinzette Gerät Federgewicht. Separate Zinken geschlossenen Federzange und legen Sie das Spinnen cephalothorax in zwischen den Zinken und lassen die Zinken zu schließen gefahren, damit der Spinne zu gewährleisten ist fest an ihrem Platz gehalten, aber nicht erdrückt. Stellen Sie sicher, dass die Spinne gelegt Panzers Rücken Seite nach unten (siehe Foelix 20 für Führungsspinnenanatomie), am Gewinde beschichtet Stift ruht und Bauchseite des Panzers ist der Kunststoffbeschichtung gegenüber, während die positive Elektrode bleibt nach unten Zinke befestigt. Arbeiten Sie schnell beim Umgang mit Spinne. </li><li> Passen Binokular Vergrößerung, Fokus und Lichtquelle, bis das Spinnen Cheliceren und Reißzähne sind deutlich sichtbar. </li></ol> 4. Venom Sammlung <ol><li> Schalten Sie Vakuum und Spray Spinne Cheliceren mit Wasser-Lösung unter Verwendung eines zweiten stumpfer Spitze Spritze needle. Absaugen entfernt Wasser mit Vakuum Nadel um Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Berühren Sie die Nadel mit Vakuum angebracht negativen Elektrode zur Spinne Rostrum und liefern Puls mit Fußpedal ein- oder mehrmals. Vakuum entfernt erbrechen, wenn nötig. Hinweis: Spinne Rostrum ist im Mund hinter auf dorsalen Fläche zwischen Cheliceren und endites (siehe Foelix 20 für detaillierte Spinne Anatomie) Chelicerae. Hinweis: Bei jedem Impuls wird Beinen Vertrag der Spinne und Gift sichtbar klaren Tröpfchen, die aus Fängen sein. </li><li> Sammeln Gift Tropfen mit mikrokapillaren Spitze und Transfer Kapillarspitze in 0,5-ml-Röhrchen mit Wasser oder Pufferlösung (Lösung wird in die Kapillare gesaugt werden). Hinweis: Vermeiden Sie Stechen Spinne mit Kapillare, die Hämolymphe Kontamination und Tod führen kann. Vermeiden Sie auch Kontamination Kapillare mit Seide und Leim aus Spinndüsen. </li><li> Bringen Transferspritze mit Schlauchadapter an mikrokapillaren (am Ende gegenüber Sammelspitze) und dispense Giftlösung wieder in Rohr. Setzen Röhrchen auf Eis. Hinweis: Entsorgung Kapillaren in einem nahe gelegenen Behälter für scharfe Gegenstände. </li><li> Zeigen offenen Kunststoffsammelfläschchen, zusammen mit seiner Mütze, in der Nähe der Spinne. Fassen Sie vorsichtig die Spinnenbeine mit stumpfen Dissektionszangen in einer Hand gehalten und vorsichtig öffnen Federzange Zinken mit der anderen Hand, Schiebe Spinne in das Sammeln Fläschchen mit stumpfen Pinzette und schnell nahe Kappe. Fahren Sie mit nächsten Spinne und speichern Gift enthaltenden Röhrchen in -80 ° C Gefrierschrank, wenn Sie fertig. Hinweis: weiterhin Vorsicht walten lassen beim Bewegen der Spinne von der Pinzette wieder in das Fläschchen. Sicherstellen, dass die Sammelfläschchen mit Verschluss ist in der Nähe, um die Spinne für seine raschen Transfer und Handschuhe tragen. </li></ol> 5. Giftdrüse Dissections <ol><li> Zwei bis drei Tage nach der Giftsammlung, betäuben Spinne in CO 2 Kammer (siehe Schritt 3.1). Füllen flüssigem Stickstoff Träger und Platz neben Binokular. Hinweis: when Arbeiten mit flüssigem Stickstoff, Verwendung Augenschutz und Tieftemperatur Handschuhe. </li><li> Saubere Dissektion Bereich und Pinzette mit Lösung, RNase und DNA-Kontamination beseitigt. Füllen einer kleinen Petrischale unter Präpariermikroskop mit Sezieren Puffer (zB 1x mit Kochsalzlösung (SSC) Puffer) gegeben. </li><li> Transfer Spinne von CO 2 Kammer auf Petrischale und benutzen Pinzette schnell trennen die cephalothorax aus dem Bauch. </li><li> Halten Sie die cephalothorax unter dem Binokular mit einer Pinzette und positionieren Sie den Cheliceren in das Sichtfeld. Mit den scharfen Enden einer zweiten Pinzette zur Nagelhaut schneiden Beitritt des Panzers zu den seitlichen Aspekte der Cheliceren. Seitlich fassen die Cheliceren Verwendung der zweiten Pinzette, und sanft zerren und zurück, bis Giftdrüsen herausgezogen. </li><li> Separate Drüsen aus der Cheliceren (oder lassen befestigt Chelicerae falls gewünscht) zu einem cyrosafe 0,5-ml-Röhrchen und Transfer. Platz closed Röhre in flüssigem Stickstoff. Hinweis: Jeder Dissektion sollte nicht mehr als 15 Minuten dauern. </li><li> Wiederholen Dissektion mit zusätzlichen Spinnen bis beendet. Übertragungsrohre aus flüssigem Stickstoff in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol>

