Name: Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Cholangiozyten aus extrahepatischen Gallengängen neugeborener Mäuse mittels Kollagen-Gel-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gallengangentwicklung und -pathologie.

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Die Autoren danken der Molekularpathologie und Bildgebung Kern der UPenn NIDDK-Centrum für Molekulare Studien in Verdauungs-und Lebererkrankungen (P30 DK50306) für die Unterstützung bei Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01 DK-092111) und von der Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (zu RGW) und durch eine Gemeinschaft aus der Kindheit Liver Disease Research and Education Network (SK) unterstützt.

Das gesamte Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Tier Arbeit sollte unter menschenwürdigen Bedingungen, unter einem Protokoll von der örtlichen Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen sind. 1. Herstellung von Ausrüstung und Lösungen <ol><li> Richten Sie die Maus OP-Tisch in der Nähe der Gewebekultur Kapuze und Inkubator (Abbildung 1A). Hinweis: Erforderliche Ausrüstung umfasst ein Binokular, eine Lichtquelle, 12,5 cm lange, gerade Iris Schere, 6 Zoll nicht gezackten gebogenen Pinzette mit feinen Spitzen, und 4-Zoll-gezähnt Zange mit gebogenen Spitzen (Abbildung 1B). </li><li> Platzieren sterilisierten Instrumente in einem Becherglas von 70% Alkohol auf dem Operationstisch. </li><li> In drei sterile 60 mm Petrischalen mit sterilen Isolationsmedien (Tabelle 1); legen Sie zwei am OP-Tisch und eine Kapuze, die alle auf dem Eis. </li><li> Zeigen Rattenschwanz Kollagen,sterile 10 x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), sterilem Wasser, steriler 1 N NaOH und Gallen Epithelzellen (BEC)-Medien (Tabelle 1) in der Gewebekultur Haube. Hinweis: Das Kollagen sollte auf Eis. </li></ol> 2. Gallenwegs Isolierung und Kultur <ol><li> Euthanize neugeborenen Mäusen zwischen 0-3 Tagen des Lebens, durch die Einwirkung von Kohlendioxid bis zum Unbewussten durch Genickbruch, pro IACUC Richtlinien (1C), gefolgt. Hinweis: ältere Mäuse können in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Anforderungen verwendet werden. </li><li> Zeigen Tier in Rückenlage und machen einen kleinen horizontalen Schnitt Überqueren der Mittellinie im Bereich des Beckens. Erweitern Sie dieses Schnitt seitlich und bis beide Seiten des Bauches, bilden eine U-förmige Klappe. Schalten Klappe bis die Bauchorgane aus. Sobald das Abdomen geöffnet ist, vorsichtig bewegen die Eingeweide aus der Bauchhöhle in Richtung der rechten Seite des Tieres zur besseren Visualisierung der Leber und der Gallengang. Hinweis: es kann notwendig sein, um die seitlichen Einschnitte in den Brustkorb zu verlängern, um eine bessere Identifikation der Leber zu erhalten. </li><li> Verwendung der Präpariermikroskop mit den gemeinsamen Gallengang, Leber und Darm. Identifizieren Sie den Gallengang erste (1D), mit Vorsicht, da die Strukturen sind sehr empfindlich. Mit den gezackten und nicht gezackten Zangen, akribisch sauber und holen Sie das Bindegewebe, einschließlich Fett rund um die Galle. Verwenden Sie eine Zange, um den Kanal und die andere zu reinigen halten. </li><li> Verwenden Sie eine ähnliche Technik, um die Gallenblase zu reinigen. </li><li> Legen Sie die gereinigten Produkte und Gallenblase in den ersten Teller der Isolationsmedien auf Eis. Massieren Sie die Strukturen mit den nicht gezahnten Pinzette während in den Medien, um weiter zu entfernen Bindegewebe und Galle aus der Gallenblase zu entfernen. </li><li> Übertragen Kanäle und Gallenblase in die zweite Schale der Isolation Medien. </li><li> Nach der Isolierung von Leitungen und Gallenblasen aus 5 Tieren, übertragen Sie dieStücke mit dem dritten Petrischale, in der Haube. Hinweis: Wenn Zellen von mehr als 5 Tieren isoliert werden sollen, tun in den Reihen, die mit frischen Lösungen für jede Gruppe von 5 Tieren. </li><li> Bereiten dicken Kollagengelen in der Gewebekultur Haube: Hinweis: jeder Größe Gericht verwendet werden können. Eine 60-mm-Kulturschale mit einem Endvolumen von 3 ml Kollagen für jede Gruppe von 5 Neugeborenen funktioniert gut. Dies sollte frisch zubereitet werden, zum Zeitpunkt der Einbettung frisch isolierten Leitungen. <ol><li> Platzieren Rattenschwanzkollagen, sterile 10 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (10x PBS), steril dH 2 O und 1 N NaOH sterile auf Eis. </li><li> Berechnung der Volumina von