Name: Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren über Luciferaseaktivität in H three A Zellen. Diese Technik ermöglicht die quantitative Messung von Rezeptoraktivierung durch verschiedene Geruchsstoffe.

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Diese Arbeit wurde von DC013339 R01, R03 DC011373 und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014 unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde mit dem Monell Chemosensorische Receptor Signaling Core unterstützt wird, die zum Teil durch Mittel aus dem NIH-NIDCD Kern Zuschuss P30 DC011735. Die Autoren danken C. Sezille für die Hilfe bei der Datenerhebung.

1. Hana3A Kultur der Zellen <ol><li> Vorbereitung M10 Medium durch Hinzu Minimum Essential Medium (MEM) mit 10% (v / v) FBS. </li><li> Kultur Wartung <ol><li> Pflegen Zellen in M10-Medien. HINWEIS: Die Expressionsvektoren für RTP1L, RTP2, REEP1 und G αolf verleihen Puromycinresistenz zu Hana3A Zellen, aber die Aufrechterhaltung der Zellen mit diesem Antibiotikum nicht wesentlich beeinflusst Testergebnisse. </li><li> Subkultur in einem Verhältnis von 1:8 in 10 cm Schalen alle 2-3 Tage. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Plating Zellen für Transfektion <ol><li> Saugen Sie Medien aus einer 100% konfluente 10 cm Schüssel mit Hana3A Zellen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml PBS, wirbeln die Schüssel und Absaugen des PBS. </li><li> 3 ml 0,05% Trypsin / EDTA und warten Zellen zu dissoziieren (ca. 1 min). </li><li> Trypsin inaktivieren durch Zugabe von 5 ml M10 und brechen Zellklumpen durch Verreiben etwa 10x &amp;# 160, mit einer 10 ml Pipette. Pipette vorsichtig, damit die Einführung von Luftblasen in den Medien. </li><li> Für jede Platte mit 96 Vertiefungen, 1 ml der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 200 × g für 5 Minuten und Aspiration des Überstands ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 6 ml M10 pro 1 ml Zellen in Schritt 2.5 überführt. </li><li> Je 50 ul der Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen beimpft und über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 3. Transfektion von Geruchsrezeptoren <ol><li> Herstellung von Plasmid-DNA <ol><li> Bereiten Plasmid-DNA über eine Endotoxin-freies Protokoll. HINWEIS: Verwenden Sie Plasmid-DNA-Präparation Kits als &quot;Endotoxin-frei&quot;, oder fügen Sie eine Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt an das Plasmid-DNA-Präparation Protokoll. </li><li> Verdünnte DNA auf eine Konzentration von 100 ng / ul in TE-Puffer. </li></ol></li><li> Beachten plattierten Zellen (Schritt 2.7), um eine ordnungsgemäße Konfluenz von Nähe gewährleistenTely 30-50% pro Vertiefung und zum Inkubator. ANMERKUNG: Dies Konfluenz nicht optimal für die Lipid-Transfektionsreagenz, eine Konfluenz von 30-50% in diesem Schritt für die Messung optimale Luciferase-Aktivität 24 Stunden nach der Transfektion. </li><li> Vorbereitung der Transfektion Mix <ol><li> Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL Plasmide in MEM-Medium pro den in Tabelle 1 aufgeführt, um die Plasmid-Mix machen Volumen (Volumen sind pro 96-Well-Platte). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Plasmid-Mix </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> pro Well </td><td> pro 96-Well-Platte </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 ul </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-pCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Plasmid-Mix-Komponenten. Per gut und pro 96-Well-Platte Mengen RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL und MEM. </li><li> Für jede 96-Well-Platte, verdünnte 18 ul Lipid-Transfektionsreagenz in 450 ul MEM-Medium. </li><li> Pipette Plasmid-Mix (aus Schritt 3.3.1), Rhodopsin-markierten Geruchsrezeptor in den PCI-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid Transfektionsmischung (aus Schritt 3.3.2) die Komplexe in detaillierte, um <sTrong&gt; Tabelle 2. Mischen Sie die Lösung durch Verreiben und bei Raumtemperatur für 15 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von M10 nach Tabelle 2. HINWEIS: Diese Reaktion ist zeitempfindlich und sollte nicht erlaubt werden, für mehr als 30 Minuten fortsetzen. Die gut + 10% Berechnung ist wichtig, eine ausreichende Lautstärke für nachfolgende Schritte zu gewährleisten. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Komplex </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> pro Well </td><td> pro Well + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Plasmid-Mix </td><td> 4.2 ul </td><td> 4,58 ul </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OR-pCI </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Lipid Transfektionsmischung </td><td> 4.2 ul </td><td> 4,58 ul </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 ul </td><td> 45.83 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Komplexe Bauteile. Per gut und pro Well + 10% Volumen von Plasmid-Mix (Tabelle 1), Geruchs-Rezeptor-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid-Transfektion Mix. M10 wird zugegeben, um die Reaktion nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur abzuschrecken. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten. </li><li> Je 50 ul komplexer in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 4. Geruchsstimulation <ol><li> Beachten Sie die transfizierten Zellen, um eine ordnungsgemäße Konfluenz von 50-80% pro Vertiefung zu gewährleisten und zum Inkubator. HINWEIS: Wenn Zellen sind weniger als 50% Konfluent, Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase-Messungen können zur Messung der Rezeptoraktivierung zu niedrig sein. Betrachten Sie das Verwerfen der Platte. </li><li> Bereiten 1 M Stammlösungen der einzelnen Geruch in DMSO. </li><li> Bereiten Duftstimulation Lösungen in CD293 Medium. <ol><li> Für Screening-Experimenten, verdünnte Stammlösung von Geruch bis 100 um. Auch (nur CD293), um sich für oder Hintergrund Aktivierung steuern bereiten eine no-Geruchskontrolle. HINWEIS: Für die Screening-Experimenten, die jeweils OR / Geruch Paar wird nur einmal pro Experiment getestet. Da einige Geruch Diffusion über Brunnen möglich ist, empfiehlt es sich, mit einem Geruchsstoff für jede Platte zu stimulieren. </li><li> Für Dosis-Wirkungs-Experimente, bereiten sieben 10-fach serielle Verdünnungen der Geruch Stammlösung in dreifacher Ausfertigung ab 1 mM für jeden Rezeptor. Auch bereiten die gleichen Geruch Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung für Leervektor-transfizierten Zellen, um für die Geruchs Hintergrund Aktivierung steuern. HINWEIS: Für die Dosis-Wirkungs-Experimenten, die jeweils odor Konzentration Behandlung sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten. </li><li> Je 25 ul der Geruchsstimulationslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 4 Stunden. </li></ol> 5. Messen oder Aktivität über Luciferase Assay <ol><li> Resuspendieren Glühwürmchen-Luciferase Substrat pro Anweisungen des Herstellers und bei -80 ° C </li><li> Tauwetter 1 ml Luciferase Substrat pro 96-Well-Platte. </li><li> Bereiten Sie frischen Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion Quencher und Renilla Luciferase-Substrat-Reagenz (5 ul Luciferase Löscher / Renilla Luciferase Substrat pro 1 ml Puffer). Anmerkung: Etwa 1 ml Reagenz pro Platte mit 96 Vertiefungen benötigt. </li><li> Bereiten Sie die lumineszierenden Mikroplatten-Reader. Öffnen Sie den Mikroplatten-Reader-Software. Innerhalb des Systems Symbol: <ol><li> Unter der &quot;Pre-Heizung&quot; Tab, markieren Sie das Kästchen für &quot;ON&quot; und stellen Sie die Temperatur der Maschine bis 25 °, C. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Spender&quot;, Prime jeder Spender mit 1000 ul von 70% Ethanol, gefolgt von 1.000 ul destilliertem Wasser. HINWEIS: Verwenden Sie separate Teilmengen von Alkohol und Wasser für jeden Spender. Ethanol wird verwendet, um die Spender zu desinfizieren und Wasser entfernt das restliche Ethanol. </li><li> Prime jeder Spender mit 1500 ul von Luft (Entfernen von Flüssigkeit Spender). HINWEIS: Grundierung mit Luft sorgt dafür, dass Luciferase-Substrate nicht mit Restwasser verdünnt. </li><li> Prime Spender 1 mit 1080 ul von Firefly Luziferase-Substrat (aus Schritt 5.2). Prime Spender 2 mit Renilla-Luciferase-Substrat (aus Schritt 5.3). HINWEIS: Achten Sie darauf, Quer verunreinigen die Luciferase-Substraten. Grundierung mit Luciferase-Substrate füllt den toten Raum in den Reagenz-Spender. </li></ol></li><li> Das folgende Protokoll eingestellt, um sowohl Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase Lumineszenz lesen. Innerhalb der mit dem Mikroplatten-Reader, un zugehörige SoftwareDer das Menü &quot;Datei&quot;, klicken Sie auf &quot;Neue Aufgabe&quot;. Markieren Sie &quot;Protokolle&quot; und klicken Sie auf &quot;Create New&quot;. Im nächsten Fenster, sollte der Kreis neben &quot;Standard Protocol&quot; ausgewählt werden. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Klicken Sie doppelt auf &quot;Vorgehensweise&quot; auf der linken Seite des Bildschirms. <ol><li> Dispense 10 ul von Firefly Luziferase-Substrat in alle Vertiefungen mit Spender 1. Unter dem Menü &quot;Aktionen&quot; auf &quot;Dispense&quot;. Im Fenster &quot;Dispense Step&quot;, ein: &quot;Spender&quot;, um ein &quot;Priming&quot;, um keine &quot;Dispense Volume&quot; auf 10 ul und &quot;Rate&quot; zu 225 ul / Sek. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. Unter dem Menü &quot;Aktionen&quot; auf &quot;Shake&quot;. Im Fenster &quot;Shake-Step&quot;, stellen Sie &quot;Intensity&quot; auf Mittel-und &quot;Dauer&quot;, um 00.30 Uhr MM: SS. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Lesen Sie die Lumineszenz von allen Wells für 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Unter dem Menüpunkt &quot;Aktionen&quot;, klicken Sie auf &quot;Lesen&quot;;. Im Fenster &quot;Lesen Step&quot;, ein: &quot;Erkennungsmethode&quot;, um Lumineszenz &quot;Lesen Type&quot; Endpoint &quot;Integrationszeit&quot; bis 00.00.50 MM: SS: ss &quot;Filter Sets&quot; auf 1 &quot;Emission&quot; Hole, &quot;Optik-Position&quot; zwischen oben, &quot;Gain&quot; auf 135, und &quot;Read Höhe&quot; zu 1,00 mm. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Dispense 10 ul Renilla Luciferase Substrat in alle Vertiefungen mit 2 Spender. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.1, außer set &quot;Spender&quot; bis 2. </li><li> Schütteln Sie Platte für 30 Sekunden. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.2. </li><li> Lesen Lumineszenz von allen Wells 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.3. </li></ol></li><li> Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in der Mikroplatten-Reader. Starten Sie das Programm in Schritt 5.5 festgelegt, um die Platte Lumineszenz lesen. </li><li> Reinigen Sie die Reagenzspender Pumpen. Von der System-Symbol unter der Registerkarte &quot;Spender&quot;: <ol><li> Purge 1000 ul firefly Luciferase Substrat aus der Firefly Luziferase Spender in eine Sammelröhre. HINWEIS: Firefly Luziferase kann bei -80 ° C gelagert und wiederverwendet werden. </li><li> Prime jedes Spenders mit 1000 &amp;mgr; l destilliertes Wasser und anschließend mit 1000 &amp;mgr; l 70% Ethanol, und schließlich 1,500 ul Luft (Entfernen von Flüssigkeitsabgabevorrichtungen). HINWEIS: Wasser entfernt Luciferase-Substrate aus der Reagenzienpumpen, Ethanol desinfiziert und Luft trocknet restliche Ethanol. </li></ol></li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Data Export <ol><li> In der Mikroplatten-Reader-Software, klicken Sie doppelt auf &quot;Report / Export Builders&quot; auf der linken Seite des Bildschirms. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Neue Export to Excel&quot; und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Markieren Export1 und klicken Sie auf &quot;Bearbeiten&quot;. <ol><li> Unter &quot;Inhalt&quot; check &quot;Systembeschreibung&quot;, &quot;Verfahren&quot;, &quot;Platten-Beschreibung&quot; und &quot;Plate Layout-Matrix&quot;. Include &quot;Rohdaten&quot; einnd &quot;Berechnete Daten&quot;. </li><li> Unter &quot;Workflow&quot;, aktivieren Sie &quot;Automatisch ausführen nach Abschluss des Verfahrens&quot;. Unter Exportmodus, aktivieren Sie &quot;Alle Platten in der gleichen Arbeitsmappe&quot; und &quot;Wie ein neues Arbeitsblatt&quot;. </li><li> Unter &quot;Datei&quot; wählen Sie den Dateinamen Format und Speicherort der Datei, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Schließen Sie das Fenster &quot;Report / Export Builders&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Um normalisierte Luciferase-Werte zu erhalten, teilen Sie die Glühwürmchen-Luciferase Lumineszenz Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.3) durch die Renilla-Lumineszenz-Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.6). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Riechstoffidentität wird von Geruchsrezeptoraktivierungsmuster codiert, sondern Rezeptoraktivierungsmuster, einschließlich der Rezeptoren aktiviert werden und zu welchem ​​Grad, für weniger als 6% der menschlichen Geruchsrezeptoren 1-11 bekannt. Anstrengungen zur Geruchsrezeptoren charakterisiert durch ihre arbeitsintensive Verfahren und Anwendbarkeit auf nur eine Teilmenge des olfaktorischen Rezeptorfamilie 17,23,24,33,34 beschränkt. Die Hana3A heterologe Expressionssystem unterstützt die robuste ...

