Name: Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff In situ Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Erfahren Sie die kombinierte DNA-RNA-FISH-Methode zur Untersuchung der X-Chromosom-Inaktivierung in differenzierten weiblichen embryonalen Mausstammzellen. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Detektion von Nukleinsäuren in situ.

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Die Autoren danken allen bisherigen und aktuellen Mitgliedern der Abteilung für Reproduktion und Entwicklung des Erasmus MC für die hilfreichen und anregenden Diskussionen in den letzten Jahren. Wir möchten uns auch bei den drei anonymen Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback bedanken. Die Arbeit im Labor in Gribnau wird durch eine Förderung des niederländischen Forschungsrats (NWO-VICI) und einen ERC Starting Grant unterstützt.

1. Induktion der Differenzierung in weiblich embryonalen Stammzellen zu X-Chromosom-Inaktivierung herbei HINWEIS: Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus (auf Anfrage erhältlich) werden unter Standardbedingungen auf ES-Zellkulturschalen verkleistert mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) beschichtet gewachsen. Wir hier davon aus, dass der Leser mit Standardzellkulturtechniken 39-41 vertraut ist. Um die Differenzierung zu induzieren, werden ES-Zellen in T25 Schalen gezüchtet aus den MEFs getrennt werden, und wird in Differenzierungsmedium plattiert werden. <ol><li> Entfernen ES-Medium aus der ES-Zell-Kultur, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. </li><li> 1,5 ml Trypsin-EDTA (37 ° C vorgewärmt) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 7 min. Nach 3,5 min, schütteln die Schale vorsichtig, brechen die Kolonien. </li><li> Inaktivierung des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3,5 ml Differenzierungsmedium zu den Zellen. Pipette Zellen nach oben und unten, um eine einzelne Zelle Lösung zu erhalten, und sammelnin einem 15-ml-Tube. Spin für 5 min bei 200 × g gesammelt und Zellen in 10 ml Differenzierungsmedium. </li><li> Hinzufügen Zellsuspension auf eine nicht-gelatinierten Kulturschale, und Inkubation für 1 h in einem Zellkulturbrutschrank. HINWEIS: MEFs in der Lage, mit dem nicht-gelatinierten Kulturschale anhaften, während ES-Zellen in Suspension verbleiben. </li><li> In der Zwischenzeit, fügen sterilisierte Glasdeckgläser (24 x 24 mm) auf 6-Well-Platten mit 0,2% Gelatine und inkubieren minimal 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 1 Stunde Sammeln des Überstands des vorgalvanisierten ES-Zellkultur, die hauptsächlich aus wird der nichthaftenden ES-Zellen. Platte ES-Zellen zu 6-well-Platten mit Deckgläsern. HINWEIS: Verwenden Sie ⅙ th einer konfluenten T25 Gericht für 6 Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Dies wird eine Differenzierung konfluenten gut nach 3 Tagen der Differenzierung zu ermöglichen. Änderungsmedium auf einer täglichen Basis. Für längere Zeit Differenzierungskurse, Platte vor, vernickelt ES-Zellen in Differenzierungsmedium in bakteriellen Gerichte und incubaß auf einem Schüttler Zelle in den Zellkulturbrutschrank integriert. Dies ermöglicht es den Zellen, embryonale Körper, die 1-2 Tage vor der Fixierung auf Deckgläsern ausplattiert werden können zu bilden. </li></ol> 2. Fixierung von differenzierten ES-Zellen für spätere DNA-RNA-FISH-Analyse <ol><li> Entfernen Differenzierungsmedium von Differenzierung Kulturen, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. HINWEIS: In den PBS sorgfältig verhindern, dass die Zellen weggewaschen. </li><li> Entfernen Zellkultur PBS und fixieren Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd (PFA) / PBS und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. ACHTUNG: PFA ist giftig und kann erhebliche gesundheitliche Risiken verursachen, wenn sie eingeatmet oder wenn sie in Kontakt mit Haut oder Augen. Darüber hinaus ist PFA krebserregend. </li><li> Entfernen Sie 4% PFA / PBS und Deckgläser 3x waschen mit 70% Ethanol. HINWEIS: Richtig Waschen ist wichtig, da eine Spur von PFA wird mit anschließender FISH Schritte stören. Deckgläser in 70% Ethanol bei -20 ° C für mehrere Monate vor