dH 2 0, 10x PBS, NaOH und Kollagen für Gele mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen in 1 × PBS erforderlich, mit einem Volumen von 1 N NaOH gleich 0,023 mal dem Volumen des Kollagens zugesetzt. Hinweis: Wenn alternative Quelle von Kollagen verwendet wird, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Neutralisation und Gel-Bildung. </li><li> Mix zusammen dH 2 0, 10x PBS und 1 N NaOH, dann fügen Kollagen und Pipette auch, um sicherzustellen, sogar Vermischung. </li></ol></li><li> Sobald Kollagenlösung hat zu einer gelartigen Konsistenz bei Raumtemperatur verdickt, die sofort einbetten Kanäle im Kollagen. </li><li> Legen in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min, um das Kollagen zu ermöglichen sich zu verfestigen. </li><li> Sobald Gel (Farbwechsel von klar bis weiß), Überlagerung mit 3,5 ml BEC Medien (Tabelle 1) verfestigt und bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> BEC Medien entfernen 3 mal pro Woche und ersetzen mit 3,5 ml frischem Medium. </li></ol> 3. Isolaprimär Cholangiozyten von Dick Kollagengele Hinweis: innerhalb von 3 Wochen, werden Blätter Cholangiozyten (Zellen mit großen Kernen, die sich direkt von Embedded-Kanäle) in der dicken Kollagen sichtbar sein. Wenn es eine große Zahl von Fibroblasten in die Schüssel, sollte sie verworfen werden. Wenn ein paar Regionen der Schüssel habenFibroblasten-Wachstums, können diese mit einem Skalpell geschnitten und vor der Aufspaltung der Cholangiozyten entfernt werden. <ol><li> Bereiten dünnen Kollagengelen: <ol><li> Verdünnen Kollagen in einer Konzentration von 1 mg / ml mit steriler PBS. Hinweis: Verwenden Sie 1 ml für 100-mm-Platte; entsprechend für andere Gerichte Größe anpassen. </li><li> Verbreiten Sie die Kollagenlösung gleichmäßig mit einer Zelle Treuer (große Geschirr) oder Pipettenspitze (kleine Gerichte), dann lassen bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Platte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min. </li><li> Entfernen Platte von Inkubator und waschen mit 1x PBS. Unmittelbar absaugen 1x PBS. </li><li> Mantel mit einem zweiten dünnen Schicht aus Kollagen, die Verbreitung durch Drehen der Platte oder Platzierung Platte auf einem Schüttler. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min. </li><li> Nach Kollagen verfestigt hat, Abdeckplatte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min. </li></ol></li><li> Split-Zellen von thick Kollagengelen: <ol><li> Mit Zellkulturzellschaber oder Spachtel, kratzen Kollagengel vorsichtig von der Platte, so daß sie schwimmt. </li><li> Bereiten Collagenase-Lösung durch Verdünnen Typ XI Kollagenase (siehe Materialliste) auf 10 mg / ml mit DMEM/F12. Gut mischen und Sterilfilter. </li><li> 1 ml der Collagenase-Lösung (oben) pro 60 mm-Schale von Zellen in dicken Kollagen. Die BEC-Medien (3 ml, das sollte sein) nicht entfernen. Inkubieren Schale für 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Entfernen Lösung, die Zellen und legen in 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Spin down bei 2.200 xg für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet erneut aussetzen ähnliches Volumen von DMEM/F12. </li><li> Spinnlösung erneut bei 2200 · g für 5 min. Überstand entfernen. </li><li> Pellet in 3 ml 0,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min. Nach der Inkubation Pipette die Lösung auf und ab, brechen die Blätter Cholangiozyten. 5 ml BEC Medien einnd Spinnlösung bei 1.500 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in DMEM/F12, dann spinnen Lösung bei 1.500 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet erneut aussetzen BEC Medien (Tabelle 1). Teller Zellen auf bisherigen dünnen Kollagen Gele. </li></ol></li></ol> 4. Passage und Lagerung von Zellen Hinweis: bei Bedarf können die Zellen auf dünnen Kollagengelen aufgeteilt werden. <ol><li> Vor der Inkubation in 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 10-15 min waschen Platten mit sterilem PBS. </li><li> Neutralisieren mit einem gleichen Volumen von BEC Medien und pelletieren bei 1.500 × g für 5 min. Mit DMEM/F12 spülen Pellet, dann pelletieren bei 1.500 × g für 5 min. </li><li> Die Zellen in BEC Medien für die Verteilung an Kollagen beschichtete Zellkulturschalen. Hinweis: Alternativ können die Zellen in Speichermedien resuspendiert und in einem -80 ° C Gefrierschrank oder flüssiger Stickstoff (Tabelle 1) gespeichert werden. </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.

