Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff In situ Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Inaktivierung von X-Chromosomen in differenzierten embryonalen Stammzellen der weiblichen Maus mittels gleichzeitig kombinierter DNA- und RNA-Fluoreszenz in C-2-Hybridisierung oder D-N-A-R-N-A-Fischen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Differenzierung in embryonalen Stammzellen der weiblichen Maus induziert wird. Wie bei diesem Prozess, der die normale Embryonalentwicklung nach der Implantation simuliert, wird die Inaktivierung des X-Chromosoms eingeleitet, was zu einer verstärkten Transkription und Akkumulation der Zysten-RNA führt, die für das zukünftige inaktive X-Chromosom kodiert.

Der zweite Schritt besteht darin, die differenzierten embryonalen Stammzellen mit Paraldehyd zu fixieren. Bereiten Sie als Nächstes die Sonden für den Nachweis sowohl der DNA vom X-Chromosom als auch der Zysten-RNA vor, indem Sie DNA-Fragmente mit Biotin oder Digogenin markieren. Verwendung der Nick-Übersetzung.

Der letzte Schritt besteht darin, das D-N-A-R-N-A-FISH-Verfahren durchzuführen. Die differenzierten embryonalen Stammzellen werden perme, denaturiert und mit den markierten Fischsonden hybridisiert, die anschließend mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die das Biotin oder Diggen in haps nachweisen. Letztendlich ist die Immunfluoreszenzmikroskopie SU, um die Position der beiden Chromosomen in weiblichen Zellen zu zeigen und die Expression von Zysten-RNA vom X-Chromosom zu visualisieren, das eine Inaktivierung durchläuft.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie FISH-Methoden, bei denen RNA und DNA nachträglich nachgewiesen werden, besteht darin, dass wir mit unserem Protokoll in der Lage sind, beide Arten von Nukleinsäuren gleichzeitig in derselben Probe innerhalb von weniger als zwei Tagen nachzuweisen. Obwohl kombinierte DNA und RNA bei Fischen eine Herausforderung darstellen können, unterscheiden sich die Bedingungen, die optimal für den Nachweis von DNA oder RNA sind, erheblich. Unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls sind wir in der Lage, vorhandene RNA und DNA, die von beiden X-Chromosomen abgeleitet ist, in praktisch allen analysierten Zellen nachzuweisen.

Dies hat es uns ermöglicht, das X-Chromosom bei der Aktivierung zu untersuchen, wie es bei der Differenzierung von embryonalen Stammzellen der weiblichen Maus oder bei der abnormalen Entwicklung der weiblichen Maus geschieht. Obwohl diese Methode Einblicke in den X-in-Aktivierungsprozess geben kann, der ein wichtiger und faszinierender Prozess ist, der während der frühen Embryonalentwicklung von Mäusen abläuft, kann sie wahrscheinlich auch auf andere biologische Systeme angewendet werden, in denen es wichtig ist, RNA-Transkripte nachzuweisen, die vom nativen Chromatin abgeleitet sind, da nicht-kodierende RNAs immer mehr für ihre Bedeutung in biologischen Systemen geschätzt werden und oft Einzelzellansätze gegenüber alternativen Ansätzen bevorzugt werden in denen ganze Zellpopulationen bewertet werden. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll für eine breite wissenschaftliche Gemeinschaft hilfreich sein wird.

Weibliche embryonale Stammzellen der Maus oder E-ESL werden unter Standard-ESL-Bedingungen auf gelatinierten Kulturschalen gezüchtet, die mit embryonalen Mausfibroblasten, ORMs, beschichtet sind, um das Verfahren zur Induktion der Differenzierung zu beginnen. Nehmen Sie das ES-Medium aus der ESL-Kultur und waschen Sie es zweimal mit der Zellkultur PBS. Geben Sie 1,5 Milliliter TRIPSIN EDTA hinzu, erwärmen Sie es auf 37 Grad Celsius und inkubieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 3,5 Minuten das Gericht leicht schütteln, um die Kolonien aufzubrechen.

Inaktivieren Sie das Trypsin-EDTA, indem Sie den Zellen 3,5 Milliliter Differenzierungsmedium hinzufügen, pipettieren Sie die Zellen auf und ab, um eine Einzelzelllösung zu erhalten, und sammeln Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Sammeln der Zellen in 10 Millilitern Differenzierungsmedium die Zellsuspension in eine nicht gelatinierte 10-Zentimeter-Kulturschale geben und eine Stunde lang inkubieren. In einem Zellkultur-Inkubator können MES an der nicht gelatinierten Kulturschale haften, während ES-Zellen in Suspension bleiben.