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Der Autor hat nichts zu offenbaren und keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Gifte sind eine wesentliche Quelle von physiologisch reaktiven Proteinen, Peptiden und anderen Molekülen mit Anwendungen für die Wirkstoffentwicklung, als auch für grundlegende Aspekte der zellulären und ökologische Forschung 3.1. Allerdings ist die Sammlung von Gift, vor allem aus gefährlichen oder kleine Tiere, ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Dieses Protokoll zeigt, wie Gift und Giftdrüsen kann von Schwarzen Witwen gesammelt werden, und bestätigt den Erfolg dieses Ansatzes über eine Kombination aus mudPIT Analyse des Giftes und einem Protein-Datenbank von cDNAs abgeleitet vom Gift geklont Verschraubungen 21. Während dieses Protokoll funktioniert gut für schwarze Witwen und mittelgroße Spinnen, andere Gift Sammlung Techniken für größere mygalomorph (Tarantel-like) Spinnen, wie direkten Absaugen von Gift aus Fänge in Glaspipetten zB 24. Dieser letztere Ansatz verwendet worden, jedoch , wird nicht gut für kleinere Spinnen, die nicht aggressi werden arbeitenve. Ein besonders wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Gift Sammelprotokoll ist die Anfangsphase der Herstellung und Optimierung des Sammelprozesses, so dass es mehr Routine, konsistente und schneller. Das Protokoll ist zunächst schwer zu meistern, jedoch mit wiederholten Versuchen, wird es einfacher und schneller. Vorsicht ist auch bei allen kritischen Phasen, die den Umgang mit gefährlichen Spinnen, die Verwendung von elektrischem Strom, feine Punktglasmikro Kapillaren und Spritzennadeln gedrängt. Es ist wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen wie Nitril-Handschuhe, einen Laborkittel, lange Hosen und geschlossene Schuhe sowie Brillen bei der Gestaltung Mikro Kapillaren. Eine weitere Herausforderung bei den Gift-Kollektion ist die geringe Menge des Giftes von einem Spinnen, insbesondere Latrodectus-Arten, von denen die Mengen gesammelt werden, können li sein produziertbestenfalls 1-2 Mikroliter pro Einzel grenzten. Erhalten ausreichender Gift für Downstream-Anwendungen, wie zB Protein-Gele oder funktionelle Assays kann die Kombination von Gift aus mehreren Individuen in einem Rohr erforderlich. In solchen Fällen sollte Gift nur von Personen gleichen Geschlechts, ontogenetische Stufe kombiniert werden, und die Bevölkerung angesichts der Anerkennung von intersexuellen, Entwicklungs- und geographische Variabilität in manchen Giften 25, 26. Spinnen kann auch aufweisen, eine beträchtliche Variation in der Menge an Gift unter Individuen, wobei geringere Mengen der letzten Entleerung der Drüse reflektieren hergestellt. So kann es ratsam sein Gift mehrere Tage nach ihrem letzten Fütterung sammeln. Wenn kleine Gift freigesetzt wird, sollte ein übermäßiger Strom nicht an die Spinne, die bewirken können, die Kutikula zu Bruch angelegt, was zur Verunreinigung des Giftes mit Hämolymphe oder Tod. Die Kontamination von Proben mit Spinnengift silk oder menschlichen Quellen auch durch die Verwendung von sterilen oder sauberen Ausrüstung vermieden werden. Trotz dieser Herausforderungen Sammlung von reinen Gift, so dass die Spinne lebt, ist vorzuziehen, Methoden, die Gift aus Drüsen Homogenate (die nicht trennen Giftkomponenten von anderen zellulären Proteinen) und töten die Spinne zu erhalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Proben schnell eingefroren, um Proteinabbau zu verhindern. Die Extraktion von Gift fördert spätere Giftproduktion, wodurch Gift Genexpression stimulierende im Giftdrüse. So, da dieses Protokoll ermöglicht Spinnen Gift Verarmungs überleben kann ihre Drüsen seziert werden einige Tage später (die Tötung der Spinne) an einem Punkt, wo Gift Genexpression wird erwartet, ausreichend für genetische Studien, wie Transkript Klonen 10,11 zu sein. Einige wichtige Vorsichtsmaßnahmen müssen auch Giftdrüse Dissektionen genommen werden. Der Schwerpunkt sollte auf mit Labor equipm platziert werdenent und Reagenzien, die frei von RNasen, die RNA abbauen. So wird empfohlen, Zangen und anderen nicht-Einweg-Geräte und Oberflächen mit Lösungen, die RNase und DNA-Kontamination zu beseitigen wischen. Die Sektionen sollte so schnell wie möglich direkt gefrorenen geführt werden, um weiter sicherzustellen, RNA Integrität des Gewebes. Schließlich sollte Dissektionen nur betäubt Spinnen durchgeführt werden, nachdem ihre cephalothorax und Bauch sind schnell getrennt. Abschließend dieser Artikel bietet eine überprüfte Protokoll zu Spinnengift und Giftdrüsen erhalten. Venom und Giftdrüsen ermöglichen die Isolierung und Charakterisierung ihrer Protein- und Peptid-Komponenten mit proteomischen und transkriptomischen Ansätze. Zusätzlich kann Gift Proben der Ausgangspunkt der funktionellen Assays, die die biomedizinische und pharmakologische Potenzial ihrer konstituierenden Moleküle bestimmen zu vertreten. Fast alle Spinnen produzieren Gift, und die breite Taucherversität Giftkomponenten von einzelnen Spezies synthetisiert schlägt eine große Vielfalt der Giftmoleküle noch nicht entdeckt zu 13 werden. Entsprechend stellt dieses Protokoll Werkzeuge, um die reiche Quelle von im Spinnengifte vorhanden biologisch aktive Moleküle zu untersuchen.