Die Säugetierriechsystem hat die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Geruchsreize zu reagieren, so dass für den Nachweis und die Unterscheidung von Tausenden von Geruchsstoffen. Olfaktorischen Rezeptoren (OR) sind die molekularen Sensoren von den Riechzellen im Riechepithel 12 ausgedrückt. Säugetiergeruchserkennung erfolgt durch unterschiedliche Aktivierung von OR durch Geruchsstoffe, und die ODER-Gen-Familie ist umfangreich, mit rund 1.000 murinen und menschlichen Rezeptoren 400 12-16. Zurück funktionelle Analysen von OR in olfaktorischen Neuronen und in heterologen Zellen haben gezeigt, dass unterschiedliche Geruchsstoffe werden durch eindeutige erkannt, aber überlappenden Ensembles von OR 10,17-20. Passende Liganden an OPs ist entscheidend für das Verständnis der olfaktorischen Code und wesentlich für den Aufbau lebensfähige Modelle des Geruchssinns. Aufgrund von Schwierigkeiten exprimieren ORs in heterologen Systemen sowie die große Zahl der beiden Duftstoffe und ORs hat diese Daten von der f weitgehend gefehltield; ja, weniger als 6% der menschlichen OPs haben einen Liganden 1-11 veröffentlicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Luciferase-Assays zur Geruchs / oder Wechselwirkungen charakterisieren. Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Charakterisierung von OPs, eine Aufgabe, die für das Verständnis Geruchs / ODER Wechselwirkungen sowie die Entwicklung eines Modells der Duftkodierung ist. Hochdurchsatz-Untersuchungen der OPs stehen vor drei großen Herausforderungen. Zunächst wurden ORs in heterologen Zellen exprimiert im ER zurückgehalten und anschließend in das Proteasom abgebaut 21,22, verhindert die RUP Interaktion mit Geruchsstoffen in dem Testsystem 23-25. Dieses Problem wurde durch die Entdeckung der Hilfsproteine, die stabile Zelloberflächenexpression von einer breiten Palette von OR 19,26,27 erleichtern gerichtet. Rezeptor-Transporter-Proteine ​​1 und 2 (RTP1 und 2) fördern oder Zelloberflächenexpression und Aktivierung in Reaktion auf Geruchsstimulation 19. Basierend auf dieser Arbeit wurden HEK293T-Zellenmodifiziert, um stabil exprimieren RTP1 lang (RTP1L) und RTP2, Rezeptor Expression verstärkenden Protein 1 und G αolf, was in der Hana3A Zellinie 19,27. Darüber hinaus ist die Art 3 muskarinischen Acetylcholinrezeptors (M3-R) wirkt mit ORs an der Zelloberfläche und fördert die Aktivierung in Reaktion auf Riechstoffe 26. Co-Transfektion eines OR mit RTP1S und M3-R in Hana3A Zellen führt die robuste, konsistente und funktionelle Expression von einer breiten Palette von OPs an der Zelloberfläche 27. Zweitens Säugetier ODER Repertoires sind recht groß. Bei Menschen, zum Beispiel, ist die OR-Repertoire um eine Größenordnung zahlreicher als die Geschmacksrezeptorrepertoire und 2 Größenordnungen zahlreicher als die visuellen Rezeptor Repertoire. Obwohl das Klonen einer einzigen OR ist eine relativ einfache Protokoll wird bedeutende Vorleistungen Aufwand erforderlich, um eine umfassende Bibliothek zu erzeugen. Drittens, obwohl wir wissen, dass in der Sicht, übersetzt Wellenlänge in Farbe undVorsingen in Frequenz übersetzt in Tonhöhe, die Organisation von Gerüchen schlecht verstanden, dass es schwierig für Forscher aus einer repräsentativen Stichprobe von Geruchsstoffen zu interpolieren. Obwohl einige Fortschritte an dieser Front 10,28 erzielt wurden, bleibt die Karte des olfaktorischen Landschaft unvollständig. Screening Zehntausende von Molekülen gegen Hunderte von OPs ist eine gewaltige Aufgabe; Hochdurchsatz-Bildschirme in diesem Bereich erfordern sorgfältig definierten Kampagnen. Die wichtigsten sind die verbleibenden Herausforderungen der Logistik und Kosten und nicht als Probleme, die auf die