der F gespeichert werdenISH-Analyse. </li></ol> 3. Markierung von DNA-Sonden für FISH Experimente HINWEIS: Besorgen Sie sich ein DNA-Fragment mit dem Gen von Interesse (Mindestlänge&gt; 2 kb für die RNA-FISH, oder&gt; 20 kb für die DNA-FISH), oder eine BAC für das Gen von Interesse. Für RNA-Nachweis kann eine kleinere Sonde ausreichend sein im Vergleich zu den DNA-Nachweis, da wahrscheinlich die Transkription in mehreren Transkripte, die gleichzeitig detektiert werden können führen. Für ein starkes Signal auf der Einzelkopie-DNA-Strang wird eine längere Sonde erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von einge Haptene erkennen. Vorzugsweise wird ein nicht-transkribierte genomische Region für die Gestaltung der DNA-Sonde ausgewählt. Wenn außerdem die Verwendung einer kleineren Sonde, um die RNA zu detektieren, wird es verhindert, dass die genomische Loci von der die RNA transkribiert wird, die in der kombinierten DNA-RNA-FISH Ansatz erkannt, obwohl dies nicht ganz ausgeschlossen werden kann. Um zu erkennen, Maus Xist wurde ein 5,5 kb cDNA-Sonde verwendet. Für detbschnitt des X-Chromosoms, BAC mehrere Sonden verwendet werden. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus BAC RP23-100E1 und 474E4-BAC CT7, die in der Nähe des Ortes angeordnet sind Xist ermittelt. Je nach dem Gen oder Chromosom von Interesse ist, kann mehrere unterschiedliche Sonden erforderlich, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Immer, wenn die Arbeit mit Materialien, die für RNA-FISH verwendet werden soll, verwenden Sie sterile Filterspitzen, RNase-freiem H 2 O, und die Arbeit in einer sauberen Umgebung. <ol><li> Nimm 1 ug DNA und verdünnt in H 2 O in einem Gesamtvolumen von 16 ul. In 4 ul von Digoxigenin oder Biotin Markierungslösung (siehe Reagenzien), durch Vortexen mischen und Inkubation bei 16 ° C für 90 min. HINWEIS: Die Biotin oder Digoxigenin markierten Nukleotiden wird nun durch Nick-Translation eingebaut werden. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten G50 Spalten auf nicht-integrierte Nukleotide zu entfernen. Nehmen Sie ein 2-ml-Spritze, entfernen Sie den Stempel, und fügen sterilisiert Baumwolle in die Spritze. In G50-Kugeln in Lösung to Füllen der Spritze, Spritze in einem 15 ml-Zentrifugenrohr und bei 642 g für 1 min. HINWEIS: Rund 80% der Spritze sollte jetzt mit G50 gefüllt werden. Wiederholen Sie, wenn weniger G50 vorhanden ist. </li><li> Nach 90 min werden 40 ul H 2 O zu der Nick-Translation Reaktionsgemisch, und fügen Sie die Reaktion auf die Säule G50. Fügen Sie ein Leerrohr unter der Spalte und Zentrifugieren bei 642 g für 2 min. Die Strömung durch Sammeln in einem Reaktionsrohr. </li><li> Messung des Volumens der Strömung durch mit einer Pipette, und geben H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 200 &amp;mgr; l zu erreichen. Ausfällung der Strömung durch Zugabe von 13,3 ul Lachssperma-DNA (10 mg / ml), 13,3 ul Hefe-tRNA (10 mg / ml), 26,7 &amp;mgr; l Maus Cot-1-DNA (1 mg / ml) und 28 ul 2 M NaAc, pH-Wert 5.6. Mischen durch Vortexen, und fügen Sie 533 ul eiskaltem 100% Ethanol. Schütteln des Röhrchens und Zentrifuge bei 16.200 × g für 30 min bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Wasch Pellet zweimal mit 70% Ethanol. Zentrifugieren bei 16.200 × g für 5 min bei4 ° C und an der Luft trocknen die Pellets. Dann werden 50 &amp;mgr; l Hybridisierungslösung + 50, und bei 37 ° C für 30 min bis Auflösen zu erleichtern. HINWEIS: Die markierte Sonde kann für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden ACHTUNG: 50 + Hybridisierungslösung enthält Formamid, das giftig ist, kann die Haut, die Augen und die Atemwege reizen, und ist auch ein teratogen. </li></ol> 4. Permeabilisierungs, Vorbehandlung und Hybridisierung der fixierten Zellen für den kombinierten DNA-RNA-FISH <ol><li> Rehydrieren fixierten Zellen auf Deckgläsern, indem 70% Ethanol und die Zugabe von Zellkultur PBS auf die 6-well-Platten. Inkubation für 5 min. Wiederholen insgesamt drei Mal. </li><li> Zellkultur-PBS entfernen, und fügen Sie 0,2% Pepsin zu den 6-Well-Platten, um die Zellen permeabilisiert. Inkubieren Platten mit 6 Vertiefungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 