Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten
5. Juni 2014
Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neonatale neuronale extrahepatische Cholangiozyten zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst chirurgisch die Bauchorgane freigelegt werden, um Zugang zur Leber und zu den Gallengängen zu erhalten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Bindegewebe und die Fette, die die Gallengänge und die Gallenblase umgeben, sorgfältig zu entfernen.
Die gereinigten Gallengänge und die Gallenblase werden anschließend auf dicke Kollagengele gelegt und drei Wochen lang kultiviert. Die Cholangiozyten wandern aus den Gängen aus und werden auf dünne Kollagengele aufgeteilt, um sie weiterzukultivieren. Letztendlich zeigen die Ergebnisse durch Immunfluoreszenzmikroskopie Monolagen reiner Cholangiozyten.
Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, aufgrund technischer Schwierigkeiten mit der Dissektionstechnik sowie mit der Reinigung kleiner Gallengänge Probleme. Richten Sie für diesen Eingriff einen chirurgischen Tisch für Mäuse in der Nähe der Zellkulturlaminarströmungswerkbank und des Inkubators ein. Stellen Sie alle sterilisierten chirurgischen Instrumente in ein Becherglas mit 70 % Ethanol.
Stellen Sie drei mit Medium beladene 60-Millimeter-Dishs auf Eis. Zwei Dishes werden am Operationstisch benötigt, die anderen Materialien halten Sie jedoch im Sicherheitswerkbank. Das Kollagen sollte auf Eis liegen.
Beginnen Sie damit, eine euthanasierte neugeborene Maus im Alter von null bis drei Tagen in Rückenlage auf das Präparationsbrett zu legen. Führen Sie zunächst einen kleinen horizontalen Schnitt entlang der Mittellinie in der Nähe des Beckens durch. Verlängern Sie den Schnitt beidseits nach kranial, um eine U-förmige Klappe zu bilden, und legen Sie die Organe frei.
Verschieben Sie nun vorsichtig die Därme nach rechts in der Bauchhöhle. Um die Leber und den Gallengang einzusehen, verlängern Sie die Hautschnitte gegebenenfalls, um die Klappe zu vergrößern. Identifizieren und reinigen Sie unter dem Präparationsmikroskop sorgfältig den Ductus choledochus.
Entfernen Sie Bindegewebe und umliegendes Fett. Danach wiederholen Sie dasselbe. Um die Gallenblase zu reinigen, entfernen Sie den Gallengang und die Gallenblase und legen Sie diese in eine der vorbereiteten Schalen dort.
Massieren Sie die Strukturen mit nicht gezackten Pinzetten, um weiteres Bindegewebe zu entfernen und Galle auszustoßen. Überführen Sie das gereinigte Gewebe danach in die zweite Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Gewebe von genau fünf Neugeborenen gesammelt wurde.
Beginnen Sie mit der Herstellung eines dicken Kollagengels. Stellen Sie dieses immer frisch her. Geben Sie alle sterilisierten Lösungen auf Eis.
Berechnen Sie die benötigten Volumina für zwei Milligramm Kollagen pro Milliliter einer 1× PBS-Lösung. Geben Sie 0,023 Anteile Natriumhydroxid zu jedem Anteil Kollagen hinzu. Mischen Sie die Aliquots bei Raumtemperatur durch Pipettieren.
Es ist wichtig, PBS-Natriumhydroxid und destilliertes Wasser vor dem Hinzufügen des Kollagens zu vermischen. Die Kollagen-Grundlösung muss als letzte Komponente dem Gel zugegeben werden, und die endgültige Lösung muss pipettiert werden. Dies verhindert, dass sich das Kollagen verklumpt.
Wenn die Lösung beginnt, eine gelartige Konsistenz anzunehmen, sofort die isolierten Gewebe einbetten und anschließend die eingebetteten Gewebe für 30 Minuten in den Inkubator überführen, um sie zu verfestigen. Sobald sie fest sind, das Gel mit 3,5 Milliliter BEC-Medien überlagern und die Inkubation danach fortsetzen. Das BEC-Medium dreimal pro Woche wechseln. Innerhalb von drei Wochen bilden sich Zellblätter mit großen Kernen, die sich von den eingebetteten Ductus aus erstrecken.
