Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten In-vivo-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Array von bis zu 252 eindeutig markierten fluoreszierenden Zielzellen für Immunassays mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Ziellymphozyten mit einzigartigen Kombinationen und Intensitäten von lebenswichtigen Farbstoffen wie CFSE und CTV markiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, jede einzelne Ziellymphozytenpopulation mit Kandidaten für MHC-Klasse-1- und MHC-Klasse-2-bindende Peptid-Epitope zu pulsieren.

Danach werden die Zellen ausgiebig gewaschen, um die Spezifität der Epitope zu erhalten, und dann die Zellen gepoolt und in ein Tier injiziert. Die letzten Schritte bestehen darin, die fluoreszierenden Tag-Array-Zellen aus bestimmten Geweben zu ernten, sie zu markieren und auf MHC-Peptid-spezifische Reaktionen zu untersuchen. Letztendlich können die Ergebnisse der Durchflusszytometrie CTL-Reaktionen zeigen, indem sie den Zelltod des Ziels messen, und sie können Zöliakie-4-positive T-Helferantworten zeigen, indem sie die Hochregulierung der Aktivierungsmarker des B-Zell-Ziels messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen In-vivo-CTL-Assays besteht darin, dass sie eine gleichzeitige Messung von über 250 Zielzellen in einem Tier ermöglicht, was zeigt, dass das Verfahren Ben Quire, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor.

Das Verfahren erfordert, dass Lymphozyten, die aus der isolierten Milz und/oder den Lymphknoten von Mäusen entnommen werden, gefiltert und mit bis zu 200 Millionen Zellen pro Milliliter in 11,5 Millilitern RPMI mit 5 % fötalem Kälberserum resuspendiert werden. Die Vorbereitung der FDA beginnt mit der Etikettierung. 42 10-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden von eins bis 42 in allen Zellen werden mit sieben verschiedenen Peptid-Epitopen in sechs verschiedenen Konzentrationen gepulst, die sechsmal wiederholt werden, um 252 erkennbare Zellcluster zu erzeugen.

Nun werden die Lymphozyten durch mehrmaliges Umdrehen des Schlauchs gründlich wiederbelebt. Geben Sie dann 1,9 Milliliter Zellsuspension in die 10-Milliliter-Röhrchen mit den Markierungen 37 bis 42. Achten Sie darauf, die obere Hälfte der Schläuche nicht zu benetzen.

Lösen Sie nun die Kappe des Rohres 38 und legen Sie es waagerecht an den oberen Rand des Rohres 38. Fügen Sie 83 Mikroliter PBS hinzu. Dann werden 17 Mikroliter des entsprechenden CTV-Materials hinzugefügt, wie in Tabelle zwei des Textprotokolls dargestellt.

Sobald das Rohr geladen ist, wirbeln Sie es ein. Wiederholen Sie dies mit den Röhrchen 39 bis 42. Sicherstellen, dass jede Röhre einen anderen CTV-Bestand erhält, wie in Tabelle zwei aufgeführt.

Inkubieren Sie die Zellen nun mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann fünf Milliliter RPMI mit 5% FCS in jedes Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen gründlich, indem Sie aus jedem Röhrchen vortexen. Übertragen Sie einen Milliliter Suspension auf sechs andere Röhrchen gemäß dem empfohlenen Belastungsmuster, das im Textprotokoll beschrieben ist. Bei jedem Transfer bleibt es wichtig, den oberen Teil des geladenen Röhrchens nicht zu befeuchten, um die Zellen mit CFSE zu markieren, entfernen Sie die Röhrchenkappen der Röhrchen 31 bis 36, die einen Milliliter Zellen enthalten, und legen Sie die Röhrchen horizontal neben jedes der Röhrchen.

Geben Sie zunächst 103 Mikroliter PBS hinzu und werfen Sie es auf die trockene obere Wand. Geben Sie dann sieben Mikroliter des entsprechenden CFSE-Stammes gemäß Tabelle drei des Textprotokolls hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen sofort durch. Wiederholen Sie dies mit den Röhrchen, die in Tabelle drei gruppiert sind.

Sicherstellen, dass jedes Rohr einen anderen CFSE-Schaft erhält. Inkubieren Sie alle Röhrchen mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, waschen Sie die Zellen, um die Markierung abzuschließen.

Verdünnen Sie jede Suspension mit neun Millilitern RPMI bei Raumtemperatur mit 5 % FCS. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 GS für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Überstände durch Aspiration mit einer Transferpipette. Die Herstellung von MHC-Bindungspeptiden der Klassen eins und MHC zwei wird im Textprotokoll vorgestellt. In diesem Abschnitt wird gezeigt, wie die Zellen mit diesen Peptiden gepulst markiert werden.

Zuerst resuspendieren Sie das Zellpellet im Restmedium, indem Sie die Rohre z. B. entlang eines Grills führen. Bringen Sie dann das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf 250 Mikroliter in unserem PMI mit 5%FCS. Jedes Zellpellet sollte etwa 200 Mikroliter Medium benötigen.

Geben Sie als nächstes 250 Mikroliter vorgefertigter Peptidstämme, die in Tabelle fünf aufgeführt sind, in die dafür vorgesehenen Röhrchen. Befolgen Sie das in Tabelle eins dargestellte Muster und stellen Sie sicher, dass Sie ein Kontrollröhrchen mit PBS allein zur Berechnung der T-Zell-Antworten verwenden. Es ist entscheidend, dass jedes Peptidepitop und jede Peptidkonzentration einem einzigen Röhrchen zugeordnet ist und dass dies auf der Grundlage der erwarteten Fluoreszenz der Zellen in diesem Röhrchen eindeutig aufgezeichnet wird.