4 min. Entfernen Pepsin, und inaktivieren mit RNAse freien H 2 O. </li><li> Postfix-Zellen durch Inkubation mit 4% PFA / PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach fixatiauf, zweimal waschen mit Zellkultur PBS für 5 min. </li><li> Dehydratisieren Zellen durch Inkubation mit 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Überdeckgläser aus der 6-Well-Platten und an der Luft trocknen Deckgläser für einige Minuten. </li><li> Alter Zellen durch Inkubation Deckgläser bei 65 ° C für 1 Stunde auf einer Wärmeplatte. </li><li> Pre-FISH-Sonde hybridisieren, mit Maus-Cot-1 DNA durch Addition zu jedem Deck analysiert, 25 ul 50 + Hybridisierungslösung, 0,5 &amp;mgr; l Maus-Cot-1-DNA, 1 &amp;mgr; l Biotin-markierten Sonde Xist und 1 &amp;mgr; l Digoxigenin markierten BAC-Sonde Erfassung der X-Chromosom. Vortexen und Denaturierung bei 99 ° C für 5 min. Inkubation sofort auf 37 ° C für 45 min, damit Cot-1-DNA zu hybridisieren, um in den Sonden vorhandenen Sequenzen wiederholen. </li><li> Nach der Alterung Stelle 50 ul Denaturierungspuffer (bestehend aus 70% formamide/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer) auf einem Glasträger und Deckgläser gelegt oben mit Zellen gegen towards Denaturierung Puffer. Inkubieren bei 65 ° C für 2 min. </li><li> In Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und Post-fix-Zellen durch Inkubation in eiskaltem 70% Ethanol für 5 min. </li><li> Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten. </li><li> Finde Pre-hybridisierten Sonde auf einem Glasobjektträger und Deckglas auf inkubiert. Die Objektträger in einer feuchten Kammer mit 50 ml 50% formamide/2x SSC gefüllt und inkubiert über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> 5. Post-Hybridisierung Waschanlagen und Antikörper-vermittelte Erkennung von Probe <ol><li> Füllen 6-Well-Platten mit 2x SSC und Pre-warmen bis 42 ° C Hinzufügen Deck nach Inkubation über Nacht, und Inkubieren bei 42 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen 2x SSC, und Inkubieren Deckgläser mit 50% formamide/2x SSC für 10 min bei 42 ° C. Wiederholen Sie insgesamt 3-mal (30 min Waschen insgesamt). </li&gt; <li> Entfernen von 50% formamide/2x SSC und Waschen Folien mit Tris-Kochsalzlösung-Tween (TST) für 2 x 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Punkt 50 ul Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für die Sperrung während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Schaf-anti-Dig-Antikörper (1:500 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation upside-down für den ersten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den zweiten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . </li><li> Transfer Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Spot 50 ul Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger und Deckgläser inkubieren Kopf zum dritten Inkubationsschritt bei 30 min bei Raumtemperatur in einem TST-befeuchteten Dunkelkammer . </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Maus-Anti-Biotin-Antikörper (1:200 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den vierten Schritt während der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Esel-Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum fünften Inkubationsschritt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchtet dunklen chambäh. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Ziege-anti-Pferd-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum sechsten Schritt die Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . HINWEIS: die Ziege-anti-Pferd-Antikörper die Esel-anti-Maus-Antikörper zu erkennen; wenn verfügbar, um den Forscher, wird ein Ziege-anti-Antikörper Esel so gut funktionieren. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. Waschen Sie weitere 5 min mit Tris-Kochsalzlösung (TS). </li><li> Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten. </li><li> Spot eine Tropfen Eindeckmedium mit DAPI (siehe Reagenzien) auf einen Objektträger und Deckglas fügen Kopf an der Spitze. Siegel Dias mit Nagellack undbeurteilen FISH-Ergebnisse durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1). </li></ol>

