Name: Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Lernen Sie die Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik zur Messung von Einzelkanalströmen in Ionenkanälen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Kanalkonformationen und liefert wertvolle Einblicke in ihre biophysikalischen Eigenschaften.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von F31NS086765 (KAC) unterstützt, F31NS076235 (MAP) und R01 NS052669 (GKP) und EIA9100012. Die Autoren danken Eileen Kasperek für Know-how und Unterstützung bei der molekularen Biologie und Gewebekultur; und Jason Myers für den Austausch von Daten aus frühen präfrontalen kortikalen Neuronen erhalten.

1. Zellkultur und Proteinexpression <ol><li> Aufrechterhaltung HEK293-Zellen (ATCC-Nummer CRL-1573) zwischen den Durchgängen 22 und 40, die Durchgänge durch die ATCC geführt, in Monolayer-Kultur in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) enthält und 1% Penicillin / Streptomycin-Gemisch bei 5% CO 2 und 37 ° C. Zwischen Experimenten Passage-Zellen in T25-Kolben 5-20 fachen Verdünnungen in einem Endvolumen von 10 ml gelöst. Hinweis: Die Verwendung dieser Zellen während der Passagen garantiert günstigen Zellgesundheit, die für eine optimale Abdichtung Bildung und Patch-Stabilität ermöglicht. </li><li> Zur Transfektion Platte HEK293-Zellen in 35 mm-Schalen in einer Dichte von ~ 10 5 Zellen / Schale, die ~ 0,5-0,6 ml Zellsuspension pro Schale entspricht und wachsen Zellen in 2 ml Medium für 18-24 Stunden. </li><li> In einem sterilen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, bereiten Sie die Transfektion Mischung für vier 35-mm-Schalen durch Zugabe von (in dieser Reihenfolge): (1) 1 ug jedes cDNA (GluN1, GluN2A und GFP); (2) 315 &amp;mgr; ldoppelt destilliertem Wasser (ddH2O); (3) 350 ul 42 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), und (4) 35 ul 2,5 M CaCl &amp;sub2; tropfenweise, die verwendet wird, um den Niederschlag zu bilden. </li><li> Wirbelrohr 5 Sekunden und füge 175 ul der Suspension der Transfektion in jeder der vier 35 mm-Schalen plattiert Tag vor, die Zellen enthalten nun bei 50-60% Konfluenz und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Absaugen der Transfektion Medium, waschen mit PBS und ersetzen mit 2 ml Wachstumsmedium mit 2 mM MgCl 2 ergänzt werden, um zu verhindern, NMDA-Rezeptor-vermittelten Exzitotoxizität 9. Hinweis: Für die elektrophysiologischen Ableitungen von 24-48 Stunden nach der Transfektion können die Zellen verwendet werden. </li></ol> 2. Elektrodenvorbereitung <ol><li> Erzeugen Sie zwei symmetrischen Aufnahme Pipetten durch Ziehen an Borosilikatglas Rohre mit einer vertikalen Magnet. Basierend auf der Größe und Geometrie des resultierenden Spitze, ferner Form Pipettenmit einer Poliermaschine. Hinweis: Die Spitze Größe optisch und elektrisch ausgewertet werden. Visuell sollte der Außendurchmesser im Bereich von 1,4 bis 5,6 &amp;mgr; m sein. Elektrisch, eine optimale Größe Spitze, wenn sie mit extrazellulären Lösung gefüllt ist, sollte Widerstände im Bereich von 12 bis 24 MOhm erzeugen (siehe Abbildung 2B). </li><li> Verwenden Sie eine Pipette Lösung, die für die Zell angebracht Experimente stellt die extrazelluläre Milieu, die maximale Kanalaktivität und hohe Stromamplituden produzieren wird. Anmerkung: Für NMDA-Rezeptoren, dies entspricht einer Lösung, die Sättigungskonzentrationen von Agonisten (Glutamat und Glycin), 1 mM EDTA, das zweiwertige kationische, Inhibitoren und Blocker chelatisiert und hat physiologische Konzentrationen von Natrium (150 mM) als einzige dringenden Ionen ( in mM: 1. Glutamat, Glycin 0,1, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA und 10 HEPBS, bei pH 8,0 mit 1 N NaOH gepuffert). </li></ol> 3. Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme <ol><li> Offene QuB Datenerfassung software (www.qub.buffalo.edu) und wählen Sie die Übernahme-Fenster unter &quot;Layout&quot;. Öffnen Sie eine neue QuB Datendatei (QDF), indem Sie auf &quot;Neue Daten&quot; unter dem Dropdown-Menü mit dem Titel &quot;Datei&quot; und geben Sie die folgenden Eingangsparameter: Abtastrate 40 kHz; A / D-Skalierung, 3000; Ausgangskanal 1; und A / D-Datengröße, 2. Stellen Sie die Amplitude Skalierung auf 0,1 V / pA mit der rechten Maustaste auf die Datei, Eigenschaften auswählen, und klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Daten&quot;. Hinweis: Diese Parameter können für jedes Setup mit einem Modell-Zelle in der Cell-Attached-Modus verfeinert werden. Zusätzliche Hinweisschilder auf die Datenerfassung mit Software und QuB QDF Eigenschaften sind online unter www.qub.buffalo.edu. </li><li> Wählen Sie eine 35 mm Schale mit Ionenkanal-exprimierenden Zellen und ersetzen Wachstumsmedium mit 2 ml PBS Calcium und Magnesium enthält; montieren Sie die Schüssel auf den Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf die Zellfeld mit Phasenkontrastmikroskopie zu bewerten, dass die Zellen gesund und gut in die Schale befestigtin Monolayer-Mode (Abbildung 1A). Schalter zur Fluoreszenzerfassung, um zu überprüfen, dass die erfolgreiche Transfektion (1B) war. Hinweis: Das Spektrum der Fluoreszenz-Intensitäten als grobes Maß für die Proteinexpression verwendet werden. </li><li> Für Einzelkanalaufnahme, stellen Sie den Verstärker-Ausgangsverstärkung auf x10-, Patch-Konfiguration, um β = 1, Analogfilter bis 10 kHz, Modus zu-Klemmspannung und der angelegten Spannung bis +100 mV. Mit dem Spannungshaltebefehl in die Position OFF, wählen Sie die &quot;Dichtheitsprüfung&quot;-Taste. </li><li> Basierend auf Fluoreszenz und Zellgesundheit, wählen Sie eine Zelle zu patchen. Verifizierung unter Phasenkontrast, dass die Zelle auch an der Schale befestigt ist, hat einen großen Teil der Zelloberfläche zum Patchen, belichtet und ansonsten gesund aussieht. Hinweis: Pflegen Phasenkontrastbeleuchtung zu vermeiden Bleichen der Zelle während des An-und Patch-Clamp. </li><li> Füllen Sie ein frisch poliert Pipette mit gerade genug Lösung so macht es Kontakt mit der electrode und leicht schütteln, um Luftblasen, die in der Spitze eingefangen werden können, zu entfernen. Sichern Sie die Aufnahme Pipette auf den Verstärker heads durch Anziehen der Verschlussschraube des Pipettenhalter und sicherzustellen, dass der Silberdraht in der Pipettenlösung eingetaucht. </li><li> Mit einem kleinen (5 cc) Kunststoffspritze, die dem Pipettenhalter mit Schlauch verbunden ist, sanft an Überdruck das Eindringen von Verunreinigungen und Verstopfungen der Spitze während der Annäherung (2A) zu verhindern. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, leiten Sie die Pipette in die Badewanne und positionieren Sie es direkt über der für das Patchen (1C) ausgewählte Zelle, Schließen des Stromkreises. Beachten Sie die Oszilloskop, das eine rechteckige Wellenform entsprechend des Verstärkers Dichtung Testsignal (2B) geben sollte. Hinweis: Bei der Einreise in das Bad, ist die Pipette Widerstand im optimalen Bereich von 12 bis 24 MOhm. Für ein 5 mV Testsignal, der gemessene Strom range entspricht ~ 20-40 pA. </li><li> Während der Überwachung Pipette Position visuell durch das Mikroskop und Pipette Widerstand elektrisch auf dem Oszilloskop, weiterhin den Ansatz, in kleinen Schritten, bis die Pipette trifft sanft auf die Zelle und das Testsignal sinkt leicht auf erhöhten Widerstand (2B) anzuzeigen. </li><li> Um eine Abdichtung zu bilden, nehmen Sie die Spritze und mit leichtem Unterdruck durch den seitlichen Schlauch durch Ziehen Sie den Spritzenkolben, die die Zellmembran in die Spitze der Pipette zieht Aufnahme und initiiert die Bildung einer Widerstands GOhm Dichtung 10. Beachten Sie die Testsignal-Wellenform auf dem Oszilloskop, in der Dichtung Bildung wird durch die vollständige Abflachung angegeben, nur mit kapazitiven Transienten sichtbar (Abbildung 2B). Hinweis: Wenn das Signal nicht vollständig glätten oder die Grundlinie wird laut, deutet dies auf eine schwache Dichtung mit erheblichen Leckstrom um die Dichtung. Dies wird verhindern, dass resolving ein Kanalströme. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie die Pipette aus der Zelle und aus dem Bad, entfernen Sie sie aus dem Kopf Bühne und entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem frisch poliert Pipette bis eine Dichtung im angemessenen Bereich (≥ 1 GOhm). </li><li> Auf der Verstärker, schalten Sie den externen Befehl Umschalten von &#39;Dichtheitsprüfung&#39; auf &#39;off&#39;; schalten Sie die Spannungshaltebefehl an positiv (die zuvor auf &#39;off&#39; eingestellt wurde); und erhöhen Sie die Verstärkung auf x100. Beobachten Sie das Oszilloskop für die Kanalaktivität, die, falls vorhanden, wird als quadratische Ausschläge nach oben aus dem zuvor flachen Basislinie (Abbildung 2C) angezeigt werden. </li><li> Wenn die Kanalaktivität wird auf dem Oszilloskop angezeigt werden, Daten zu erfassen, in der zuvor geöffneten digitale Datei in QuB, indem Sie die Taste &quot;Play&quot;-Taste gefolgt von der Taste &quot;Record&quot;. So stoppen Sie die Datenerfassung, drücken Sie die Stopp-Taste in QuB, und speichern Sie die Datei an eine QDF leicht RetrievLage Lage auf der Computer-Festplatte, indem Sie &quot;Daten speichern unter ...&quot; in der Drop-down-Menü mit dem Titel &#39;Datei&#39;. </li></ol> 4. Datenvorverarbeitung und Idealisierung Hinweis: Wichtige Informationen können zwischen Einzel-Kanal-Aufnahmen durch statistische Analysen, die jeden Datenpunkt auf eine geeignete Leitfähigkeit Klasse zuordnet (im einfachsten Fall geschlossen oder offen) extrahiert werden. Dieser Vorgang wird als Daten Idealisierung und eine kurze Beschreibung der Daten Idealisierung mit den Segment k Mittel (SKM) Verfahren 11 in QuB wird nachstehend beschrieben bezeichnet. <ol><li> Öffnen Sie die Datei in QuB, und zeigen Sie die aktuellen Spuren in der &#39;Pre&#39; Schnittstelle unter &quot;Layout&quot;. Zeigen Sie die aufgenommene Datei ungefiltert (Digitalfilter entfernen), indem Sie das Kontrollkästchen &quot;Fc&quot;. </li><li> Optisch scannen den Rekord um Unregelmäßigkeiten und Artefakten (4A) zu erkennen. Richtig kurzen Stromspitzen, die Berufsr in der Spur (4A), indem Sie einen angrenzenden sauberen Region des gleichen Leitwert Klasse, Hervorhebung dieser Region mit der rechten Maustaste und wählen &#39;gesetzt Löschpuffer. &quot; Vergrößern Sie die Spitze, bis einzelne Probenpunkte sichtbar sind, wählen Sie die Region ersetzt werden durch Hervorhebung und löschen nur die Region und dann mit der rechten Maustaste auf &quot;Löschen&quot;. </li><li> Definieren Sie die aktuelle Baseline Null für den gesamten Datensatz, indem Sie einen frühen Teil des Datensatzes, wo die Grundlinie ist stabil, markieren, rechte Maustaste und wählen Sie &quot;Grundlinie gesetzt. Stellen Sie sicher, dass die Richtlinie, die genau erscheint steht für die Basislinie (lila in 4B) </li><li> Identifizieren Sie in der Aufzeichnung, wo die Rohdaten Grundlinie aus der Menge Grundlinie abweicht sichtbar Punkten. Korrigieren Sie dies, indem Sie einen kleinen Ausschnitt aus Grundlinie in der Region abweichende rechten Maustaste und wählen Sie die &quot;fügen Sie eine Baseline-Knoten&quot;-Befehl. </li><li> Identifizieren Regionen ter Aufnahme mit überschüssigen Rauschen oder Artefakte, die nicht