Technik. Obwohl heterologen Screening wurde nicht häufig verwendet, um Liganden von akademischen Gruppen zu identifizieren, hat ein privates Unternehmen die gleiche Technik verwendet, um Liganden für 100 menschlichen OR 29 zu identifizieren. Leider bleiben diese Daten geschützt. Die Hochdurchsatz-Luciferase-Assay skizzierten hat mehrere Vorteile gegenüber verwendet werden, um zu beurteilen oder Aktivierung alternativer Methoden. Obwohl die Verantwortungses von nativen Riechzellen gemessen worden mit Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging, haben diese Techniken Schwierigkeiten auseinander, die Hänseleien ODER Antwort eines Neurons aufgrund der Überlappung in Reaktion Eigenschaften für olfaktorischen Neuronen führt. Obwohl Klopfen in einem GFP-markierten Rezeptor Typ 30,31 und liefert spezifische Rezeptoren über Adenovirus olfaktorischen Neuronen murinen 32,33 oder die Durchführung der RT-PCR nach Aufnahmen 17,24,33 können Aufnahmen zu einzelnen Rezeptortypen zu verknüpfen, sind diese Methoden Niedrigdurchsatz und nicht für große Bildschirme geeignet. Heterologe Screening-Systeme sind skalierbar und zwei Hauptformen sind in der Literatur gefunden: cAMP-Weg Reportern und Inositol-Triphosphat (IP3)-Weg Reportern. Bei Geruchsstimulation, OPs aktivieren einen G αolf Übertragungssignalkaskade, die in der Produktion von zyklischem AMP (cAMP) 12 führt. Durch Co-Transfektion einer Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des NetzAMP-Response-Element (CRE), kann Luciferase-Produktion als Funktion der Geruchsreaktion gemessen werden, so dass für die Quantifizierung oder Aktivierung. Oder Aktivierung kann auch auf die IP3 Weges durch Coexpression G-Proteine, wie G α15/16 oder G α15-OLF-Chimäre 24,25,34 verbunden werden. Wir haben den Test hier dargestellt anhand von drei Faktoren ausgewählt: (1) die Co-Expression von RTP1 mit Rho-markierten Geruchsrezeptoren verbessert die Expression der olfaktorischen Rezeptoren an der Zelloberfläche 19,27; (2) Verwendung eines cAMP-responsive Reporter-Gen ermöglicht die Messung von OR-Aktivierung durch die kanonischen zweiten Messenger-Pfad; und (3) der Test ist gut geeignet, um Hochdurchsatz-Screens. Dieser hohe Durchsatz Luciferase Assay auf eine Vielzahl von Studien wertvoll Bereich des Geruchssinns. Erstens kann eine große Anzahl von OR gegen einen einzelnen Geruchsstoff um die Rezeptoraktivierung Muster für ein sp bestimmen gescreent werdenecific Riechstoff. Diese Art der Studie identifizierten OR7D4 als OR für die Reaktion auf die Steroid-Geruchsstoff Androstenon 8 verantwortlich. Umgekehrt können eine oder können gegen eine Reihe von Geruchsstoffen, um die Rezeptorantwort Profil 10 zu bestimmen, untersucht werden. Wenn Kandidaten olfaktorische Geruchs / oder Paaren über diesen Fenstern identifiziert, kann die Interaktion durch die Durchführung einer Dosis-Wirkungs-Experiment der Prüfung der Antwort des ODER steigenden Konzentrationen von Geruchs bestätigt werden. Dosis-Wirkungs-Kurven können auch beurteilen, wie genetische Variation in einem oder in vitro Geruchs Antwort 8,9,11,35 beeinflusst, und diese Untersuchungen kann zu inter ODER Variante erweitert werden, so dass für die Prüfung der Rezeptor Evolution über Arten und kausale Mutationen in der Evolution 36,37 schließlich Dieser Assay kann verwendet werden, um Geruchs Antagonisten, die in der Lage, zu antagonisieren oder die Reaktion auf einen bestimmten Duftstoff für eine bekannte Geruchs / Rezeptor-Paar 38,39 sind zu screenen. Zusammenfassend, diese hohenDurch Luciferase-Assay ist für eine Reihe von Studien, die helfen, zu charakterisieren oder Aktivierungsmuster und ein besseres Verständnis der Duftkodierung im olfaktorischen System.