Gifte sind tierische Sekrete vorwiegend in ein anderes Tier für die Zwecke der Plünderung oder verteidigungs injiziert, und haben auch wichtige biologische Anwendungen mit biomedizinischer Relevanz 1-3. Nur bestimmte Tiere synthetisieren Gift, aber seine Produktion ist taxonomisch auf wirbellose Tiere (zB Nesseltiere, Kegelschnecken, Skorpione und Spinnen) und Wirbeltieren (zB Schlangen, einige Fische und Säugetiere) weit verbreitet, weil sie unabhängig voneinander entwickelt hat mehrfach 1,4 . Biochemische Charakterisierung Gifte Regel zeigen sie aus einer Vielzahl von Proteinen und Peptiden, die im Wesentlichen auf den Kreislauf und das Nervensystem von injizierten Tieren handeln schnell liefern Bestand Toxine 1 zusammengesetzt. Ein kleiner Bruchteil der giftigen Tieren eine Gefahr für den Menschen, vor allem Arten mit synanthrop Verteilungen 5 darstellen. Die Studie von Gift Zusammensetzung und funktionelle Aktivitäten eine wichtige Rolle spielenDie funktionelle Charakterisierung von Wirbel zellulären Komponenten (insbesondere neuronalen Ionenkanäle) 6 und bei der Aufklärung grundlegender zellulärer Prozesse (zB Neurosekretion) 7. Darüber hinaus wählen Sie Gift Peptide haben nützliche Eigenschaften in der biomedizinischen Kontexten, einschließlich ihrer Verwendung als Behandlungen für Krebs und Schmerzen 8,9 und sind für Arzneimittelkandidat Leads und Gegengift Entwicklung abgebaut. Venoms spielen eine herausragende Rolle in ökologischen und evolutionären Forschung 1,4,10,11, damit die Sammlung dieser gefährlichen Sekret hat viele Versorgungsunternehmen. Es gibt&gt; 40.000 beschriebenen Spinnenarten (Order Araneae), und alle, aber einer der mehr als 100 Spinnenfamilien besitzen gepaart Giftdrüsen, die Reißzähnen in der 12 zu beenden. Die hohe Artenvielfalt von Spinnen legt nahe, dass sie die größte Clade von giftigen Organismen darstellen. , Biochemische Charakterisierung von Spinnengifte hat jedoch largely auf einer kleinen Anzahl von Arten, die am häufigsten mit menschlichen envenomation zugeordnet engt. Aktuelle Proteom und Transkriptom-Studien von Spinnengiften zeigen sie enthalten typischerweise viele einzigartige Proteine ​​und Peptide 2,13,14. Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und cDNA-Massenspektrometrie Peptidfingerprinting hat stark die Entdeckung dieser Giftproteine ​​15 erleichtert. Dennoch beginnt diese Arbeit mit der Sammlung von ausreichender Gift und / oder Giftdrüsen aus den Spinnen und detaillierte Dokumentation für solche Techniken sind einige 16. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift und Giftdrüsen von Schwarzen Witwen, die zu ähnlich großen Spinnen angewendet werden können. Die Sammlung von Gift getrennt von den Drüsen ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die in dem Gift abgesondert werden, im Gegensatz zu Proteinen, die Ausführung anderer zellulärer Funktionen. Schwarz Witwen und andere Latrodectus Arten werden weitgehend als einer der gefährlichsten Spinnen aufgrund ihrer hoch neurotoxische Gift, die starke Schmerzen beim Menschen verursacht, die manchmal durch starkes Schwitzen, Muskelkontraktionen, Bluthochdruck, Atembeschwerden und lücken Lähmung 5 begleitet wird anerkannt. Die hier vorgestellte Gift Sammlung Protokoll verwendet Elektrostimulation, um elektrischen Strom zu anästhesie Spinnen liefern an Muskelkontraktionen und die Freisetzung von Gift entlocken. Venom Tröpfchen schnell mit Mikro-Kapillaren gesammelt und in Rohre für Tiefkühllagerung verzichtet. Da das Protokoll beinhaltet gefährliche Verfahren, sollte es nur von gut ausgebildeten Personen durchgeführt werden und Vorsicht ist bei wichtigen Schritten gedrängt. Die gesammelten Gift hat zahlreiche Anwendungen, wie die Charakterisierung und Isolierung von konstituierenden Moleküle 2, für physiologische Experimente oder funktionellen Assays 18, und Gift Genexpression 11 stimulieren. Das Protokoll schließt mit einem description der Giftdrüse Präparation und Konservierung, die für die Klonierung von Gift-spezifischen Genen, deren Expression wurde gezeigt, dass 2-3 Tage nach venom Verarmungs in verschiedenen Spinnen 10,11 erfolgen.