einfach korrigiert werden können (Abbildung 4C). Markieren Sie die Region verworfen werden, der rechten Maustaste und wählen Sie &quot;löschen. &#39; Hinweis: In diesem Fall kinetische Informationen verloren: die verarbeiteten Aufzeichnungs werden kürzer und die nach dem Verbindungspunkt auftretende Punkte erscheint kontinuierlich mit der Pre-Rauschbereich zu sein. </li><li> Um Datensätze zu idealisieren mit dem SKM-Algorithmus 11, markieren Sie einen Teil der Spur, die sowohl offene und geschlossene Veranstaltungen und geben Sie den &quot;Mod&quot;-Schnittstelle unter &#39;Layout &quot;. In der &quot;Modell&quot;-Panel, markieren Sie einen sauberen Teil der Spur, die Vertreter der Grundlinie in der gesamten Datei mit der rechten Maustaste auf das schwarze Quadrat (geschlossenen Zustand) und wählen Sie &quot;greifen&quot;. Machen Sie dasselbe für die Kanalöffnungen, indem Sie den offenen Leitfähigkeit der rechten Maustaste auf das rote Quadrat in der &quot;Modell&quot;-Panel und wählen Sie &quot;greifen&quot;. </li><li> Führen Sie die Idealisierungtion für den gesamten Datensatz, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;Datei&quot; unter &quot;Data Source&quot;. Rechts-Klick auf die Registerkarte &quot;Idealize&quot; unter dem Abschnitt &quot;Modellierung&quot;, um sicherzustellen, dass die gewünschten Parameter für die Analyse korrekt sind, und klicken Sie dann auf &quot;Ausführen&quot;. Das Ergebnis der Idealisierung, zusammen mit Amplitudenhistogramm für das gesamte Bild wird mit den Daten überlagert, um eine visuelle Inspektion der Idealisierung (Fig. 5) zu ermöglichen. Hinweis: Unzureichende Idealisierung kann auf die Erzeugung von &quot;falschen Ereignisse&quot;, in dem QuB erkennt Kanalöffnungen und Schließungen, die eigentlich nicht vorkommen führen. Innerhalb der Aufzeichnungsauflösung, die von der Endstufe Analogfilter und der Abtastrate eingestellt ist, kann die Auflösung, mit der SKM erkennt offene und geschlossene Veranstaltungen, die von einer Totzeit für die Analysen kontrolliert werden. Optimale Pausenzeiten muss durch Versuch und Irrtum ausgewählt werden und wird auf Sampling-Rate hängt jedoch ist eine gute Faustregelum eine tote Zeit, die Proben 2-3 12 auswählen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Idealisierung stellt genau die Rohdaten, manuell scannen die idealisierte Spur. Nach der Identifizierung von Fehlern in der Idealisierung, markieren Sie die Spur auf der falschen Veranstaltung der rechten Maustaste und wählen Sie &quot;Join Idl. &#39; Hinweis: Weitere Optionen und eine ausführliche Erläuterung der verschiedenen Befehle und Funktionen in QuB finden Sie in der Bedienungsanleitung QuB online (www.qub.buffalo.edu). </li></ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+electricity+and+the+birth+of+electrophysiology%3A+the+legacy+of+Luigi+Galvani%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani.</a> Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).</li>
<li>Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Science%3A+A+Century+of+Progress+and+the+Mysteries+that+Remain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain.</a> Neuron. 25, (2000).</li>
<li>Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+glutamate+receptor+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modes of glutamate receptor gating.</a> The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).</li>
<li>Morimoto-Tomita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinactivation+of+Neuronal+AMPA+Receptors+via+Glutamate-Regulated+TARP+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction.</a> Neuron. 61, 101-112 (2009).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+protein+expression+in+single+HEK+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing protein expression in single HEK 293 cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).</li>