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<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li>
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<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
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<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kombinierte DNA-RNA-FISH technisch eine Herausforderung sein, die Bedingungen für DNA-FISH können zu hart für weniger stabile RNA-Moleküle sein. Es wurden verschiedene Ansätze angewendet, um sowohl DNA als auch RNA in einer Zelle zu untersuchen, unter Umgehung der Notwendigkeit einer gleichzeitigen Inkubation mit Sonden Erfassen sowohl der DNA und RNA. Beispielsweise in einer Überlagerungsansatz wird zuerst RNA-FISH durchgeführt, und die Zellen abgebildet werden, und die Koordinaten genommen werden. Anschließend werden ...

Studieren Zellen und Gewebe mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat sich seit ihrer Einführung in den späten 1970er Jahren ein, konnten die Forscher um Gene, Chromatin-Organisation und Genexpression auf subzellulärer Ebene zu studieren. DNA-FISH wird häufig in Zytogenetik, Karyotypisierung 2, 3 und Krebsdiagnostik Präimplantations-Screening-4 verwendet wird, und hat eine wichtige Rolle in der Molekularforschung 6.5, da es die Detektion von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Einzelzell-Expressionsanalyse von RNA-FISH können native primären Transkripte zu erkennen und nicht-kodierenden RNAs transkribiert Chromosomen aus und bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, die Genexpression auf Bevölkerungsebene Einschätzung liegen, wie beispielsweise quantitative RT-PCR, genomweite Expressionsanalyse oder Northern Blot . Durch die Visualisierung RNA-Transkripte, die direkt aus ihren Ursprungsorten hat es zum Beispiel gewesen,bemerkt, dass die Genexpression stochastischen 7, und kann manchmal allelspezifische 8 sein. Verbesserungen in der Technik sogar erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle innerhalb von Zellen 9-11. Das Grundprinzip besteht aus FISH-Hybridisierung von Nukleinsäuren in der Zelle zu einer Nukleinsäuresonde mittels hochspezifische Watson und Crick Basenpaarung. Die Sonde kann entweder direkt oder indirekt erfasst, was zu einem Signal, das mikroskopisch sichtbar gemacht werden kann. Anfängliche Versuche bestand aus radioaktiv markierten Sonden, die Nachteile der Grundlage von Sicherheitsfragen, begrenzte räumliche Auflösung und die Fähigkeit, nur ein Ziel zu einer Zeit zu erfassen 12-14 hatten. Die weitere Entwicklung der nicht-radioaktiven Labels, darunter Fluorochrome, Haptene, und Enzyme, hat die weit verbreitete Nutzung von FISH als Routine Molekularbiologie Technik erlaubt. Die FISH-Sonde kann entweder direkt mit fluoroch gekennzeichnet werdenromes durch chemische Verknüpfung der Fluoreszenzmoleküle an Nukleinsäure-Sequenzen 15 und die Integration der fluoreszierend markierten Nucleotide 16-19, oder die Sonde kann indirekt nach Integration Haptene (wie Biotin und Digoxigenin) und immunologischen Nachweis von Haptenen durch Hapten spezifischen Antikörper konjugiert visualisiert fluoreszierenden Reportermoleküle 20-21. Der letztere Ansatz erlaubt eine Signalverstärkung durch die Verwendung mehrerer Schichten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die verwendet werden, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, und ermöglicht den Nachweis von RNA-Spezies, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Durch die