<table><tbody><tr><td>Nerven- und Muskelstimulator (Elektrostimulator)</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>jedes generische Voltmeter/Multimeter kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Spitze federleichte Pinzette</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Erhältlich bei Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; in Precision Glide Injektionsspritzennadel</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfilterkolben 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>kleinere Kolbengrößen können auch funktionieren</td></tr><tr><td>Buchner Zweiteiliger Trichter, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956; l Kapillarbohrungen (Mikrokapillaren)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Montagekittstreifen&nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>erhältlich bei Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand Allzweck-Allzweckzange mit extra langer Länge: 11-13/16 Zoll.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Puffer, 20x (pH 7,0), Molekularqualität</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>kann aus Stammchemikalien hergestellt werden (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat)</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen 0,5 ml Röhrchen (kryogensicher Sicher)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Tischkolben mit flüssigem Stickstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Pinzette (Präparierzange)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>ähnliche hochwertige Zangen mit feiner Spitze können ersetzt werden</td></tr><tr><td>Fußschalter/Pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Zweizinkige Verlängerungsklemme, mit vinylüberzogenen Hülsen, 8,5 Zoll</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>ähnliche Modelle könnten ersetzt werden</td></tr><tr><td>Klemmhalter</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>ähnliche Modelle könnten ersetzt werden, muss den Durchmesser der Verlängerungsklemmstange aufnehmen</td></tr><tr><td>Magnetfuß (hält die Verlängerungsklemme über den Klemmhalter)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>ähnliche Vorrichtungen, die in der Lage sind, die Verlängerungsklemme sicher in fester Position zu halten, können ersetzt werden</td></tr><tr><td>Auffangfläschchen aus Kunststoff (groß/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Nähgarn</td><td>Joann Stoff und Bastelgeschäft</td><td>7245855</td><td>ähnliches Produkt können ersetzt werden</td></tr></tbody></table>

extraktion von venom und giftdrüse mikrodissektionen von spiders für proteomik und transkriptomischen analysen