<li>Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channel+properties+predict+vulnerability+to+cytotoxicity+in+a+transfected+nonneuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line.</a> Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).</li>
<li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).</li>
<li>Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+single-channel+currents+using+the+segmental+k-means+method+based+on+hidden+Markov+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling.</a> Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).</li>
<li>Colquhoun, D., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColquhoun%2C+D+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Colquhoun, D., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+properties+of+ion+channel+openings+and+bursts+in+a+membrane+patch+that+contains+two+channels%3A+evidence+concerning+the+number+of+channels+present+when+a+record+containing+only+single+openings+is+observed%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Amico-Ruvio, S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+gating+of+GluN1%2FGluN2B+receptors+in+intact+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches.</a> Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).</li>
<li>Borschel, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+reaction+mechanism+of+neuronal+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors.</a> J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).</li>
<li>Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quality+of+maximum+likelihood+estimates+of+ion+channel+rate+constants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants.</a> The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+mechanism+determines+NMDA+receptor+response+to+repetitive+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation.</a> Nature. 430, 790-793 (2004).</li>
<li>Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+Modes+in+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gating Modes in AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).</li>
<li>Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Single-Channel+Behavior+of+GluA3+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors.</a> Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).</li>
<li>Smith, T. C., Wang, L. -Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+Conductance+Levels+of+Native+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+and+Piezo2+Are+Essential+Components+of+Distinct+Mechanically+Activated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels.</a> Science. 330, 55-60 (2010).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo+proteins+are+pore-forming+subunits+of+mechanically+activated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels.</a> Nature. 483, 176-181 (2012).</li>
<li>Benndorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenndorf%2C+K+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
</ol>

Die Autoren dieses Manuskript erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In der Ionenkanal-Bereich wird ein wichtiger Bereich der Forschung zum Verständnis der Abfolge der Ereignisse, die zum Öffnen oder Gating-Mechanismus des Kanals Kanal führt gewidmet. Für die meisten Sender ist dieses Verfahren komplex und beinhaltet mehrere Bewegungsschritte, die nicht vom makroskopischen Mehrkanalsignal abgeleitet werden kann. Im Gegensatz dazu kann Experimenten beobachtet werden, wo die Reihenfolge der offene / geschlossene Veranstaltungen im Single Channel Datensatz kann detaillierte Informationen üb...