Kombination von direkten und indirekten Markierungstechniken und verschiedene Haptene können mehrere Ziele gleichzeitig innerhalb der gleichen Zelle sichtbar gemacht werden. Einer der wichtigsten Schritte bei der FISH-Protokolle ist die Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel. Obwohl in der Theorie, eine Sonde zu binden, die spezifisch nur an sein Ziel in der Praxis diese Spezifitätist nicht immer erreicht, da Sonden, um homologe Regionen binden und Hybridisierungsbedingungen nicht immer ideal für eine bestimmte DNA-Region oder RNA Spezies. Post-Hybridisierungswaschanlagen sind daher von besonderer Bedeutung, da sie die Stringenz der FISH-Verfahren zu erhöhen, und kann nicht-spezifische Bindung von FISH-Sonden, die in einem hohen Pegel von Hintergrundrauschen führen würde. Wie RNA-Moleküle werden Einzelstrang können sie leicht zu einer FISH-Sonde hybridisiert werden. Im Gegensatz dazu benötigt das doppelsträngige DNA-Molekül einen ersten Denaturierungsschritt, wonach eine Sonde hybridisieren kann. Dies wird normalerweise durch Erhitzen der Probe, die Denaturierung der DNA Ergebnisse erzielt. Doch unter diesen harten Bedingungen kann zerbrechlich, einsträngige RNA-Moleküle verloren. Daher kombinierten DNA-RNA-FISH erfordert erhebliche Optimierung der Bedingungen und ist technisch anspruchsvoll gegenüber der getrennten Erkennung von nur RNA oder DNA. Hier haben wir Präsentationta detailliertes Protokoll der kombinierten, gleichzeitigen DNA-RNA-FISH, die uns erlaubt hat, X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) bei der Differenzierung von weiblichen Maus embryonale Stammzellen 22-24 studieren. XCI ist ein entscheidender epigenetischen Mechanismus für weibliche Embryonalentwicklung 25 und führt heterochromatinization und somit Silencing eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Individuen 26-27. Wesentlich für dieses Verfahren ist die nicht-kodierende RNA Xist 28-30, die durch die RNF12 22-23 und 24 REX1 Proteine ​​reguliert wird. Xist Expression wird über die Zukunft inaktiven X-Chromosom (Xi) während der embryonalen Entwicklung oder bei der ES-Zelldifferenzierung in vitro hochreguliert und kann entlang der X-Chromosom verteilt und dadurch gewinnen Chromatin Remodeling Enzyme, die in der Transkriptionsherunterfahren des X-Chromosoms 31 führen. Diese Ausbreitung Xist RNA durch RNA-FISH als Beschichtung des X-Chromosom visualisierteinige, die auch als Xist Wolke bezeichnet wird. Da weibliche ES-Zellen können einem ihrer X-Chromosomen durch genomische Instabilität zu verlieren, wir und andere kombinierte DNA-RNA-FISH eingesetzt haben, XCI zu untersuchen, um sicherzustellen, dass nur karyotypisch stabile Zellen werden in der Analyse dieses wichtigen Prozesses 22,32 bewertet -34. Wie in jedem molekularbiologischen Technik haben mehrere ausgezeichnete Protokolle veröffentlicht 35-38. Hier präsentieren wir unsere Methode, ausgehend von der Induktion der Differenzierung in Maus-ES-Zellen, Fixierung von Zellen, die Kennzeichnung von FISH-Sonden durch Nick-Translation, Vorbehandlung von fixierten Zellen zu ermöglichen Permeabilisierung und anschließender Sondenaufnahme, Hybridisierung der Sonde an die Ziel und schließlich Detektion der Sonde durch Fluoreszenz-markierten Antikörpern. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Gläubigen Erkennung von Xist RNA und das X-Chromosom innerhalb einer Frist von zwei Tagen, und die Grundlagen dieser Technik kann wahrscheinlich angepasst werden otihre Systeme und Forschungsbereiche.