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Gifte sind chemisch komplexe Sekrete typischerweise aus zahlreichen Proteinen und Peptiden mit unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten. Funktionelle Charakterisierung Gift Proteine ​​hat wichtige biomedizinische Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von Leitstrukturen oder Sonden für zelluläre Rezeptoren. Spinnen sind die meisten Arten reichen Clade von giftigen Organismen, aber die Gifte von nur wenigen Arten gut verstanden, teilweise aufgrund der Schwierigkeit, mit dem Sammeln von winzigen Mengen Gift von kleinen Tieren verbunden. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, was die Prozedur auf dem westlichen Schwarzen Witwe (Latrodectus hesperus). Die gesammelte Gift ist nützlich für abwechslungsreiche Downstream-Analysen einschließlich direkter Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie, funktionelle Assays und Stimulation von Gift Genexpression für transkriptomischen Studien. Diese Technik hat den Vorteil gegenüber Protokolle, isoSpätgift aus ganzen Drüse Homogenate, die nicht trennen echten Giftkomponenten von zellulären Proteinen, die nicht als Teil des Giftes sezerniert werden. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Detektion von bekannten Gift-Peptiden aus der gesammelten Probe mittels Massenspektrometrie. Das Gift Sammelprozedur wird durch ein Protokoll zum Präparieren Spinnengiftdrüsen, wobei die Ergebnisse zeigen, dass dies zur Charakterisierung Gift-exprimierte Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene folgt.

Die Sammlung von Gift und Giftdrüse Dissektionen werden häufig durchgeführt, um Gift Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene 10,11,15 charakterisieren. Erhaltene Gift kann auch in physiologischen Assays verwendet, um die funktionellen Aktivitäten 18 zu bestimmen. Die Sammlung von Gift wird Giftdrüse Genexpression stimulieren, wodurch die Klonierung von spezifischen Toxin Transkripte über RT-PCR 10,11 Erleichterung. Identifizierung von Giftproteine ​​können auch in einem Hochdurchsatz-Art und Weise durch Integration von Standard Massenspektrometrie mit Sequenzdatenbanken von Giftdrüse cDNA-Bibliotheken erzeugt 15,21 erreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Arbeit, ausgehend von Gift und Drüsen gesammelt unter Verwendung des Protokolls oben beschrieben, zeigt seine Wirksamkeit, wird in Abbildung 1 veranschaulicht. Gift von L. gesammelten hesperus erwachsenen Weibchen wurde mit Trypsin verdaut und an ein in Lösung unterzogenMudPIT Analyse, die HPLC (High Performance Liquid Chromatography), um Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) verbindet. Hier wurde die mudPIT Analyse durch die Universität von Arizona Proteomics-Konsortium durchgeführt. Massen erkannt Peptide und ihre distanzierte Fragmente (Tochterionen, abgeleitete von Spektren) wurden Peptidsequenzen theoretisch aus Übersetzungen von cDNA-Sequenzen aus einem Gen-Expressionsbibliothek aus L. konstruiert erhalten prognostiziert im Vergleich hesperus Giftdrüsen (Drüsen wurden von der Dissektion Protokoll erworben oben beschrieben) 21. In diesem Experiment wurden 36 Proteine ​​aus allen gesammelten Spektren detektiert, an der Wahrscheinlichkeitsschwelle von 99,9% und enthielt wenigstens einen detektierten Peptids. Eine der nachgewiesenen Proteine ​​von 43 insgesamt Spektren (in 1A gezeigten beispielhafte Spektren) unterstützt wird, die den drei exklusive Peptiden, dabei 35% der Proteinsequenz (Abbildung 1B). Die nachgewiesene Protein (übersetzt aus einer collecte<html> d cDNA) eine obere BLASTp Hit von L. latrodectin tredecimguttatus (GenBank Accession P49125.1), mit einem E-Score von 2e-46, und teilt 80% Identität auf Aminosäureebene mit der Sequenz, die in diesem Experiment nachgewiesen Protein. Latrodectin, die auch als alpha-Latrotoxin niedermolekularen Proteins bekannt, ist ein anerkannter Gift Bestandteil Schwarzen Witwen 22, 23, die Überprüfung der Wirksamkeit der vorgestellten Protokoll. Einige Proteine, die aus dem Gift identifizierten Sequenzen entsprechen, für die keine BLAST Treffer gefunden wird. Es ist unklar, ob ein solches Ergebnis ist aufgrund der begrenzten Ressourcen für die genomische Spinnen zur Verfügung sowie die begrenzte Funktionsinformationen für die Proteine, oder weil das unbekannte Protein stellt einen Giftverunreinigung. Dennoch Gens oder der Proteinexpression analysiert Untersuchung der Abundanz eines solchen neuartigen Proteins in Giftdrüsen relativ zu anderen Geweben sollten zeigen, ob es eine echte Gift-Komponente ist. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: Latrodectin Peptid aus der schwarzen Witwe Gift mittels Massenspektrometrie identifiziert (A) Repräsentative Spektren (einer von 43) über MS / MS Teil mudPIT Analyse der L. erkannt. hesperus venom die vorhergesagte Translation eines teil B. Spectra gezeigt gesammelten cDNA-Sequenz zugeordnet wurde zeigt Massenverhältnis (m / z) der detektierten Sekundärionen auf das durch Fragmentieren Stammpeptid (CGEEDFGEEIVK) erzeugten Horizontalachse berechnen, mit Buchstaben oben Angabe der Peptidsequenz basierend auf Tochterionen Massen. (B) Proteinsequenz, auf die Spektren in Teil A zugewiesen wurde, zeigt in rot, fett und unterstrichen Text der entsprechenden Sequenz aus dem in Teil A gezeigten Spektren, zusätzliche rote Text (nicht fett) stellt mit anderen gesammelten sp anderes Peptid in diesem Protein nachgewiesenectra. Die Proteinsequenz wird aus einer cDNA-Sequenz aus sezierten Giftdrüsen erhalten rechnet.