<table><tbody><tr><td>Hana3A-Zellen</td> Auf Anfrage <td></td><td></td>im <td>Matsunami-Labor erhältlich</td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td> Auf <td>Anfrage</td><td></td><td></td>im Matsunami-Labor</tr><tr><td>erhältlich M3-R-pCI</td> Auf <td>Anfrage</td><td></td><td></td>im Matsunami-Labor</tr> erhältlich <tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231<</td><td>a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><ein href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (ohne Ca2+ und Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsin (0,05% Trypsin EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><ein href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=Suchprodukt">Trypsin</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-Well-PDL weiße/klare Platte</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">Platten</a></td></tr><tr><td>Reagenz zur Lipidtransfektion: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>Firefly Luciferase Substrat, Firefly Luciferase Quencher/Renilla Luciferase Substrat: Dual-Glo Assay</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader-Software: Gen5 Datenanalyse-Software</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433<</td><td>a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414<</td><td>a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a</td></tr><tr><td>>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433<</td><td>a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ Spitzen</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403<</td><td>a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ Spitzen</a</td></tr><tr><td>>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE</td><td>Puffer Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010<</td><td>a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FÜR</a></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-analyse von säugetiergeruchsrezeptoren: die messung der rezeptoraktivierung über luciferaseaktivität

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Geruchsstoffe schaffen einzigartige und überlappenden Mustern von olfaktorischen Rezeptoraktivierung, so dass eine Familie von rund 1.000 Mäuse-und 400 menschliche Rezeptoren, um Tausende von Geruchsstoffen zu erkennen. Riechstoffliganden für weniger als 6% der menschlichen Rezeptoren 1-11 erschienen. Dieser Mangel an Daten zum Teil auf Schwierigkeiten funktionell exprimieren diese Rezeptoren in heterologen Systemen. Hier beschreiben wir eine Methode für die Mehrheit der olfaktorischen Rezeptorfamilie in Hana3A Zellen, gefolgt von Hochdurchsatz-Beurteilung der olfaktorischen Rezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assay zum Ausdruck. Dieser Test kann (1) Bildschirm-Panels von Geruchsstoffen gegen Platten von olfaktorischen Rezeptoren verwendet werden; (2) bestätigen Geruchs / Rezeptor-Interaktion über Dosis-Wirkungs-Kurven; und (3) Vergleich der Rezeptoraktivierung Niveaus unter Rezeptorvarianten. In unserem Beispieldaten wurden 328 Geruchsrezeptoren gegen 26 Geruchsstoffe untersucht. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit unterschiedlichen Antwort-Werte waren AuswahlTed und in Dosis-Wirkungs-getestet. Diese Daten zeigen, dass ein Bildschirm ist eine wirksame Methode, um Geruchs / Rezeptor-Paare, die eine Dosis-Wirkungs-Experiment passieren wird, dh Rezeptoren, die einen echten Reaktion auf einen Duftstoff haben zu bereichern. Daher ist dieses Hochdurch Luciferase-Assay eine effektive Methode zur Geruchsrezeptoren, einen wesentlichen Schritt in Richtung eines Modells der Duftkodierung im Säugetierriechsystem charakterisieren.

Eine primäre Bildschirm getestet OR 328 gegen 26 Gerüche in einer Konzentration von 100 uM. Diese Geruchskonzentration wurde gezeigt, dass ein großer Teil der ORs mit bekannten Liganden 10 effektiv aktivieren. Zunächst wurde normalisierte Luciferase-Aktivität durch Division der Glühwürmchen-Luciferase Lesung des Renilla-Luciferase Lesen berechnet. Als nächstes wurden als Baseline-Werte durch Subtrahieren der normalisierten Messwerte für die Luciferase keine Geruchskontrolle aus den normalisierten Luc...

Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.

Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine Hochdurchsatzmessung der Geruchsrezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luziferase-Assays durchzuführen. Dies wird erreicht, indem H-3-A-Zellen mit Vektoren durchtrennt werden, die akzessorische Proteine, Glühwürmchen- und Vanille-Luciferase und Geruchsrezeptoren enthalten, um einen anderen Geruchsrezeptor zu exprimieren. In jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte.In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit Düften stimuliert. Als nächstes wird ein Luziferase-Substrat hinzugefügt, das die Zellen, die das Luciferase-Enzym produzieren, zum Lumineszieren bringt und somit als Reporter für die Aktivierung des Geruchsrezeptors fungiert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Reaktionen der Population der Geruchsrezeptoren auf die Gerüche basierend auf der Lumineszenz jeder Vertiefung in der Platte.