<table><tbody><tr><td>Embryonale Stammzellen</td><td></td><td></td> der weiblichen Maus <td>werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Embryonale Fibroblasten</td><td></td><td></td> der Maus <td>können aus E13.5-Embryonen oder über kommerzielle Quellen z. B. Millipore</td></tr><tr><td>ES Zellkulturmedium</td><td></td><td></td> <td>gewonnen werdenDMEM, 15 % fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1 mM &#947;-Mercaptoethanol und 1.000 U/ml LIF. Filter, sterilisieren und bei 4 &#176 lagern; C für maximal 2 Wochen.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES Zelldifferenzierungsmedium</td><td></td><td></td><td>IMDM-Glutamax, 15% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, nicht-essentielle Aminosäuren, 37,8 &#956; l/L Monothioglycerin und 50 &#956; g/ml Ascorbinsäure</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 Zellkulturschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25 % (v/v) Trypsin/0,2 % (w/v) EDTA in PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhrchen</td><td>Falcon 352196</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 mm Deckgläser</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>bereiten Sie eine 0,2 %ige Gelatine/Zellkultur-PBS-Lösung vor und autoklavieren</td> Sie</tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Verdünnung auf 0,2 % in 0,01 M HCl (pH 2,0)</td></tr><tr><td>absolut 100 % Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2,5L</td><td>verwendet absolut 100 % Ethanol und RNAse freies Wasser zur Herstellung von 70 % und 90 % Ethanol</td></tr><tr><td>Lösungen RNAse freies Wasser</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>sterile Filterspitzen</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-Markierungskit (DIG-Nick-Übersetzung)</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-Markierungskit (Biotin Nick-Übersetzung)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr> 2 <tr><td>ml Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>sterilisierte Baumwolle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>Tuben Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>Hefe tRNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Lachs Spermien DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Maus cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf gekühlte Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ Hybridisierungslösung</td><td></td><td></td><td>50 % Formamid, 2x SSC, 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 10 % Dextransulfat pH 7</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Acros organische Stoffe</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Phosphatpuffer, pH 7</td><td></td><td></td><td>57,7 ml 1 M Na2HPO4 und 42,3 ml 1 M NaH2PO4; DEPC-behandeltes Wasser und Autoklav-Denaturierungspuffer</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>verwenden 70% Formamid/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7,5 Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Kochsalzlösung-Tween Waschlösung (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x Kochsalzlösung, 50 ml 2M Tris, 500 &#956; l Tween-20, RNAse freies Wasser bis 1 l</td></tr><tr><td>10x Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td>zugeben, 85 g NaCl in 1 l RNAse freies H2O aufzulösen und</td></tr><tr><td>Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956 autoklavieren; L 10x Kochsalzlösung, 250 &#956; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse frei H2O</td></tr><tr><td>BSA, gereinigt, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td> Schaf-Anti-Ausgrabungs-Antikörper <td></td></tr><tr><td></td> Roche <td>Diagnostics</td><td></td><td>verwendet 1:500 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper, konjugiert mit FITC</td><td>Jackson Labore</td><td></td><td>verwenden 1:250 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC</td><td>Jackson </td><td></td> Labore <td>verwenden 1:250 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Maus-Anti-Biotin-Antikörper</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>verwenden 1:200 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit Rhodamin</td><td>Jackson Labore</td><td></td><td>verwenden 1:250 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Pferde-Antikörper, konjugiert mit Rhodamin</td><td>Jackson Labore</td><td></td><td>verwenden 1:250 verdünnt in TSBSA</td></tr><tr><td>Tris-Kochsalzlösung (TS)</td><td></td><td></td><td>10 ml 10x Kochsalzlösung, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse freies H2O</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluoreszierendes Miscroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombinierte dna-rna-leuchtstoff<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung (fish) zu x-chromosom-inaktivierung in differenzierte weiblich embryonalen stammzellen der maus studieren

