Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den elektrischen Strom über einen einzigen Ionenkanal zu messen. Dies wird erreicht, indem der interessierende Ionenkanal zunächst heterolog in Zellen exprimiert wird, die einfach zu handhaben sind und den experimentellen Zielen förderlich sind. Der zweite Schritt besteht darin, mit einer feuerpolierten Pipette eine stabile Abdichtung der Zellmembran zu erhalten.

Als nächstes sollte der Experimentator die Anzahl der im Patch vorhandenen Kanäle bestimmen, und wenn es sich um einen Einzelkanal-Datensatz handelt, besteht der letzte Schritt darin, die Daten zu verarbeiten und zu analysieren. Letztendlich wird die Aufzeichnung von Strom aus einzelnen Ionenkanälen verwendet, um die biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen, durch die diese Membranproteine wirken, was die Grundlage für die Kommunikation von neuronalen und anderen erregbaren Zellen bildet. Im Gegensatz zu Methoden, die es Ihnen ermöglichen, Ströme über mehrere aktive Ionenkanäle zu messen, besteht der Vorteil dieses Ansatzes darin, dass Sie durch die Messung von Strömen über einen einzelnen Ionenkanal eine Vielzahl von Reaktionsmustern visualisieren und trennen können, die einem bestimmten Kanal inhärent sind.

Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. physiologische und therapeutische Modulatoren, die die Kommunikation zwischen Neuronen beeinflussen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, rauscharme Aufnahmen zu erhalten, die nur einen einzigen Ionenkanal enthalten. Wenn Sie diese Methode zum ersten Mal ausprobieren, ist es wirklich nützlich zu sehen, wie jemand sie tut, denn um eine wirklich stabile Abdichtung zu erhalten, was das Wichtigste bei dieser Methode ist, müssen Sie sich der Zelle sanft in einem bestimmten Winkel nähern, und vor allem müssen Sie hartnäckig sein, um sich auf die Transfektion vorzubereiten.

HEK 2 93-Zellen werden einen Tag vorher in 35-Millimeter-Schalen plattiert, um sie in einem sterilen Röhrchen auf 50 bis 60 % Konfluenz zu bringen. Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor. Fügen Sie ein Mikrogramm von jedem CDNA von Interesse, 315 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und 350 Mikroliter von 42 Millimolaren Haufen hinzu.

Zum Schluss fügen Sie tropfenweise 35 Mikroliter Calciumchlorid hinzu, um den Niederschlag zu bilden. Wirbeln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang vor und geben Sie 175 Mikroliter Transfektionssuspension in jede der vier Schalen. Am Vortag angerichtet.

Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie es mit PBS. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu, ergänzt mit zwei Millimolaren Magnesiumchlorid, um eine durch den MDA-Rezeptor vermittelte Exzitotoxizität zu verhindern.

Ziehen Sie zunächst zwei symmetrische Aufzeichnungspipetten mit einem vertikalen Abzieher aus Boy-Silikatglas. Als nächstes ist eine Brandpolitur erforderlich, um den entsprechenden Durchmesser und Widerstand zu erhalten. Richten Sie als Nächstes die Aufzeichnung ein, indem Sie die QUB-Datenerfassungssoftware öffnen und das Erfassungsfenster auswählen.

Unter Layout. Öffnen Sie eine neue QUB-Datendatei, indem Sie auf Neue Daten klicken und die zu verwendenden experimentellen Parameter eingeben. Stellen Sie die Amplitudenskalierung auf 0,1 Volt pro Pico-Ampere ein, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Datendatei klicken, Eigenschaften auswählen und auf die Registerkarte Daten klicken.

Nachdem Sie das Medium durch zwei Milliliter PBS mit Kalzium und Magnesium ersetzt haben, montieren Sie die Zellschale auf den Mikroskoptisch. Konzentrieren Sie sich mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie auf das zelluläre Feld, um zu beurteilen, ob die Zellen gesund und gut an der Schale in Monolayer-Manier befestigt sind. Wechseln Sie zur Fluoreszenzdetektion, um zu überprüfen, ob die Transfektion erfolgreich war.

Stellen Sie als Nächstes die Parameter für die Einzelkanalaufnahme ein. Stellen Sie den Modus auf Spannungsklemme und die angelegte Spannung auf plus 100 Millivolt mit dem Befehl zum Halten der Spannung ein. Wählen Sie in der ausgeschalteten Position die Taste für den Dichtheitstest basierend auf der Fluoreszenz und dem Gesamterscheinungsbild aus.