Da die Fluoreszenzsignatur dieses Clusters dieses Peptid definiert, mischen Sie jede Zellsuspension durch Vortexen und inkubieren Sie die Zellen dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fahren Sie nach der Inkubation mit dem Waschen der Zellen fort, um die Zellen zu waschen. Geben Sie zunächst fünf Milliliter eiskaltes RPMI mit 5% FCS zu jeder Zellsuspension und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Röhrchen umdrehen.

Dann unterlegen Sie jede Zellsuspension vorsichtig mit drei Millilitern eiskaltem FCS-Sediment, die Zellen mit 10 Minuten Drehung bei 300 G bei vier Grad Celsius gehalten. Verwenden Sie langsames Beschleunigen und Bremsen, um sicherzustellen, dass die Lösungsschnittstelle in jedem Rohr erhalten bleibt. Saugen Sie das RPMI vorsichtig ab und saugen Sie dann das FCS ab, wobei das gewaschene Zellenpellet ungestört bleibt.

Nachdem Sie die Pellets isoliert haben, waschen Sie die Zellen erneut, um die zweimal gewaschenen Zellpellets wiederzubeleben. Suspendieren Sie sie in 10 Millilitern eiskaltem RPMI mit 5%FCS und wiederholen Sie die Zentrifugation nach dem Schleudern, gießen Sie die Überstände ab. Dann werden alle Populationen in ein neues 10-Milliliter-Röhrchen mit sechs Millilitern eiskaltem RPMI mit 5%FCS-Sediment gepoolt, die gepoolten Zellen durch Zentrifugation zusammengefasst und an diesem Punkt des gesamten Verfahrens mit einer Transferpipette die SUP-Natante abgesaugt.

Sechs Intra-Assay-Replikate können durch Markierung der Peptidpulszellen mit sechs verschiedenen CPD-Konzentrationen erzeugt werden. Geben Sie zunächst 11,4 Milliliter RPMI bei Raumtemperatur mit 5 %FCS zu dem gepoolten Zellpellet und resuspendieren Sie es gründlich durch Pipettieren. Zweitens geben Sie 1,9 Milliliter Zellsuspension in sechs neue 10-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung A bis F und achten Sie darauf, die obere Hälfte des Röhrchens nicht zu benetzen.

Um mit der Markierung der Zellen mit CPD zu beginnen, öffnen Sie das Röhrchen B und legen Sie das Röhrchen horizontal entlang der Trockenbauwand Zuerst fügen Sie 92 Mikroliter PBS hinzu, gefolgt von einem Volumen CPD gemäß Tabelle vier. Dann die Mischung verwirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Röhrchen C zwei F und stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen einen anderen CPD-Schaft erhält, wie in Tabelle vier.

Nachdem alle Röhrchen gemischt sind, lassen Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dann die Zellen zweimal, resuspendieren Sie sie zuerst in 10 Millilitern Medien mit Raumtemperatur. Zweitens, drehen Sie sie nach unten und drittens aspirieren Sie die Überstände mit einer Transferpipette.

Wiederholen Sie dann den Vorgang. Fassen Sie nun alle Zellen von den Röhren A bis F in einer einzigen Röhre in acht Millilitern Eis zusammen. Kalte Medien.

Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie schleudern, und fahren Sie mit der Injektion der Zellen in Tiere und der anschließenden Durchflusszytometrie-Analyse fort. Einzelheiten sind im Textprotokoll angegeben. Eine BC-Maus wurde mit rekombinanten Vaccinia-Viren immunisiert, die HIV V 1-Epitope exprimieren, und das Ansprechen auf verschiedene Epitope wurde mit einem 252-Parameter-FTA-Assay bewertet.

Zwei Epitopvarianten, gag mute und FTL mute, wurden im Vektor nicht exprimiert, und naiven Mäusen wurde das FTA ebenfalls injiziert. Die TA wurde von Wirtsmauszellen durch P-KH26-Markierung und FTAB-Zellen durch B-22-Antikörperfärbung mittels Durchflusszytometrie diskriminiert. Jedes der sechs intratierischen Replikate wurde auf der Grundlage von CPD-Fluoreszenz-FTA-Targets, die die verschiedenen Konzentrationen von Epitopen exprimieren, auf der Grundlage von CFSE- und CTV-Fluoreszenz gated gesetzt.

Der Anteil der spezifischen Tötung jedes Replikats wurde durch den Vergleich des FTA-Cluster-Zelltods bei geprimten Tieren im Vergleich zu entsprechenden FTA-Clustern bei naiven Tieren bewertet. Die Aktivität von Helfer-T wurde durch den Vergleich der FTA-B-Zell-Hochregulation von CD 69 bei geprimten Tieren im Vergleich zu entsprechenden FT a B-Zell-Clustern bei naiven Tieren bewertet. Aus dieser Analyse geht hervor, dass die V-V-H-I-V-Infektion die stärksten CTL-Antworten gegen das immundominante VV-Epitop F two L hervorrief, wobei 100 % der FDA-Zielzellen mit 0,001 Mikromolaren oder mehr des Epitops aus der Milz entfernt wurden.

Zusätzlich zu den CTL-Reaktionen maß der FTA-Assay auch die Helfer-T-Reaktionen, indem er die Aktivierung von FTAB-Zellen bewertete, die das H-I-V-M-H-C-Bindungsepitop der Klasse zwei exprimierten. Dies zeigte, dass eine antigenspezifische B-Zell-Aktivierung bei geprimten Tieren auftrat, was auf eine Generation von HIV-Gag, T-spezifischen T-Zell-Helfer-T-Zell-Effektoren hindeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein fluoreszierendes Zielarray mit über 250 Zielzellen erzeugen.