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Spinnengift zu gewinnen und die Giftdrüsen für transkriptomische und proteomische Untersuchungen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die zur Sammlung des Gifts durch elektrische Stimulation benötigten Geräte und Reagenzien vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird eine Spinne mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop fixiert und anästhesiert. Anschließend wird die Spinne mit Stromimpulsen stimuliert und das freigesetzte Gift mittels einer Mikrokapi­llare aufgefangen.Der letzte Schritt besteht darin, die Spinnengiftdrüsen zwei bis drei Tage später zu dissezieren. Abschließend wird die Massenspektrometrie oder eine andere proteomische Analyse des Gifts verwendet, um die Sequenzen der einzelnen Giftproteine aufzuzeigen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Giftgewinnung schwer zu erlernen sind, weil sie eine Abfolge koordinierter Handgriffe erfordern, die schnell, aber dennoch sorgfältig ausgeführt werden müssen.Verbinden Sie zunächst das Netzkabel eines Elektrostimulators mit einer Steckdose und schließen Sie das externe Fußpedal an einen externen Signaleingang an. Stellen Sie danach sicher, dass der Polaritätsschalter im Normalmodus steht, und verbinden Sie die positive Elektrode mit dem roten Ausgangsanschluss des Elektrostimulators sowie die negative Elektrode mit dem schwarzen Ausgangsanschluss. Anschließend stellen Sie den Stimulator auf die folgenden empfohlenen Anfangseinstellungen ein.Prüfen Sie die Elektrodenausgabe, indem Sie Krokodilklemmen an die positiven und negativen Voltmeter-Prüfspitzen anschließen. Schalten Sie dann den Stimulator ein und geben Sie mithilfe des Fußpedals Strom ab. Bereiten Sie die Federkraftzwinge vor, indem Sie eine Zange mit flüssigem Kunststoff beschichten und vier Stunden warten, bis die Beschichtung getrocknet ist; nach dem Trocknen wickeln Sie eng 15 Millimeter der der AP gegenüberliegenden Zangenspitze mit einer einzigen Lage Baumwollnähgarn ein und sichern das Garn, indem Sie das Ende zu einem Knoten binden.Danach mit einer scharfen Schere die Spitze einer stumpfen Hohlnadel abschneiden, die klein genug ist, um die Spinne nicht zu verletzen, aber groß genug, um Verstopfungen zu vermeiden. Die Öffnung mit Schleifpapier glätten und die Nadel an eine Vakuum-Abfallsammlung anschließen. Anschließend die Federkraftzange mit der Spitze horizontal in geschlossener Position mithilfe einer vinylumhüllten zweizinkigen Klammer fixieren, die auf einer magnetischen Unterlage befestigt ist und sich im Sichtfeld eines Stereomikroskops befindet, wobei die mit Kunststoff beschichtete Zinke oben und die mit Faden beschichtete Zinke unten liegt.Befestigen Sie anschließend eine positive Krokodilklemme an der unteren Zinke stromaufwärts des Fadens und verbinden Sie eine negative Krokodilklemme mit der stumpfen Metall-Vakuumnadel. Bringen Sie dann die positive Leitung an der Zinke der Pinzette zwischen Faden und Krokodilklemme an und die negative Leitung an der stumpfen Vakuumnadel. Um die Stromstärke im Voltmeterkreis zu überprüfen, betätigen Sie das Fußpedal, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Strom nachgewiesen wird, und nehmen Sie danach die Leitungen ab, wobei Sie Schutzbrille tragen.Bereiten Sie mehrere Mikroküvetten zur Gewinnung des Giftes vor. Platzieren Sie anschließend einen Streifen Montagekitt in einer Petrischale und legen Sie die Mikroküvetten darauf ab. Halten Sie mit einer behandschuhten Hand eine einzelne Mikroküvette an einem Ende fest und greifen Sie das andere Ende mit sterilen Metallpinzetten