Wählen Sie eine Zelle zum Patchen aus: Vergewissern Sie sich unter Phasenkontrast, dass die Zelle gut an der Schale befestigt ist, einen großen Teil der Zelloberfläche für das Patchen freigelegt hat und ansonsten gesund aussieht. Füllen Sie eine frisch polierte Pipette mit einer Lösung, die für NMDA-Rezeptoren und zellgebundene Experimente geeignet ist, und schnippen Sie vorsichtig, um alle Luftblasen zu entfernen. Befestigen Sie die Aufnahmepipette auf dem Verstärkerkopftisch und stellen Sie sicher, dass der Silberdraht in die Pipettenlösung eingetaucht ist, um zu verhindern, dass die Badlösung in die Pipette gelangt.

Verwenden Sie während des Annäherungsprozesses eine kleine Kunststoffspritze, die mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um vorsichtig Überdruck auszuüben. Verwenden Sie anschließend den Mikromanipulator, um die Pipette in das Bad zu leiten. Schließen Sie den Stromkreis und positionieren Sie ihn direkt über der für das Patchen ausgewählten Zelle.

Achten Sie beim Betreten des Bades auf das Oszilloskop. Der Pipettenwiderstand sollte im optimalen Bereich liegen, während die Position des Rohres visuell am Mikroskop und sein Widerstand elektrisch am Oszilloskop überwacht wird. Setzen Sie den Ansatz in kleinen Schritten fort, bis die Pipette sanft auf die Zelle auftrifft.

Das Testsignal nimmt leicht ab, um einen erhöhten Widerstand anzuzeigen. Um eine Versiegelung zu bilden, nehmen Sie die Spritze auf und üben Sie vorsichtig einen leichten Unterdruck durch den seitlichen Schlauch aus. Durch Ziehen am Kolben der Spritze wird die Dichtungsbildung durch eine vollständige Abflachung der Prüfsignalwellenform auf dem Oszilloskop angezeigt.

Am Verstärker. Schalten Sie den externen Befehl von Dichtheitstest auf Aus. Schalten Sie den Haltebefehl von off auf positiv und erhöhen Sie die Verstärkung von 10 x auf 100 x.

Beobachten Sie das Oszilloskop auf die Kanalaktivität, die, falls vorhanden, als quadratische Ablenkung nach unten von der zuvor flachen Basislinie angezeigt wird. Wenn die Kanalaktivität auf dem Oszilloskop angezeigt wird, beginnen Sie mit der Erfassung von Daten in die zuvor geöffnete digitale Datei in QUB, indem Sie die Wiedergabetaste und anschließend die Aufnahmetaste drücken. Um die Datenerfassung zu stoppen, drücken Sie die Stopp-Taste in QUB und speichern Sie die QDF-Datei Ein Signal, das nicht vollständig abgeflacht wird, oder eine verrauschte und instabile Basislinie kann auf eine schwache Versiegelung hinweisen.

Entfernen und entsorgen Sie in diesem Fall die Pipette und wiederholen Sie die weiteren Schritte mit einer frischen Pipette, bis eine ausreichende Abdichtung erreicht ist. Um den Datenanalyseprozess zu starten, öffnen Sie die aufgezeichnete Datendatei in QUB und überprüfen Sie den aktuellen Trace in der Pre-Schnittstelle. Unter Layout.

Entfernen Sie den digitalen Filter, um die aufgezeichnete Ablaufverfolgung in voller Bandbreite anzuzeigen, indem Sie das Kontrollkästchen fc deaktivieren. Scannen Sie die Ablaufverfolgung visuell, um Unregelmäßigkeiten und Artefakte zu erkennen Kurz. Stromspitzen können korrigiert werden, indem ein benachbarter sauberer Bereich der gleichen Leitfähigkeitsklasse hervorgehoben wird.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie zuerst Löschpuffer festlegen aus, um die Spitze zu vergrößern, bis einzelne Sample-Punkte sichtbar sind. Wählen Sie den zu ersetzenden Bereich aus, indem Sie nur diesen Bereich hervorheben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Löschen, um die Grundlinie für den gesamten Datensatz zu korrigieren.

Definieren Sie die Null-Strom-Baseline, indem Sie einen frühen Teil des Datensatzes auswählen, in dem die Baseline stabil ist. Markieren Sie einen Rechtsklick, und wählen Sie "Basislinie festlegen" aus. Wenn die Basisrichtlinie angezeigt wird, bestätigen Sie durch Sichtprüfung, dass sie den Basislinienpegel genau darstellt.