Schnelle Kommunikation durch biologische Membranen erfolgt fast ausschließlich im oligomeren porenbildende Membranproteine, die allgemein als Kanäle bezeichnet. Diese Proteine ​​unterscheiden sich stark in Aktivierungssignale, Gating-Mechanismen und Leitfähigkeit Eigenschaften. Kanal-Proteine, deren Poren selektiv Ionen als Ionenkanäle klassifiziert; ihre Aktivierung produziert Ionenströme durch die Membran, und ihre Antworten können mit hoher Auflösung in Echtzeit mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken aufgezeichnet werden. Die Aktivierungssignale umfassen eine breite Palette von chemischen und physikalischen Eingänge einschließlich Konzentrationsgradienten, mechanische und elektrische Kräfte und Temperatur; damit weiteren Klassifizieren Ionenkanäle in ligandenabhängigen, mechanosensitive, spannungsgesteuerten oder wärmeempfindliche Arten. In diesem Artikel werden Protokolle beschrieben, um Ein-Kanal-Aktivität aus einer ligandenabhängigen Kanal, den NMDA-Rezeptor und eine mechanosensitive Kanal, PIEZO1 aufzeichnen, mit der Patch-Clamp-Technik.0; Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist die erste und am meisten verwendete experimentelle Verfahren ausreichend empfindlich, um die Beobachtung von einzelnen Molekülen 1, 2 zu ermöglichen. Neben dieser ausgeprägte Empfindlichkeit hat es erheblich erweiterten die biologische Präparate zugänglich elektrophysiologischen Aufzeichnung und hat auch die Beobachtung von Ionenkanälen in intakten Membranen erlaubt. Erstens, weil beide Spannungsklemm und aktuelle Aufnahme mit der gleichen Elektrode erreicht, kann es verwendet werden, um Signale über kleine Zellen oder Membranen Flecken aufzuzeichnen. Die Technik ergab, dass Ionenkanäle sind nicht auf erregbare Membranen von Muskeln Frosch, Aal electroplaques, oder Tintenfisch Riesen Axone 3, 4, sondern vielmehr, dass sie vertreten allgegenwärtigen Lampen der Transmembran-Signalmechanismen und sind untrennbar mit aller zellulären Membrantypen von uni-oder eingeschränkt mehrzelligen Organismen und auch intrazelluläre Membranen. Importantly, die Fähigkeit zur Transmembranströme durch einfaches Anbringen einer Glaspipette zu einer intakten Zelle aufnehmen, sofern die beispiellose Gelegenheit, um die Aktivität von Ionenkanälen in ihrer Mutter ungestörten Membranen aufnehmen. Somit ist die Zelle angeschlossen Patch-Clamp-Technik, die in diesem Protokoll beschrieben wird, ermöglicht die Kontrolle der Aktivität von Ionenkanälen kontinuierlich für zehn Minuten oder länger in ihrer natürlichen Umgebung. Unter normalen Temperaturschwankungen, alle Proteine, einschließlich der Ionenkanal-Proteine ​​unterziehen strukturellen Veränderungen in einem breiten Zeitskala, mit den schnellsten und häufigsten Umlagerungen vertreten durch Seitenketten-Bewegungen und viel langsamer, weniger häufige Änderungen durch die Neupositionierung der gesamten dargestellten wahrscheinlich Domänen oder Untereinheiten oder in einigen Fällen durch posttranslationale Modifikationen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen 5, 6. Beobachten längere Tätigkeit, die ein Molekül erzeugt wird, kann helfen, die Funktion zu verstehenlen Dynamik der Ionenkanäle in intakten Membranen physiologischen und liefert wertvolle Informationen über den Betriebsmechanismus des betrachteten Molekül. Im Gegensatz zu dem wachsenden Verständnis für die Vielfalt von Ionenkanälen in Zelltypen und Entwicklungsstadien, Wissen über die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen in nativen Membranen noch immer begrenzt. Alle Ionenkanäle sind multimere Proteine ​​und die Mehrheit der nativen Ionenkanäle zusammen aus verschiedenen Arten von Untereinheiten Herstellung von Proteinen von breiten Molekular Vielfalt, die oft mit unterschiedlichen Leitfähigkeit und Gating Eigenschaften begleitet wird. Aus diesem Grund sind die Ionenkanäle von definierten molekularen Zusammensetzung nach Expression in heterologen Systemen untersucht. Insbesondere HEK293-Zellen, die eine klonale Linie von immortalisierten humanen embryonalen