In der Zwischenzeit sterile Glasabdeckungen in Sechs-Well-Platten legen, 0,2 % Gelatine hinzufügen und mindestens fünf Minuten inkubieren. Nach einer Stunde wird bei Raumtemperatur die Snat der prepl ESL-Kultur entnommen, die hauptsächlich aus nicht anhaftenden ESLs bestehen wird. Nach dem Verdünnen der E-ESL-Platte in Sechs-Well-Platten mit Deckgläsern.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Differenzierungsmedium aus den Differenzierungskulturen entfernen und zweimal mit Zellkultur-PBS waschen. Achten Sie darauf, PBS vorsichtig hinzuzufügen, um zu verhindern, dass die Zellen weggespült werden. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 4%para Formaldehyd PBS hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie nach 10 Minuten das Para-Formaldehyd und waschen Sie die Einbezugsbezüge dreimal mit 70%igem Ethanol. Um die DNA-Sonden für die Markierung vorzubereiten, verdünnt man zunächst je ein Mikrogramm der jeweiligen DNA in Wasser mit einem Gesamtvolumen von 16 Mikrolitern. Fügen Sie dann vier Mikroliter Ochsengenin oder Biotin-Markierungslösung hinzu, die durch Vortexen gemischt wird, und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 16 Grad Celsius.

Dabei werden die mit Biotin oder DIG-Sauerstoff markierten Nukleotide durch NIC-Translation integriert. In der Zwischenzeit die Säulen G 50 vorbereiten. Um nicht integrierte Nukleotide zu entfernen, nehmen Sie eine Zwei-Milliliter-Spritze, entfernen Sie den Stempel und geben Sie sterilisierte Watte in die Spritze.

G 50 Kugeln und Lösung hinzufügen, um die Spritze zu füllen. Legen Sie dann eine Spritze für eine Minute in eine 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 642 GS. Nach der Zentrifugation sollten etwa 80 % der Spritze mit G 50 gefüllt werden. Nach 90 Minuten fügen Sie 40 Mikroliter Wasser zu jedem NIC-Translationsreaktionsgemisch hinzu und übertragen Sie die Reaktion auf die G 50-Säule.

Geben Sie ein leeres Röhrchen unter die Säule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 642 g. Den Durchfluss wird in einem Reaktionsrohr aufgefangen. Messen Sie das Volumen des Durchflusses mit einer Pipette und fügen Sie dann Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen.

Um den Durchfluss zu beschleunigen, fügen Sie Lachsspermien, DNA-Hefe TRNA, die Maus gefangen 1D NA und zwei molare Natriumacetate hinzu, die durch Vortexing gemischt wurden. Fügen Sie 533 Mikroliter eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu und schütteln Sie die Röhrchenzentrifuge bei 16.200 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Abschluss der Zentrifugation wird das Supra natant entfernt und das Pellet zweimal mit einer 70%igen Ethanolzentrifuge bei 16.200 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius gewaschen und an der Luft getrocknet.

Wenn das Pellet trocken ist. Fügen Sie 50 Mikroliter und eine 50 plus-Hybridisierungslösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Um das Auflösen vor der Permeation zu erleichtern, rehydrieren Sie fixierte Zellen, indem Sie das 70%ige Ethanol entfernen und den Zellen Zellkultur-PBS zusetzen.

Inkubieren Sie fünf Minuten lang, wiederholen Sie dies insgesamt dreimal, um die Zellen zu mobilisieren. Entfernen Sie das PBS der Zellkultur und geben Sie 0,2 % Pepin in die sechs Well-Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für vier Minuten.

Entfernen Sie danach das Pepin und inaktivieren Sie es mit RNA-freiem Wasser. Nach der Fixierung der Zellen werden sie nach der Fixierung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4%Paraformaldehyd PBS inkubiert, zweimal mit Zellkultur oder PBS für fünf Minuten gewaschen. Dehydrieren Sie die Zellen, indem Sie drei Minuten lang mit 70 % Ethanol, drei Minuten lang 90 % Ethanol und drei Minuten lang hundert Prozent Ethanol inkubieren.

Übertragen Sie danach die Deckgläser aus den sechs Well-Platten und trocknen Sie die Deckgläser einige Minuten lang. Altern Sie die Zellen, indem Sie die Deckgläser eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius auf einer heißen Platte inkubieren. In der Zwischenzeit werden prähybridisierte Fische mit Mausmantel 1D NA durch Addieren für jedes zu analysierende Deckglas verwendet.

25 Mikroliter 50 plus Hybridisierungslösung. Ein Mikroliter Biotin-markierte Zyste Sonde, ein Mikroliter Digo-Sauerstoff und markierte BAC-Sonde zum Nachweis des X-Chromosoms und 0,5 Mikroliter Maushülle 1D NA, gemischt durch Vortexen und in der Natur bei 99 Grad Celsius für fünf Minuten. Sofort bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten inkubieren, damit das cot 1D NA hybridisieren kann, um die in der Sonde vorhandenen Sequenzen zu wiederholen.

Sobald die Zellen auf den Deckgläsern gealtert sind, geben Sie 50 Mikroliter Reifungspuffer auf einen Objektträger und legen Sie die Deckgläser auf die Zellen mit Blick auf den Reifungspuffer. Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Nach der Fixierung der Zellen werden die Deckgläser zurück in die sechs Well-Platten übertragen, die mit eiskaltem Ethanol und 70 % Ethanol befüllt sind, und fünf Minuten lang inkubiert.