Dies sind die Cholangiozyten. Falls die Petrischale eine beträchtliche Anzahl an Fibroblasten enthält und diese nicht entfernt werden können, sollte die Schale entsorgt werden. Bereiten Sie nun dünne Kollagengele vor, indem Sie ein Milligramm Kollagen pro Milliliter PBS verwenden. Geben Sie ein Milliliter auf eine 100-Millimeter-Platte und verteilen Sie das Kollagen gleichmäßig. Warten Sie anschließend 10 Minuten.
Nach 10 Minuten die Platte mit sieben Millilitern DM EMF 12 abdecken und 10 Minuten lang inkubieren. Nach der kurzen Inkubation das Kollagen schnell mit einem XPBS waschen. Den gesamten PBS durch Absaugen entfernen und dann eine zweite Kollagenschicht genauso auftragen, wie dies zur Bildung der ersten Schicht erfolgt ist.
Wenn der Agar erstarrt ist, überziehen Sie die Platte mit DMF 12 und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Spalten Sie nun die Zellen aus den dicken Gele. Lösen Sie zunächst vorsichtig mit einem Spatel oder Abstreifer das Kollagen von der Platte, sodass es schwimmt.
Bereiten Sie anschließend eine gefilterte Kollagenase-Lösung vor und geben Sie ein Milliliter zu jeder 60-Millimeter-Schale mit dickem Kollagen hinzu. Danach überführen Sie die Schalen in den Inkubator. Nach einer 30-minütigen Inkubation entfernen Sie die gesamte Lösung, die die Zellen enthält, und überführen sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in 4,5 Milliliter DMEM/F12-Medien und zentrifugieren Sie erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter 0,5 %iger Trypsin-Lösung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, wobei sich die Zellblätter lösen werden.
Nach fünf Minuten die Klumpen durch eine fünf oder zehn Milliliter Pipette fließen lassen, bis sie sich auflösen. Anschließend fünf Milliliter BEC-Medien hinzufügen und die Zellen abzentrifugieren. Ein drittes Mal resuspendieren.
Suspendieren Sie das Pellet als Waschschritt in DMM F 12-Medium und pelletieren Sie die Zellen erneut. Resuspendieren Sie die Zellen nun in BEC-Medium und geben Sie sie auf die vorbereitete dünne Schicht. Kollagengele lassen die Zellen heranwachsen und teilen sie bei Bedarf auf Kollagengelen.
Mithilfe des beschriebenen Protokolls wurde eine Population neonataler, extrahepatischer Cholangiozyten von Mäusen mit hervorragender Reinheit isoliert und mit K19-Immunfluoreszenz gefärbt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine reine Population neonataler, extrahepatischer Cholangiozyten von Mäusen durch eine Kombination aus sorgfältiger Ductus-Dissektion und Auswachsen auf dicken Kollagengelen isoliert.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengängen von neugeborenen Mäusen beschrieben. Die Methode beinhaltet eine sorgfältige Dissektion und Zellisolierung durch Auswachsen in dicken Kollagengelen und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Gallengangentwicklung und -pathologie dar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Cholangiozyten sind epitheliale Zellen, die die Gallengänge auskleiden.
- Das Verständnis ihrer Entwicklung ist entscheidend für Erkenntnisse über Lebererkrankungen.
- Isolationsmethoden sind unerlässlich, um die Biologie der Cholangiozyten zu untersuchen.
- Diese Methode ermöglicht die Kultur reiner Cholangiozytenpopulationen.
Zweck der Studie
- Gewinnung von Cholangiozyten aus neugeborenen Mäusen.
- Bereitstellung einer Methode zur Untersuchung der Entwicklung des extrahepatischen Gallengangs.
- Unterstützung der Forschung zu cholangiozytenbezogenen Pathologien.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Exposition der Bauchorgane zur Zugänglichmachung der Gallengänge.