Beschrieben wird hier eine Technik, um reine Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallenwege von Mäusen Mäuse aller Altersgruppen, einschließlich Neugeborenen zu isolieren. Die Technik bietet den Vorteil, dass extrahepatischen Cholangiozyten getrennt von intrahepatischen Cholangiozyten untersucht werden, und können Studien zu wichtigen Unterschiede zwischen diesen Populationen von Zellen identifizieren zu erleichtern. Wir haben vor kurzem eine Studie veröffentlicht, demonstrieren verringert Flimmerhärchen in extrahep...

Die Entstehung und Entwicklung der intra-und extrahepatischen Cholangiozyten unterscheiden sich deutlich. Die Leber entwickelt sich aus einer Divertikel des ventralen Vorderdarm Endoderm 5. Die Schwanzbereich der Divertikel bildet die extrahepatischen Gallenwege, während der Oberkopf erzeugt die intrahepatischen Gallenwege 5. Intrahepatische Kanal Cholangiozyten werden aus Vorläuferzellen rund um den duktalen Platte in den peri-Portal Bereiche 6 abgeleitet. Diese Zellen haben die Fähigkeit, entweder in Hepatozyten und Cholangiozyten 6 unterscheiden. Dies hat erhebliche klinische Implikationen da cholangiopathies kann gezielt eine Kategorie von Cholangiozyten. Zum Beispiel Gallengangsatresie betrifft zunächst die extrahepatischen Kanäle des Neugeborenen, während Alagille Syndrom betrifft intrahepatischen Gänge. Es gibt mehrere Beschreibungen der Isolierung der intrahepatischen Gallengänge und Cholangiozyten Einheiten von Mäusen und Ratten. Investigators haben einzelne Zellen durch Kanaltrennung und anschließender Auswuchs isoliert oder durch Leber und Verdauung Antikörper nach unten ziehen von Cholangiozyten Expression spezifischer Zelloberflächenmarker 4.1. Funktionelle und polarisiert Gallengang-Einheiten wurden von Leber Verdauung und Größe 7 Filtration isoliert. Gallengang-Einheiten in der Lage sind zu reagieren auf Reize sekretorischen und zeigen Fluidsekretion 7, während isoliert Cholangiozyten wurde gezeigt, ductularen Strukturen in vitro 1,2 zu entwickeln. Einschränkungen dieser Methoden sind die Notwendigkeit für spezialisierte technische Expertise und spezielle Ausrüstung für Leberperfusion mit Verdauungsenzymen. Darüber hinaus gibt es ein Risiko der Kontamination mit mesenchymalen Zellen 3. Verfahren extrahepatische Gallengang Cholangiozyten zu isolieren, und zwar von Neugeborenen extrahepatischen Gallenwege, ist bisher nicht beschrieben worden. Dieses Papier skizziert eine vereinfachte Methode für die Neugeborenen eine isolierens sowie erwachsene extrahepatischen Gallengangzellen bei hoher Reinheit. Diese Technik wird die Untersuchung der Unterschiede zwischen den intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und Forschung in Mechanismen von Krankheiten wie biliäre Atresie, die extrahepatischen Kanäle beinhalten erleichtern.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, verwendet in BEC Medien</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, verwendet in BEC Medien</td></tr><tr><td>MEM mit nicht-essentiellen Aminosäuren</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, verwendet in BEC</td></tr><tr><td>Medien Insulin-Transferrin-Selen</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, verwendet in BEC Medien</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>Chemisch definiertes Lipidkonzentrat</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien und 500 &#956; l in der Isolierung</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0,2 ml, verwendet in BEC-Medien und 500 &#956; l in der Isolierung</td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0,13 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>MEM-Vitaminlösung</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Hemmer</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien. Lösungsmittel ist PBS, Mischung auf 5 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>Rinderhypophysenextrakt</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1,1 ml, verwendet in BEC-Medien</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0,5 