Nierenzellen 7, gewonnen Akzeptanz als bevorzugte System zur heterologen Expression von rekombinanten Ionenkanäle. Unter den Manny Vorteile, die HEK293-Zellen als die Wahl System für Ionenkanal-Elektrophysiologie erhöht sind die einfache und kostengünstige Kultivierung und Pflege langlebige stabile Kulturen, ihre Fähigkeit zur Durchführung von post-translationale Faltung, Verarbeitung und Handel von Säugetierproteinen, und in vielen Fällen , ihrer geringen oder sogar Fehlen von endogenen Ausdruck für die interessierenden Kanal 7, 8. Expression rekombinanter Ionenkanäle und das Studium ihrer funktionellen Eigenschaften in HEK293-Zellen nach wie vor ein wertvoller Ansatz, um Informationen über Struktur-Funktions-Eigenschaften von Ionenkanälen sowie die spezifischen Eigenschaften der Ionenkanal-Isoformen und ihre Rollen in nativem Gewebe zu erhalten. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können ebenso gut auf Ionenkanäle in rekombinanten HEK293 Zellen exprimiert und auf native Ionenkanäle verwendet werden. Zusammenfassend ist die Patch-Clamp-Technik, durch seine beispiellose Fähigkeit zur Signal lösens von einem Molekül bleibt bis heute die direkteste Methode zur Beobachtung des Verhaltens von Einzelmolekülen. In seiner Cell-Attached-Modus ermöglicht Patch-Clamp-Aufzeichnung lange Beobachtungszeiträume, die, wenn für ein Molekül erfolgen kann außergewöhnliche Einsicht in den Betrieb der Ionenkanäle bereitzustellen. Unten ist ein Protokoll für den Erhalt hoher Auflösung aktuelle Aufnahmen aus der Zelle befestigt Patches ein Ionenkanal-Protein enthält, vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien</td><td>Sigma</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate Glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Hellfeld-Inversmikroskop</td><td>Olympus</td><td>1x51</td><td>Nikon hat auch ähnliche Mikroskope</td></tr><tr><td>Fluroescent Box</td><td>X-cite</td><td>Series 120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Light Guide</td><td>X-cite</td><td>OEX-LG15</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS1001</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Tisch</td><td>TMC</td><td>63561</td><td></td></tr><tr><td>NIDAQ-Karte</td><td>National Instruments</td><td>776844-01</td><td></td></tr><tr><td>Abzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Polierer</td><td>Narishige</td><td>Microforge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>TMC</td><td>8133306</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Druckklemme</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA HSPC</td><td></td></tr><tr><td>Druck-/Vakuumpumpe</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA PV-PUMPE</td><td>für HSPC-1</td></tr></tbody></table>

ein-kanal-cell-attached-patch-clamp-aufnahme

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ionenkanal-Proteine ​​sind universelle Geräte für die schnelle Kommunikation durch biologische Membranen. Die zeitliche Signatur des Ionenflusses erzeugen sie hängt von intrinsischen Eigenschaften zu jedem Kanalprotein sowie den Mechanismus, mit dem sie erzeugt und gesteuert und stellt einen wichtigen Bereich der aktuellen Forschung. Informationen über die Betriebsdynamik der Ionenkanal-Proteine ​​können durch Beobachten langen Strecken von Strom, der von einem einzigen Molekül produziert, erhalten werden. Hier beschrieben ist ein Protokoll zum Erhalten eines Kanal Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahmen Strom für einen Liganden abhängigen Ionenkanals des NMDA-Rezeptor heterolog in HEK293-Zellen oder nativ in kortikalen Neuronen exprimiert. Es werden auch Anweisungen, wie man die Methode auf andere Ionenkanäle von Interesse durch die Vorlage am Beispiel der mechanisch-sensitive Kanal PIEZO1 anzupassen. Dieses Verfahren kann Daten liefern hinsichtlich Leitfähigkeit Eigenschaften und der zeitlichen Abfolge der OPE des Kanalsn-Konformationen geschlossen, aus denen Aktivierungsmechanismus des Kanals, um dadurch ihre Funktionen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen.