- Sorgfältige Entfernung des das Bindegewebe und die Fette umgebenden Gallengänge.
- Platzierung der gereinigten Gallengänge auf dicken Kollagengelen zur Kultivierung.
- Wanderung von Cholangiozyten aus den Gallengängen auf dünne Kollagengele zur weiteren Kultivierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Cholangiozyten.
- Bildung von Monolagen reiner Cholangiozyten.
- Überprüfung mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Nachweis der Lebensfähigkeit der Isolierungstechnik.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist wirksam zur Isolierung von Cholangiozyten.
- Diese Technik kann das Verständnis der Biologie der Gallengänge voranbringen.
- Sie könnte zur Erforschung von Cholangiozyten-assoziierten Erkrankungen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung reiner neonataler extrahepatischer Cholangiozyten ermöglicht eine mechanistische Entschärfung bei der Zielvalidierung von Gallenerkrankungen, indem ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der gangspezifischen Pathophysiologie bereitgestellt wird. Diese Methode unterstützt die Entwicklung von Assays und phänotypische Screening-Verfahren, die auf biliäre Atresie und verwandte Cholangiopathien ausgerichtet sind, und verbessert die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase. Der Ansatz liefert skalierbare, reproduzierbare Kulturen primärer Zellen, die die Entdeckungsbiologie mit der translationalen Biomarker-Ausrichtung in präklinischen Modellen verbinden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die spezifisch für das extrahepatische Gallengangepithel sind.
- Operationaler Wert: Stellt eine reine Zellpopulation mit minimaler Fibroblastenkontamination für zuverlässige Target-Engagement-Studien bereit.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken, indem funktionelle Unterschiede zwischen neonatalen und adulten Cholangiozyten geklärt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt krankheitsrelevante Zellschichten, die für die Wirkstoffscreening-Untersuchungen in Modellen der biliären Fibrose und Entzündung geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht skalierbare Auswuchs-Kulturen auf Kollagengelen, die mit hochdurchsatzfähigen Testformaten kompatibel sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen wie Proliferation, Migration und Markerausprägung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die translationale Biomarker-Abstimmung, indem neonatale Biliarpathologien modelliert werden.
- Operationaler Wert: Erleichtert die präklinische Kontinuität von isolierten Zellen bis zur funktionellen Validierung auf Gewebeebene.
- Wissenschaftlicher Wert: Hilft bei risikoadjustierten Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem der zelluläre Kompartiment identifiziert wird, der bei extrahepatischen Gangkrankheiten betroffen ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie validierte Cholangiozyten für die Zielvalidierung bereitstellt, schreitet über standardisierte Einschichtkulturen zur Screening-Phase fort und unterstützt translationsorientierte Forschung durch krankheitsrelevante phänotypische Ausgaben.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei der neonatalen extrahepatischen Gallengangsentwicklung.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand reproduzierbarer Cholangiozyten-Auswüchse auf Kollagen-Substraten.
- Analytik: Betont immunfluoreszenzbasierte Messgrößen zur Beurteilung von Reinheit und phänotypischen Reaktionen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem ein neonatales Modell der extrahepatischen Gangpathologie bereitgestellt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Isolationsmethode als wiederverwendbare Plattform zur Erzeugung von Modellen biliärer Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch krankheitsrelevante zelluläre Modelle des Gallengangepithels.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch sorgfältige Dissektion und kollagenbasiertes Auswachsen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten bei der Validierung von Zielstrukturen im Gallengangsystem.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen, die auf neonatale Cholangiopathien abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der neonatalen Mäusechirurgie und der Gallengangdissektion.
- Basiert auf der Herstellung von Kollagengel und einer sterilen Zellkultur-Infrastruktur.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Gewebehandlung und ein einheitliches Auswachsen zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf adulte oder humane Cholangiozyten-Modelle.
- Praktische Einschränkung: Die technische Schwierigkeit, kleine neonatale Gallengänge zu isolieren, erfordert eine sorgfältige Entfernung von Fett- und Bindegewebe.