ml, verwendet in BEC-Medien, Stock conc 393 &#956; g/ml verdünnt mit Ethanol</td></tr><tr><td>3 3',5-Trijod-L-thyronin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,5 ml, verwendet in BEC-Medien, Stock conc 3,4 mg/ml verdünnt mit Ethanol</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0,5 ml, verwendet in BEC-Medien, 25 &#956; g/ml verdünnt mit DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886 5</td><td>ml, verwendet in BEC-Medien, Verwendung in Stammkonzentration von 0,411 mg/ml und verdünnt mit DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, verwendet in BEC-Medien und 500 &#956; l in der Isolierung</td></tr><tr><td>Rattenschwanz-Kollagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variabel abhängig von der Kollagenkonzentration</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>Verwendung bei 10x, sterlie, zur Herstellung von Kollagen verwendet, verwendete Menge abhängig von der Kollagenkonzentration</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>N/A N/</td><td>A</td><td>steril, verwendet zur Herstellung von Kollagen, verwendete Menge hängt von der Kollagenkonzentration</td></tr><tr><td>NaOH ab 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Verdünnung auf 1 N, steril, zur Herstellung von Kollagen, verwendete Menge abhängig von der Kollagenkonzentration</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ XI aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td> vor <td>Gebrauch in DMEM verdünnen und steril Filter</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) 0,25%</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, max. 10 min inkubieren</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10x) 0,5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, Inkubation max. 10 min</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Andere Modelle akzeptabel</td></tr><tr><td>Lichtquelle (faseroptische Beleuchtung)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Andere Modelle akzeptabel</td></tr><tr><td>12,5 cm gerade Irisschere</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Andere Modelle akzeptabel</td></tr><tr><td>6" nicht gezackte gebogene Pinzette mit feinen Spitzen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td></td><td>Andere Modelle akzeptabel</td></tr><tr><td>4" gezackte Edelstahlzange mit feinen Spitzen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td></td><td>Andere Modelle akzeptabel</td></tr></tbody></table>

isolierung von neugeborenen extrahepatische cholangiozyten

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Die intra-und extrahepatischen Gallengänge in der Leber sind entwicklungspolitisch deutlich und differentiell durch bestimmte Krankheiten betroffen sein. Jedoch Unterschiede zwischen intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und zwischen Neugeborenen und Erwachsenen-Zellen, sind nicht gut verstanden. Methoden zur Isolierung von Cholangiozyten von intrahepatischen Gallengänge sind gut etabliert 1-4. Isolierung von extrahepatischen Gangzellen, insbesondere aus der Neugeborenen ist noch nicht beschrieben worden, obwohl dies von großem Nutzen für das Verständnis der Unterschiede zwischen verschiedenen Bevölkerungsgruppen und Cholangiozyten bei der Untersuchung von Krankheiten wie Gallengangsatresie, die die extrahepatischen Zielkanäle erscheinen. Beschrieben wird hier eine optimierte Technik, um sowohl Neugeborenen und Erwachsenen Maus extrahepatischen Gallengangzellen zu isolieren. Diese Technik ergibt eine reine Zellpopulation mit minimaler Verunreinigung aus mesenchymalen Zellen wie Fibroblasten. Diese method ist auf die Beseitigung der extrahepatischen Gallengänge und, gefolgt von sorgfältige Dissektion und Schaben, Fett und Fibroblastenschichten zu entfernen basiert. Strukturen werden in dicken Schichten von Kollagen und kultiviert für ca. 3 Wochen eingebettet Auswuchs Cholangiozyten in Monoschichten, die dann mit Trypsin behandelt werden kann und wieder überzogen für den experimentellen Einsatz zu ermöglichen.

