Methoden zur Charakterisierung Spontan und Startle-induzierte Locomotion in einer Rotenon-induzierten Parkinson-Krankheit Modell der Drosophila

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Bestimmung der erschreckenden und langfristigen spontanen Fortbewegung in einem Rotenon-induzierten Parkinson-Krankheitsmodell von Drosophila, dies wird durch die Aufzucht von Drosophila auf Rotenon-supplementierter Nahrung erreicht, um den Phänotyp zu induzieren. In einem zweiten Schritt werden die Fliegen dem Startle-Response-Assay und einem Doppelfläschchen-Apparat und einem Langzeit-Spontanlokomotions-Assay unterzogen. In einem Drosophila-Aktivitätsmonitor zeigen die Ergebnisse, dass die Exposition gegenüber Rotenon Lokomotionsdefekte bei Drosophila verursacht, basierend auf der Quantifizierung von Schreck und langfristiger spontaner Fortbewegung.

Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Drosophila, Modelle neurodegenerativer und Lokomotionsstörungen, wie z.B. Defekte in der schreckinduzierten Lokomotion, und der langfristigen spontanen Lokomotion zu beantworten. Fügen Sie zunächst 1,5 Gramm Instant-Drosophila-Medium hinzu. In einem Standard-Fliegenfläschchen besteht das Medium mit fünf Millilitern deionisiertem Wasser, das die entsprechende Rotenondosis enthält.

Als nächstes sedieren sie acht bis 12 männliche Fliegen im Alter von ein bis drei Tagen mit Kohlendioxid und transportieren sie zu Fläschchen mit dem Medikament. Ergänzungsfutter ermöglicht es den Fliegen, sich 20 Minuten lang von der Sedierung zu erholen, während sich das Fläschchen in horizontaler Position befindet. Stellen Sie das Fläschchen dann für den Rest des Experiments aufrecht in einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Inkubator bei 25 Grad Celsius.

Drehen Sie als Nächstes ein Standard-Fläschchen auf ein anderes Fläschchen und versiegeln Sie die Naht mit Klebeband, um eine Doppelfläschchenvorrichtung zu erhalten. Teilen Sie dann das Doppelfläschchen in drei gleich große Abschnitte von 6,33 Zentimetern, indem Sie mit einem Permanentmarker Kreise um die Fläschchen markieren. Nach drei Tagen Arzneimittelexposition übertragen Sie die Fliegen in das Doppelfläschchengerät.

Wenn Sie das Klebeband über der Naht austauschen, können sich die Fliegen 15 Minuten lang an die neue Umgebung gewöhnen. Stellen Sie dann die Fläschchen auf einen weißen Hintergrund und stellen Sie die Digitalkamera ein. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gerät in einem einzigen Bilderrahmen sichtbar ist, dass das Doppelfläschchengerät und der Timer sichtbar sind und alle Fliegen scharf sind.

Markieren Sie die Position der Kamera und des Fläschchens, um konsistente Bilder zwischen den Studien zu erhalten, und zeigen Sie die Studiennummer und die medikamentöse Behandlung in der Kameraansicht deutlich an. Klopfen Sie anschließend dreimal fest gegen die Arbeitsplatte und stellen Sie sicher, dass alle Fliegen auf den Boden des Fläschchens fallen, und starten Sie sofort den Timer. Machen Sie eine Minute lang alle fünf Sekunden ein Foto von dem Gerät.

Lassen Sie die Fliegen dann eine Minute lang ungestört sich erholen. Wiederholen Sie den Assay noch zwei weitere Male mit einer Erholungszeit von einer Minute zwischen jedem Versuch. Überprüfen Sie die Bilder und notieren Sie die Anzahl der Fliegen in jedem Abschnitt im Laufe der Zeit, um die Berechnungen durchzuführen, um drei Gramm Instant-OPH zu rekonstituieren, ein Medium mit 15 Millilitern deionisiertem Wasser und der entsprechenden Rotenon-Dosis.

Legen Sie die Röhrchen nach fünf Minuten vorsichtig senkrecht in durchsichtige Fläschchen und beladen Sie das feste Lebensmittel durch Drehen des Röhrchens einen Zentimeter hoch. Drücken Sie anschließend vorsichtig die Kunststoffkappe auf das Ende des Schlauchs, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Eines Tages altes Männchen fliegt mit Kohlendioxid und stecken Sie vorsichtig mit einem Pinsel eine Fliege in jede Röhre.

Verstopfen Sie dann das Ende des Schlauchs mit einem kleinen Wattebausch. Lassen Sie die Fliegen sich 15 Minuten lang von Kohlendioxid erholen, indem Sie die Röhren in horizontaler Position halten, und stellen Sie sicher, dass alle Fliegen lebendig und aktiv sind. Führen Sie die Röhrchen in den Drosophila-Aktivitätsmonitor (DAM) ein und überprüfen Sie, ob sich alle Röhrchen in der gleichen Position relativ zum DAM befinden.

Legen Sie das DAM in einen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Inkubator bei 25 Grad Celsius. Verbinden Sie als Nächstes das DAM mit dem Datenerfassungssystem. Öffnen Sie dann die DAM-Software unter Einstellungen.

Wählen Sie eine Abschnittslänge von 10 Minuten aus, um die Datenerfassung zu starten, und lassen Sie das Programm sieben Tage lang Daten sammeln. Öffnen Sie als Nächstes das DAM-Dateiscanprogramm und greifen Sie auf die Monitordaten zu, indem Sie auf Eingabedaten auswählen klicken. Wählen Sie dann den passenden Monitorbereich aus und stellen Sie die Bin-Länge auf 10-Minuten-Intervalle ein.

Wählen Sie als Nächstes im Ausgabedateityp Kanaldateien aus und belassen Sie alle anderen Optionen auf den Standardeinstellungen. Klicken Sie dann auf Daten scannen und speichern Sie die Dateien in einem bestimmten Ordner. Importieren Sie schließlich Daten in eine zirkadiane Datenanalysesoftware, um Zählungen pro Minute zu erhalten.

Nach dreitägiger Exposition gegenüber unterschiedlichen Dosierungen von Roone-Wildtyp-Kanton-Fliegen, die erhöhten Dosierungen ausgesetzt waren, zeigten sie einen Mangel an Schreckreaktion. Ein niedrigerer Prozentsatz der Fliegen befand sich im oberen Bereich und ein höherer Prozentsatz im unteren Bereich des Apparats nach 30 Sekunden, was auf einen Mangel in der Saral-Reaktion hinweist, ein ähnlicher Trend wurde bei Fliegen im Spontanlokomotionstest beobachtet. Die Zählungen pro Minute wurden im Drosophila Activity Monitor (DAM) gemessen.

Am vierten Tag nach der Exposition zeigten Fliegen, die 250 Mikromolaren und 500 Mikromolar Rotenon ausgesetzt waren, eine signifikante Verringerung der Zählungen pro Minute. Diese Assays können bequem angepasst werden, um Lokomotionsdefekte in anderen Ösophagusmodellen der Krankheit und die Wirksamkeit von Therapeutika zu charakterisieren.