über einer Bunsenbrennerflamme, ziehen Sie das Ende von der Flamme weg, um eine verlängerte Spitze zu erzeugen, während Sie das andere Ende in ruhiger Position halten. Untersuchen Sie die Enden der Mikroküvetten unter einem Stereomikroskop und erzeugen Sie mit sterilen Metallpinzetten eine kleine abgeschrägte Öffnung am gezogenen Ende.Schließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie auf Eis. Um die Immobilisierung der Spinne zu beginnen, schalten Sie das Gas im CO2-Kammer ein. Übertragen Sie die Spinne dann mit langen Metallpinzetten aus dem verschlossenen Plastik-Sammelröhrchen in die CO2-Kammer.Halten Sie die Spinne fünf bis zehn Minuten lang in der Kammer und prüfen Sie, dass sich die Spinne nicht mehr bewegt, indem Sie sie vorsichtig mit langen Pinzetten anstoßen. Befeuchten Sie dann mit einer Transferpipette, die Salzlösung enthält, den Faden an der Pinzette.Als Nächstes die betäubte Spinne aus der CO2-Kammer nehmen, indem man sie an den vorderen Beinen anfasst. Mit stumpfen Präparationspinzetten und behandschuhten Händen die betäubte Spinne auf die Leichtkraft-Zangenvorrichtung übertragen. Danach die Zinken der geschlossenen Leichtkraftzange auseinanderziehen und den Kopfbrustteil der Spinne zwischen die Zinken platzieren.Lassen Sie die Zinken zusammenschließen, um sicherzustellen, dass die Spinne festgehalten wird, aber nicht zerquetscht wird. Stellen Sie schnell sicher, dass die Spinne mit der Carapax-Dorsalseite nach unten auf der mit Faden beschichteten Zinke ruht und die Ventralseite der Spinne zur Kunststoffbeschichtung zeigt, während die positive Elektrode weiterhin an der unteren Zinke befestigt ist. Anschließend stellen Sie die Vergrößerung, den Fokus und die Lichtquelle des Stereomikroskops so ein, dass die Augen und Fänge der Spinne deutlich sichtbar sind. Um die Giftgewinnung zu beginnen, schalten Sie das Vakuum ein und besprühen Sie das Spinnencollarium mit Wasser.Entfernen Sie mithilfe einer zweiten stumpfen Kanüle mit Saugkanüle das Wasser, um Verunreinigungen zu beseitigen. Berühren Sie anschließend mit der Vakuumkanüle, die mit der negativen Elektrode verbunden ist, das Rostrum der Spinne und geben Sie über das Fußpedal einen Impuls ab. Die Beine der Spinne ziehen sich zusammen, und das Gift wird als klare Tröpfchen sichtbar, die aus den Giftzähnen austraten.Regurgitieren Sie gegebenenfalls unter Vakuum ab. Sammeln Sie dann die Gifttröpfchen mit der Mikrokappillare und überführen Sie die Kappillare in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen mit Wasser, das in die Kappillare aufgesaugt wird. Vermeiden Sie, die Spinne mit der Kappillare zu verletzen, und verhindern Sie eine Kontamination der Kappillare mit Seide und Klebstoff aus den Spinnenbeinen.Befestigen Sie anschließend die Transferspritze mit dem Schlauchadapter am Mikrokappillar am Ende gegenüber der Sammelspitze, geben Sie die Venomsolution zurück in das Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen zur Aufbewahrung der Venoms enthaltenden Röhrchen auf Eis bei minus 80 Grad Celsius. Wenn die Venomsammlung abgeschlossen ist, stellen Sie ein offenes, leeres Plastiksammelröhrchen zusammen mit seinem Deckel in die Nähe der Spinne. Um eine schnelle Übertragung durchzuführen, greifen Sie vorsichtig mit stumpfen anatomischen Pinzetten, die in einer Hand gehalten werden, die Beine der Spinne und öffnen Sie vorsichtig mit der anderen Hand die leichtgewichtigen Pinzetten.Dann schieben Sie die Spinne mit einer stumpfen Pinzette in das Sammlungsfläschchen. Und verschließen Sie den Deckel schnell, zwei bis drei Tage nach der Giftgewinnung betäuben