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie adenoviral, Transduktion nativer Neuronen oder Calcium-Imaging besteht darin, dass diese Technik sowohl auf Hochdurchsatz-Screenings skaliert werden kann als auch den nativen CM-vermittelten Second-Messenger-Signalweg nutzt, um die Aktivierung von Geruchsrezeptoren zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Geruchssinns zu beantworten, wie z. B. die Übereinstimmung von Geruchsliganden, also Geruchsrezeptoren, und die Untersuchung des Einflusses genetischer Variation auf die Aktivierung von Geruchsrezeptoren. Die drei Hanna-A-Zellen, die in diesem Protokoll verwendet werden, werden in M 10-Medien bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 gehalten und sollten zu 100 % konfluent sein, um Zellen für die Transfektionsaspiration aus einer 10-Zentimeter-Schale von Zellwaschzellen zu plattieren.Durch Zugabe von 10 Millilitern PBS, Schwenken der Schale und Ansaugen des PBS fügen Sie drei Milliliter 0,05%-Trips in EDTA hinzu und warten etwa eine Minute, bis sich die Zellen bei Raumtemperatur dissoziiert haben. Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe von fünf Millilitern M 10-Medien und brechen Sie die Zellklumpen auf, indem Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 10 Mal tri bewerten. Pipettieren Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass Luftblasen in das Medium gelangen.Für jede 96-Well-Platte wird ein Milliliter Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei der 200-fachen Schwerkraft und saugen Sie den Überstand an, ohne das Zellpellet zu stören. Suspendieren Sie die Zellen in 12 Millilitern M 10-Pipette, geben Sie 50 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2.Beobachten Sie vor Beginn dieses Verfahrens die am Vortag plattierten Zellen, um eine korrekte Kofluenz von etwa 30 bis 50 % pro Vertiefung sicherzustellen. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator und fahren Sie fort. Um die Transfektion vorzubereiten, mischen Sie die Plasmide für die Expression von akzessorischen Proteinen.Firefly-Luciferase und Run-Vanilla-Luciferase wurden jeweils auf eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter in TE-Puffer verdünnt, um die Plasmidmischung herzustellen und die Plasmide gemäß den in dieser Tabelle angegebenen Volumina in Mem-Medium zu pipettieren. Für jede 96-Well-Platte verdünnen Sie 18 Mikroliter Lipidtransfektionsreagenz in 450 Mikrolitern Mem-Medium, um die Lipidtransfektionsmischung herzustellen. Pipettieren Sie anschließend das Plasmid.Mischen Sie das Plasmid mit dem Opsin-markierten Geruchsrezeptor und der Lipidtransfektionsmischung zu einer sauberen MIKROTITERPLATTE. Um den Komplex in dieser Tabelle detailliert zu machen, ist die Berechnung des Bohrlochs plus 10 % wichtig, um ein ausreichendes Volumen für die nachfolgenden Schritte sicherzustellen. Die Lösung durch Trikuration mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von M 10 gemäß der Tabelle. Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, dass die Zellen nie länger als zwei Minuten ohne Medien bleiben. Während die Lösungen zu den Brunnen hinzugefügt werden.Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und drehen Sie die Zellplatte um und klopfen Sie die Medienpipette ab, geben Sie 50 Mikroliter des Komplexes in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 am Tag nach der Transfektion der Geruchsrezeptoren. Beobachten Sie die transfizierten Zellen, um eine korrekte Kofluenz von 50 bis 80 % pro Vertiefung zu gewährleisten, und geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Der Geruch wurde auf eine Stammkonzentration von einem Molar verdünnt und DMSO für Screening-Experimente verdünnt jede Stammlösung des Geruchs auf 100 Mikromolaren.Bereiten Sie außerdem ein Geruchskontrollmittel ohne Geruchskontrolle her, das nur CD 2 93 enthält, um die Hintergrundaktivierung des Geruchsrezeptors zu kontrollieren. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und klopfen Sie das Medium aus den Zellplatten heraus. Pipettieren Sie 25 Mikroliter Geruchsstimulationslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2.Beginnen Sie mit diesem Verfahren. Auftauen eines Milliliters Glühwürmchen-Luziferase-Substrat pro 96. Bereiten Sie frische Glühwürmchen-Luciferase-Reaktionslöscher auf der Platte vor und lassen Sie das Vanille-Luciferase-Substratreagenz laufen.Pro 96er Schweißplatte wird etwa ein Milliliter Reagenz benötigt. Bereiten Sie als Nächstes den lumineszierenden Mikroplatten-Reader im Systemsymbol unter der Registerkarte "Vorheizen" vor. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen auf Ein und stellen Sie die Temperatur der Maschine unter der Spenderlasche auf 25 Grad Celsius ein.Grundieren Sie jeden Spender mit 1000 Mikrolitern 70 % Ethanol, gefolgt von 1000 Mikrolitern destilliertem Wasser. Verwenden Sie für jeden Spender separate Aliquots von Alkohol und Wasser. Entlüften Sie jeden Spender mit 1.500 Mikrolitern Luftansaugspender.Einer mit 1080 Mikrolitern Firefly Luciferase Substrate Prime Dispenser. Zwei mit Ranil-Luciferase-Substrat. Achten Sie darauf, die Luciferase-Substrate nicht zu verunreinigen.Richten Sie das folgende Protokoll ein, um die Lumineszenz von Firefly-Luciferase und Vanilla-Luciferase in der Software zu lesen. Unter dem Dateimenü. Klicken Sie auf Neue Aufgabe, Protokolle, markieren Sie und klicken Sie auf Neu erstellen.Im nächsten Fenster sollte der Kreis neben dem Standardprotokoll ausgewählt sein. Klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie auf die Prozedur.Geben Sie auf der linken Seite des Bildschirms 10 Mikroliter Glühwürmchen-Luziferase-Substrat in alle Vertiefungen ab, indem Sie Dispenser One verwenden. Klicken Sie im Menü "Aktionen" im Fenster "Dispense" auf "Dispense". Stellen Sie den Spender auf eins. Grundierung auf keine.Dosieren Sie das Volumen auf 10 Mikroliter und die Leistung auf 225 Mikroliter pro Sekunde klicken Sie auf OK. Schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang im Menü "Aktionen" und klicken Sie im Fenster "Schüttelschritt" auf "Schütteln". Stellen Sie die Intensität auf mittel und die Dauer auf 30 Klicks ein. Okay.Lesen Sie die Lumineszenz aller Wells für 0,5 Sekunden pro Well im Aktionsmenü ab. Klicken Sie im Leseschrittfenster auf "Lesen", stellen Sie die Detektionsmethode auf Lumineszenz, den Lesetyp auf den Endpunkt, die Integrationszeit auf 50 ein, den Filter auf eine Emission auf die gesamte Optik, die Position auf die obere Verstärkung auf 1:35 und die Lesehöhe auf 1,00 Millimeter. Klicken Sie auf OK.Geben Sie 10 Mikroliter gelaufenes Luciferase-Substrat mit dem zweiten Dispenser in alle Vertiefungen. Stellen Sie die Bedingungen für die Verwendung des Spenders wie gezeigt ein. Eins, außer den Spender auf zwei zu setzen.Schütteln Sie den Teller 30 Sekunden lang. Lesen Sie die Lumineszenz aller Wells für 0,5 Sekunden pro Well. Entfernen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und setzen Sie die Platte in den Mikroplatten-Reader ein.Starten Sie das zuvor eingerichtete Programm zum Lesen der Plattenlumineszenz, nachdem die Messung abgeschlossen ist. Reinigen Sie die Reagenzienspenderpumpen über das Systemsymbol unter der Registerkarte des Spenders. Spülen Sie 1000 Mikroliter Glühwürmchen-Luziferase-Substrat aus dem Glühwürmchen-Luziferase-Spender in eine Rückgewinnungsröhrchen-Grundierung.Jeder Spender mit 1000 Mikrolitern destilliertem Wasser, gefolgt von 1000 Mikrolitern 70%igem Ethanol. Und schließlich sind 1.500 Mikroliter Luft, die hier gezeigt werden, Ergebnisse eines primären Screenings, bei dem 328 Geruchsrezeptoren oder OPs gegen 26 Gerüche in einer Konzentration von 100 Mikromolaren getestet wurden. Dieses Histogramm zeigt die Häufigkeit oder Anzahl der Luziferase-Ausgangswerte, die für jedes Odoranten- oder Odorantenpaar im Screening berechnet wurden, da die Aktivierungspaare der Odorantenrezeptoren spärlich sind.Die meisten Werte sind bei Null zentriert und die große zentrale Verteilung schätzt die Rauschverteilung für diesen Assay. Dosis-Wirkungs-Kurven wurden an 48 Odorstoffen oder Paaren durchgeführt, die zufällig über den Bereich der Ausgangswerte verteilt waren, wie durch die farbigen Balken dargestellt. Blaue Balken sind Paare, die auf der Grundlage der vollen Dosiswirkung als Agonisten klassifiziert wurden, und rote Balken sind Paare, die nicht als Agonisten klassifiziert wurden.Die Richtig-Positiv-Rate wurde dann mit Hilfe des R-Statistikpakets gegen die Falsch-Positiv-Rate aufgerechnet. Die Fläche unter der Kurve oder einem UC beträgt 0,68, was darauf hinweist, dass Geruchsstoffe oder Paare mit höheren Luziferase-Screen-Werten mit größerer Wahrscheinlichkeit die Dosis-Wirkungs-Beziehung passieren als solche mit niedrigeren Werten. Diese Daten deuten darauf hin, dass das primäre Screening eine nützliche Methode zur Anreicherung von Geruchsstoffen oder Paaren ist, die in einem vollständigen Dosis-Wirkungs-Experiment als Agonisten klassifiziert werden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa sechs Stunden für 5 96 alte Platten durchgeführt werden, ohne die Inkubationszeit, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Hochdurchsatzanalyse von Geruchsrezeptoren mithilfe der Transfektionsgeruchsstimulation und die Messung der Aktivierung mit dem Luciferase-Assay durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Assaying Oberfläche Expression von Chemosensoren in heterologen Zellen

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

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Dieses Video demonstriert das Protokoll zur Messung der Odorantrezeptoraktivierung in transfizierten Zellen mit einem zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensor und Lumineszenzdetektion. Die Methode wird angewendet, um Rezeptor-Liganden-Interaktionen und Signalwege in olfaktorischen Neuronen zu untersuchen.

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