Die Verwendung dieses Protokoll Ergebnisse bei der Isolierung von einer Bevölkerung von neonatalen Maus extrahepatischen Cholangiozyten mit ausgezeichneter Reinheit, wie von K19 Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen (2A und 2B); wir ähnliche Ergebnisse erzielen Isolierung von Zellen aus erwachsenen Mäusen. Wir haben beobachtet, dass es dauert 3 Wochen für Zellen aus frisch isolierten Gallengänge zu Monoschichten auf dicken Kollagen-Gele bilden. Die Cholangiozyten wachsen in einer linearen Weise in der ga...

Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neonatale neuronale extrahepatische Cholangiozyten zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst chirurgisch die Bauchorgane freigelegt werden, um Zugang zur Leber und zu den Gallengängen zu erhalten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Bindegewebe und die Fette, die die Gallengänge und die Gallenblase umgeben, sorgfältig zu entfernen. Die gereinigten Gallengänge und die Gallenblase werden anschließend auf dicke Kollagengele gelegt und drei Wochen lang kultiviert. Die Cholangiozyten wandern aus den Gängen aus und werden auf dünne Kollagengele aufgeteilt, um sie weiterzukultivieren. Letztendlich zeigen die Ergebnisse durch Immunfluoreszenzmikroskopie Monolagen reiner Cholangiozyten.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, aufgrund technischer Schwierigkeiten mit der Dissektionstechnik sowie mit der Reinigung kleiner Gallengänge Probleme. Richten Sie für diesen Eingriff einen chirurgischen Tisch für Mäuse in der Nähe der Zellkulturlaminarströmungswerkbank und des Inkubators ein. Stellen Sie alle sterilisierten chirurgischen Instrumente in ein Becherglas mit 70 % Ethanol.Stellen Sie drei mit Medium beladene 60-Millimeter-Dishs auf Eis. Zwei Dishes werden am Operationstisch benötigt, die anderen Materialien halten Sie jedoch im Sicherheitswerkbank. Das Kollagen sollte auf Eis liegen.Beginnen Sie damit, eine euthanasierte neugeborene Maus im Alter von null bis drei Tagen in Rückenlage auf das Präparationsbrett zu legen. Führen Sie zunächst einen kleinen horizontalen Schnitt entlang der Mittellinie in der Nähe des Beckens durch. Verlängern Sie den Schnitt beidseits nach kranial, um eine U-förmige Klappe zu bilden, und legen Sie die Organe frei. Verschieben Sie nun vorsichtig die Därme nach rechts in der Bauchhöhle. Um die Leber und den Gallengang einzusehen, verlängern Sie die Hautschnitte gegebenenfalls, um die Klappe zu vergrößern. Identifizieren und reinigen Sie unter dem Präparationsmikroskop sorgfältig den Ductus choledochus.Entfernen Sie Bindegewebe und umliegendes Fett. Danach wiederholen Sie dasselbe. Um die Gallenblase zu reinigen, entfernen Sie den Gallengang und die Gallenblase und legen Sie diese in eine der vorbereiteten Schalen dort.Massieren Sie die Strukturen mit nicht gezackten Pinzetten, um weiteres Bindegewebe zu entfernen und Galle auszustoßen. Überführen Sie das gereinigte Gewebe danach in die zweite Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Gewebe von genau fünf Neugeborenen gesammelt wurde.Beginnen Sie mit der Herstellung eines dicken Kollagengels. Stellen Sie dieses immer frisch her. Geben Sie alle sterilisierten Lösungen auf Eis. Berechnen Sie die benötigten Volumina für zwei Milligramm Kollagen pro Milliliter einer 1× PBS-Lösung. Geben Sie 0,023 Anteile Natriumhydroxid zu jedem Anteil Kollagen hinzu. Mischen Sie die Aliquots bei Raumtemperatur durch Pipettieren. Es ist wichtig, PBS-Natriumhydroxid und destilliertes Wasser vor dem Hinzufügen des Kollagens zu vermischen. Die Kollagen-Grundlösung muss als letzte