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die molekularen Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen ermöglicht. FISH DNA ist oft in der Zytogenetik und Krebsdiagnostik verwendet und können Aberrationen des Genoms, die oft wichtige klinische Auswirkungen erkennen. RNA-FISH können verwendet werden, um RNA-Moleküle in Zellen zu erfassen und wichtige Einblicke in die Regulation der Genexpression zur Verfügung gestellt. Die Kombination von DNA-und RNA FISH innerhalb der gleichen Zelle ist technisch anspruchsvoll, da die Bedingungen für DNA-FISH vielleicht zu hart für zerbrechlich, einzelsträngige RNA-Moleküle sein. Wir präsentieren hier eine leicht anwendbare Protokoll, das die kombinierte, simultane Detektion von Xist RNA und DNA von den X-Chromosomen kodiert ermöglicht. Diese kombinierte DNA-RNA-FISH-Protokoll kann wahrscheinlich andere Systeme, bei denen sowohl RNA und DNA nachgewiesen werden müssen aufgebracht werden.

Verwendung des vorstehend erwähnten Protokolls für den kombinierten DNA-RNA-FISH, waren wir in der Lage, X-Chromosom Inaktivierung der Differenzierung embryonaler Stammzellen weiblichen visualisieren. Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein DNA-RNA-FISH-Experiment, wo wir beide Xist (was detektiert als sogenannte Xist RNA Wolke auf dem inaktiven X-Chromosom und einem basalen Transkriptionspunkt auf dem aktiven X-Chromosom) und einer Region des X-Chromosoms, die als punktSigna...

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die X-Chromosomen-Inaktivierung in differenzierten weiblichen embryonalen Mausstammzellen mittels simultan kombinierter DNA- und RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, auch DNA-RNA-FISH genannt, zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Differenzierung in weiblichen embryonalen Mausstammzellen induziert wird. Während dieses Prozesses, der der normalen embryonalen Entwicklung nach der Implantation entspricht, wird die X-Chromosomen-Inaktivierung eingeleitet, was zu einer verstärkten Transkription und Anreicherung von Xist-RNA führt, die für das zukünftig inaktive X-Chromosom kodiert.Der zweite Schritt besteht darin, die differenzierten embryonalen Stammzellen mit Paraldehyd zu fixieren. Danach bereiten Sie die Sonden zur Detektion sowohl der DNA vom X-Chromosom als auch der Cyst-RNA vor, indem Sie DNA-Fragmente mit Biotin oder Digoxigenin markieren. Verwenden Sie die Nick-Translation. Der letzte Schritt besteht darin, die D-N-A-R-N-A-FISH-Prozedur durchzuführen. Die differenzierten embryonalen Stammzellen werden permeabilisiert, denaturiert und mit den markierten FISH-Sonden hybridisiert, die anschließend mithilfe

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Wir haben ein leicht anpassbares strangspezifisches Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokoll (FISH) in Kombination mit Immunfluoreszenz entwickelt. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der RNA-Dynamik bei gleichzeitigem Einblick in die Chromatinstruktur, die Kernorganisation und die Transkriptionsregulation auf Einzelzellebene.

Schnell Fluorescent In-situ- Hybridisierung Protokoll für Xist-RNA in Kombination mit Immunfluoreszenz von Histonmodifikationen in X-Chromosom-Inaktivierung

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Erfahren Sie die kombinierte DNA-RNA-FISH-Methode zur Untersuchung der X-Chromosom-Inaktivierung in differenzierten weiblichen embryonalen Mausstammzellen. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Detektion von Nukleinsäuren in situ.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff In situ Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren (Video) | JoVE Journal

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff

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