Rekombinante NMDA-Rezeptoren NMDA-Rezeptoren binden und auf die gleichzeitige Einwirkung von zwei mit-Agonisten: Glutamat und Glycin. Sie montieren wie Heterotetramere von zwei Glycin-Bindungs ​​GluN1 Untereinheiten und zwei Glutamat-Bindungs ​​GluN2 Untereinheiten. GluN2 Untereinheiten sind durch vier Gene (AD) und von diesen codiert die am häufigsten transkribiert Formen in Gehirn sind GluN2A bei Erwachsenen und GluN2B an Jungtieren. Aufgrund der Vielfalt von NMDA-Rezeptor...

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den elektrischen Strom durch einen einzelnen Ionenkanal zu messen. Dies wird erreicht, indem der gewünschte Ionenkanal zunächst heterolog in Zellen exprimiert wird, die leicht zu handhaben sind und für die experimentellen Ziele geeignet sind. Der zweite Schritt besteht darin, mit einer feuerpolierten Pipette eine stabile Dichtung auf der Zellmembran zu erzeugen.Als Nächstes sollte der Experimentator die Anzahl der in dem Patch vorhandenen Kanäle bestimmen; falls es sich um eine Einzelkanalaufzeichnung handelt, ist der letzte Schritt die Verarbeitung und Analyse der Daten. Letztlich dient die Stromaufzeichnung aus einzelnen Ionenkanälen der Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften, über die diese Membranproteine wirken, und bildet die Grundlage dafür, wie neuronale und andere erregbare Zellen kommunizieren. Im Gegensatz zu Methoden, die die Messung von Strömen durch mehrere aktive Ionenkanäle ermöglichen, liegt der Vorteil dieses Ansatzes darin, dass die Messung von Strömen durch einen einzelnen Ionenkanal es erlaubt, ein breites Spektrum an Reaktionsmustern, die einem bestimmten Kanal eigen sind, sichtbar zu machen und vo

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Wir bieten Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für whole-cell Patch-Clamp-Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in peripheren mononukleären Zellen gewonnenen humanen T-Lymphozyten.

Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnungen in Substantia gelatinosa (SG)-Neuronen von Rückenmarksschnitten, wobei Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken verwendet werden, um die Feuermuster von Neuronen zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf Reize in SG-Neuronen des Rückenmarks.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in einem Substantia gelatinosa-Neuron eines Rückenmarksschnitts

Dieses Video zeigt die Untersuchung der Erregbarkeit sensorischer Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, um die Rheobase und das Membranpotential zu messen und die Reaktionen der Neuronen auf inkrementelle Strominjektionen zu analysieren.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an intakten Spinalwurzelganglien der Ratte

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Dieses Manuskript beschreibt, wie man intakte dorsale Wurzelganglien für Patch-Clamp-Aufnahmen vorbereitet. Dieses Präparat erhält die Mikroumgebung für Neuronen und Satelliten-Gliazellen aufrecht und vermeidet so die phänotypischen und funktionellen Veränderungen, die bei dissoziierten DRG-Neuronen beobachtet werden.

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Dieser Artikel beschreibt, wie die Ionenselektivität von Channelrhodopsin mit elektrophysiologischen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen unter Verwendung von HEK293-Zellen bestimmt wird. Hier wird das experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Chloridselektivität eines anionenselektiven Channelrhodopsins demonstriert. Das Verfahren ist jedoch auf andere Channelrhodopsine mit ausgeprägter Selektivität übertragbar.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

Lernen Sie die Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik zur Messung von Einzelkanalströmen in Ionenkanälen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Kanalkonformationen und liefert wertvolle Einblicke in ihre biophysikalischen Eigenschaften.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Weitere Videos entdecken