Dehydrieren Sie die Zellen durch anschließende Inkubation in 70 % Ethanol für drei Minuten, 90 % Ethanol für drei Minuten und 100 % Ethanol für drei Minuten. Entfernen Sie die Deckgläser von den Sechs-Well-Platten und lassen Sie sie einige Minuten an der Luft trocknen. Spot die vorhybridisierte Sonde auf einem Objektträger und den Inkubator mit einem Deckglas darauf.

Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer, die mit 50 Millilitern 50%IDE two XSSC gefüllt ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation über Nacht werden Abdeckfolien von Glasobjektträgern auf sechs Wandplatten übertragen, die mit zwei XSSC befüllt und auf 42 Grad Celsius vorerwärmt wurden. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 42 Grad Celsius.

Entfernen Sie zwei XSSC und fügen Sie 50% von MI zwei XSSC hinzu. 10 Minuten bei 42 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie mit 50% Form IDE zwei X-S-S-C-A insgesamt dreimal für 10 Minuten bei 42 Grad Celsius pro Waschgang.

Nach dem dritten Waschen entfernen Sie die 50% aus meinen beiden XSSC und waschen Sie die Objektträger zweimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Stelle mit 50 Mikrolitern Tris-Kochsalzlösung BSA oder T-S-P-S-A zu blockieren. Ihr Deckblatt schlüpft auf neue Objektträger und legt die Deckgläser kopfüber auf das Glasobjektträger, inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunklen Kammer. Nach 30 Minuten die Deckfolien zurück in die Sechs-Well-Platten übertragen und zweimal fünf Minuten lang mit TST für den ersten Antikörper-Inkubationsspot, 50 Mikroliter Schaf-Antigen und Antikörper pro Deckfolie auf neue Glasobjektträger übertragen und Deckgläser kopfüber auf den Glasobjektträger legen, 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST befeuchteten Dunkelkammer inkubieren.

Anschließend werden die Deckgläser mit einer Reihe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Nach der Inkubation mit einer Reihe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern dehydrieren Sie die Zellen durch Inkubation für jeweils drei Minuten in 70 % Ethanol, 90 % Ethanol und 100 % Ethanol. Entfernen Sie die Deckgläser von den Sechs-Well-Platten und lassen Sie sie einige Minuten an der Luft trocknen.

Zum Schluss entdecken Sie einen Tropfen Eindeckmedium mit Dappy auf jedem Objektträger. Füge einen Deckslip mit dem Kopf nach unten auf und versiegele die Dias mit Nagellack. Mit diesem Protokoll kann die Inaktivierung des Fisch-X-Chromosoms für kombinierte D-N-A-R-N-A-Fische in differenzierenden weiblichen ES-Zellen sichtbar gemacht werden.

Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein A-D-N-A-R-N-A-A-Fischexperiment, bei dem sowohl die Zysten-RNA als auch eine Region des X-Chromosoms gleichzeitig nachgewiesen werden. Zyste, RNA ist eine nicht-kodierende RNA, die für den Prozess der Inaktivierung des X-Chromosoms unerlässlich ist. Bei der Unterscheidung der weiblichen ESL-Zyste wird RNA mit einer Biotin-markierten CD NA-Sonde nachgewiesen, die mit Antikörpern sichtbar gemacht wird, die an den Rumin konjugiert und rot markiert sind.

Das X-Chromosom wird mit einer xigen in markierten BAC-Sonde nachgewiesen, die mit Antikörpern sichtbar gemacht wird, die an FITC konjugiert sind, angezeigt in grünen Zellkernen, die mit DPI kontrastgefärbt sind, die in blau angezeigt sind. In fast jeder Zelle werden zwei x-Chromosomen nachgewiesen. Es werden sowohl große Zystenansammlungen auf den inaktiven X-Chromosomen oder Zystenwolken als auch die basale Zystenexpression vom aktiven X-Chromosom oder den Zysten-Pinpoints nachgewiesen.

Die Zystenpunkte werden nicht in jedem Zellkern nachgewiesen, da diese basale Zystenexpression bei der Differenzierung auf dem zukünftigen aktiven X-Chromosom gestoppt wird. Beachten Sie, dass einige der punktuellen Signale, die vom X-Chromosom abgeleitet werden, innerhalb von Zystenwolken lokalisiert sind, was zeigt, dass die Zystenwolke tatsächlich entlang des X-Chromosoms lokalisiert und kodiert, sobald es gemeistert ist. Diese Technik kann in weniger als zwei Tagen und mit einem zuverlässigen Ergebnis durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der weiblichen Maus induziert, wie man diese Zellen fixiert und wie man sie vorbereitet, damit man kombinierte D-N-A-R-N-A-Fische herstellen kann. Denken Sie daran, dass es für den Erfolg Ihrer Experimente wichtig ist, Temperaturen und Inkubationszeiten konstant zu halten, wie in diesem Protokoll angegeben. Außerdem ist es wichtig, in einer sauberen Umgebung zu arbeiten.

Wenn Sie einen anderen Zelltyp verwenden oder ein anderes biologisches System untersuchen, sind möglicherweise einige Optimierungen erforderlich, um ein optimales Ergebnis zu erzielen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.