Sie die Spinne in einer CO2-Kammer, füllen anschließend einen flüssigen Stickstoffträger und stellen ihn neben ein Stereomikroskop. Reinigen Sie den Bereich für die Dissektion und die Pinzette mit RNA weg.Füllen Sie dann eine kleine Petrischale mit einem x Salin-Natriumcitrat und stellen Sie sie unter das Stereomikroskop. Übertragen Sie anschließend die Spinne aus der CO2-Kammer in die Petrischale und trennen Sie mit einer Pinzette schnell das cephalische Thax vom Abdomen. Halten Sie danach das cephalische Thax mit der Pinzette unter dem Stereomikroskop fest und positionieren Sie die Collierie im Sichtfeld.Verwenden Sie die scharfen Enden eines zweiten Pinzettenpaares, um die Kutikula, die das Carabasum mit den seitlichen Abschnitten des Collieriums verbindet, seitlich zu durchtrennen. Greifen Sie das Collierium mit dem zweiten Pinzettenpaar und ziehen Sie vorsichtig hin und her, bis die Giftdrüsen herausgezogen sind. Dies sollte nicht länger als 15 Minuten dauern.Trennen Sie die Drüsen vom Kollik und überführen Sie sie in ein kryosicheres 0,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das verschlossene Röhrchen in flüssigen Stickstoff, wobei Massenspektrometrie-Techniken mit aus Drüsen-cDNA generierten Sequenzdatenbanken kombiniert werden. Die Bibliotheken ermöglichten die Identifizierung von Giftproteinen. Laro inept Peptid war eines von 36 Proteinen, die aus dem Gift der Schwarzen Witwe mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Spinnen wie der Schwarzen Witwe äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen sollten bei Durchführung dieses Verfahrens stets getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Obwohl viele Insekten in der Unterordnung Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sind giftig, deren Venom-Zusammensetzung und die Funktionen ihrer Venom-Toxine sind meist unbekannt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Heteropteran Gifte für weitere Charakterisierung, mittels Elektrostimulation, Belästigung und Drüse Dissektion zu ernten.

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Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung von Rohgiftextrakt aus Seeanemone und zum Nachweis seiner hämolytischen und Phospholipase-Aktivität.

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Hier stellen wir erfolgreiche Erhaltungs- und Giftextraktionsprotokolle für die großflächige Haltung von Tityus serrulatus Lutz und Mello, 1922 (brasilianischer gelber Skorpion) vor, mit dem Ziel, Gift für die anschließende Skorpion-Gegengiftproduktion bereitzustellen, um den Bedarf des brasilianischen Gesundheitssystems zu decken.

Pflege in Gefangenschaft und Giftextraktion von Tityus serrulatus (Brasilianischer Gelber Skorpion) zur Herstellung von Gegengift

Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von Gift aus Trichogramma dendrolimi unter Verwendung eines künstlichen Wirts vor, der mit Polyethylenfilm und Aminosäurelösung hergestellt wurde.

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter Verwendung von Poly-acrylimid Gelelektrophorese (PAGE).

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Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

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Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Lernen Sie die elektrische Stimulation zur Spinnengift-Extraktion und Mikrodissektion von Giftdrüsen für proteomische und transkriptomische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Giftprotein-Sequenzen.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

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