Identifizieren Sie Punkte im Datensatz, an denen die Rohdaten-Baseline sichtbar von der festgelegten Baseline abweicht. Korrigieren Sie dies, indem Sie einen kleinen Abschnitt der Basislinie innerhalb des abweichenden Bereichs auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie den Befehl Baselineknoten hinzufügen aus.

Wenn der Datensatz gelegentlich Perioden mit übermäßigem Rauschen oder Artefakten enthält, die nicht einfach korrigiert werden können, sollten diese Teile gelöscht werden, müssen aber zuerst in aufeinanderfolgende Segmente unterteilt werden. Markieren Sie unmittelbar vor dem Bereich, der verworfen werden soll. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Segment brechen.

Markieren Sie anschließend den zu verwerfenden Abschnitt, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie aus, löschen Sie und drücken Sie die Eingabetaste, um die Datensätze zu idealisieren. Wechseln Sie unter Layout zur MOD-Schnittstelle. Wählen Sie im Datenanzeigebereich einen kleinen Teil des Datensatzes aus, der sowohl geschlossene als auch offene Ereignisse enthält.

Bewegen Sie den Cursor in das Bedienfeld mit hoher Auflösung darunter, und markieren Sie innerhalb der ausgewählten Spur ein sauberes Segment, das für die Basislinie repräsentativ ist. Bewegen Sie den Cursor auf die Modellgruppe darunter, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das schwarze Quadrat, das den geschlossenen Zustand darstellt, und wählen Sie Greifen. Wiederholen Sie den Vorgang für Kanalöffnungen, indem Sie einen Teil der Merkmale hervorheben, der den offenen Leitwert darstellt.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das rote Quadrat in der Modellgruppe, und wählen Sie Greifen aus. Führen Sie die Idealisierung für den ausgewählten Teil des Datensatzes durch, indem Sie unter Datenquelle auf die Schaltfläche SEL klicken. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die idealisierte Registerkarte unter dem Modellierungsbereich im Popup-Fenster.

Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Parameter für die Analyse korrekt sind, und klicken Sie dann auf Ausführen. Das Ergebnis der Idealisierung zusammen mit dem Amplitudenhistogramm für den ausgewählten Abschnitt wird mit den Daten überlagert, um eine visuelle Inspektion der Idealisierung zu ermöglichen. Passen Sie bei Bedarf die Idealisierungsparameter an, um das beste Ergebnis zu erzielen, und wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie die Idealisierung für die gesamte Datei durchführen, indem Sie die Schaltfläche Datei unter Datenquelle auswählen.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die idealisierte Registerkarte und klicken Sie auf Ausführen. Es werden die Ergebnisse für die gesamte Datei angezeigt. Überlagern Sie die Daten und überprüfen Sie sorgfältig die Übereinstimmung zwischen der idealisierten Ablaufverfolgung und den aufgezeichneten Daten.

Gelegentlich werden Ereignisse fälschlicherweise identifiziert, die aus der idealisierten Ablaufverfolgung ausgeschlossen werden können. Wählen Sie das Ereignis false aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie IDL beitreten aus. Hier sind die Ströme nur von Kalziumionen durch einen einzelnen NMDA-Rezeptor in einer HEK 2 93-Zelle dargestellt.

Unter Verwendung der Cell Attached Patch Clamp-Technik erzeugt die Datenidealisierung Amplitudenhistogramme, die sich gut in zwei verschiedene Leitwertklassen in dieser Zelle einordnen lassen. Angeschlossene Aufzeichnung von HEK 2 93 Zellen, ein menosensitiver Kanal wird um minus 20 Millimeter aktiviert. Quecksilberdruck durch die Patch-Pipette bei konstantem Anlegen von Spannung.

Die rot gestrichelte Linie zeigt den Nullstrompegel an. Diese Aufzeichnungen von nativen Kanälen zeigen eine kontinuierliche NMDA-Rezeptoraktivität, die aus dem Soma eines Neurons aufgezeichnet wurde, das vom präfrontalen Kortex eines Rattenembryos dissoziiert und fünf oder 27 Tage lang in Kultur gehalten wurde. Einmal gemastert, kann dieser Vorgang je nach Dauer der Aufnahme in 30 Minuten bis zu einer Stunde durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie kinetische Analyse und Zustandsmodellierung durchgeführt werden, um den Gating-Mechanismus eines Kanals zu bestimmen und Reaktionsgeschwindigkeiten abzuschätzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein ziemlich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ströme durch ein Ionenkanalprotein aufzeichnen und mit der Analyse beginnen können.