Komponente dem Gel zugegeben werden, und die endgültige Lösung muss pipettiert werden. Dies verhindert, dass sich das Kollagen verklumpt.Wenn die Lösung beginnt, eine gelartige Konsistenz anzunehmen, sofort die isolierten Gewebe einbetten und anschließend die eingebetteten Gewebe für 30 Minuten in den Inkubator überführen, um sie zu verfestigen. Sobald sie fest sind, das Gel mit 3,5 Milliliter BEC-Medien überlagern und die Inkubation danach fortsetzen. Das BEC-Medium dreimal pro Woche wechseln. Innerhalb von drei Wochen bilden sich Zellblätter mit großen Kernen, die sich von den eingebetteten Ductus aus erstrecken.Dies sind die Cholangiozyten. Falls die Petrischale eine beträchtliche Anzahl an Fibroblasten enthält und diese nicht entfernt werden können, sollte die Schale entsorgt werden. Bereiten Sie nun dünne Kollagengele vor, indem Sie ein Milligramm Kollagen pro Milliliter PBS verwenden. Geben Sie ein Milliliter auf eine 100-Millimeter-Platte und verteilen Sie das Kollagen gleichmäßig. Warten Sie anschließend 10 Minuten.Nach 10 Minuten die Platte mit sieben Millilitern DM EMF 12 abdecken und 10 Minuten lang inkubieren. Nach der kurzen Inkubation das Kollagen schnell mit einem XPBS waschen. Den gesamten PBS durch Absaugen entfernen und dann eine zweite Kollagenschicht genauso auftragen, wie dies zur Bildung der ersten Schicht erfolgt ist.Wenn der Agar erstarrt ist, überziehen Sie die Platte mit DMF 12 und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Spalten Sie nun die Zellen aus den dicken Gele. Lösen Sie zunächst vorsichtig mit einem Spatel oder Abstreifer das Kollagen von der Platte, sodass es schwimmt.Bereiten Sie anschließend eine gefilterte Kollagenase-Lösung vor und geben Sie ein Milliliter zu jeder 60-Millimeter-Schale mit dickem Kollagen hinzu. Danach überführen Sie die Schalen in den Inkubator. Nach einer 30-minütigen Inkubation entfernen Sie die gesamte Lösung, die die Zellen enthält, und überführen sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in 4,5 Milliliter DMEM/F12-Medien und zentrifugieren Sie erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter 0,5 %iger Trypsin-Lösung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, wobei sich die Zellblätter lösen werden.Nach fünf Minuten die Klumpen durch eine fünf oder zehn Milliliter Pipette fließen lassen, bis sie sich auflösen. Anschließend fünf Milliliter BEC-Medien hinzufügen und die Zellen abzentrifugieren. Ein drittes Mal resuspendieren.Suspendieren Sie das Pellet als Waschschritt in DMM F 12-Medium und pelletieren Sie die Zellen erneut. Resuspendieren Sie die Zellen nun in BEC-Medium und geben Sie sie auf die vorbereitete dünne Schicht. Kollagengele lassen die Zellen heranwachsen und teilen sie bei Bedarf auf Kollagengelen. Mithilfe des beschriebenen Protokolls wurde eine Population neonataler, extrahepatischer Cholangiozyten von Mäusen mit hervorragender Reinheit isoliert und mit K19-Immunfluoreszenz gefärbt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine reine Population neonataler, extrahepatischer Cholangiozyten von Mäusen durch eine Kombination aus sorgfältiger Ductus-Dissektion und Auswachsen auf dicken Kollagengelen isoliert.

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Biologie

Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Erfahren Sie die Isolierung von Cholangiozyten aus extrahepatischen Gallengängen neugeborener Mäuse mittels Kollagen-Gel-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gallengangentwicklung und -pathologie.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

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