Ein Ex-vivo- Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine ex vivo-Kultur, eine Maus, embryonale Schilddrüsenimplantate oder -lappen zu präparieren, um die Untersuchung morphogenetischer und Differenzierungsereignisse während der Schilddrüsenentwicklung zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zuerst der Oberkiefer und der untere Teil des embryonalen Tages entfernt werden. E 12,5 bis E 14,5 Mausembryonen zur Isolierung der Halsregion der Embryonen.

Im zweiten Schritt werden das Neuralrohr, das Seitengewebe und die Zunge entfernt, um den oberen Teil der Luftröhre und der Speiseröhre freizulegen. Als nächstes werden die Schilddrüsenknospe, Regionen oder Lappen weiter von unerwünschtem Gewebe gereinigt. Im letzten Schritt werden die Schilddrüsenimplantate für die Kultur auf einem beschichteten Mikrotopf oder auf einem Filter plattiert.

Letztendlich können Zeitraffer-Bildgebung, Immunfärbung oder Genexpressionsanalyse durchgeführt werden, um die epitheliale Morphogenese, die dreidimensionale Organisation und die Follikel, die Vaskularisierung der Implantate oder die Differenzierung der Schilddrüsenvorläufer zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Entwicklungs- und Differenzierungsfragen zu beantworten. Frage zur Organisation von Schilddrüsenepithelzellen in 3D, Lumenbildung, Zelldifferenzierung, Polarisation und Wachstum.

Fidel Marcel, ein Doktorand, und Myla LaCorte, eine Postdoktorandin, beide aus meinem Labor, werden das Verfahren unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Flow-Haube demonstrieren. Zwei Stunden vor der Isolierung des Schilddrüsengewebes steriles Kollagen vom Typ 1 auf 50 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Endgültige Konzentration in 10 Millimolar Chlorwasserstoff und legen Sie das Kollagen auf Eis.

Decken Sie dann jede der Vertiefungen einer Kunststoffkulturkammer mit 200 Mikrolitern des verdünnten Kollagens ab und inkubieren Sie die Kammer bei Raumtemperatur. Nach zwei Stunden aspirieren Sie das Kollagen. Spülen Sie die Vertiefungen mit M1 99-Medien und fügen Sie jeweils ein Mindestvolumen von 200 Mikrolitern Nährmedium hinzu. Legen Sie die beschichteten Kammern gut in den Inkubator und fahren Sie dann mit der Schilddrüsendissektion fort.

Legen Sie zunächst die präparierte Gebärmutter in eine 10 Zentimeter große Platte, die HBSS enthält. Halten Sie dann mit einer Pinzette ein Ende der Gebärmutter fest und öffnen Sie dann die Gebärmutter mit einer kleinen Schere, um nacheinander jeden der Embryonen zu befreien. Trennen Sie die Embryonen mit der Schere von der Plazenta und übertragen Sie die Embryonen dann in ihren zusätzlichen embryonalen Membranen in eine neue 10 Zentimeter große Platte mit frischem HBSS.

Als nächstes setzen Sie die Dissektion unter einem Stereomikroskop für jeden Embryo fort. Zuerst entfernst du den Dottersack und das Amnion. Dann halten Sie Wolframnadeln in Glaskapillaren als Messer und Gabel.

Entferne den oberen Teil des Kopfes, einschließlich des Oberkiefers und der Ohren. Halten Sie den Embryo auf dem Rücken. Entfernen Sie dann ein zusätzliches Stück des Neuralrohrs und entfernen Sie anschließend den unteren Teil des Embryos direkt unter den vorderen Gliedmaßen und über dem Herzen.

Um das Gewebe auszurichten, übertragen Sie das Embryostück, das die Zunge und die Halsregion enthält, in eine neue 10 Zentimeter große Platte mit frischem HBSS und entfernen Sie das Neuralrohr und das Gewebe hinter der Speiseröhre und der Luftröhre. Schneidet nun die Gewebescheibe vorsichtig an beiden Seiten der Zunge entlang. Lokalisieren Sie dann die Speiseröhre und die Luftröhre, präparieren Sie die Zunge und lassen Sie die Retinoid-Schwellung und das Gewebe auf beiden Seiten der Speiseröhre und der Luftröhre zurück.

Nachdem Sie die Zunge entfernt haben, präparieren Sie die Speiseröhre und legen Sie die Luftröhre mit der Bauchseite nach oben. Präparieren Sie dann das unerwünschte Gewebe wie den Thymus und alle Gewebe, die sich seitlich der Rachenbogenarterien befinden. Visualisieren Sie dann für die E 13,5- oder E 14,5-Embryonen die Schilddrüsenlappen auf jeder Seite der Luftröhre und präparieren Sie die Lappen weiter von der Luftröhre

Bei E 12.5-Embryonen kann die Dissektion wie eben demonstriert bis nach der Exzidierung von Zunge und Speiseröhre durchgeführt werden. Nach der Lokalisierung der Rachenbogenarterien wird das gesamte laterale Gewebe wie bei den Embryonen E 13,5 bis 14,5 entfernt. Zum Schluss wird das isolierte Gewebe mit einer vorbenetzten Filterspitze auf einer P 200 Mikropipette in eine 35-Millimeter-Kulturplatte mit vorwarmem Kulturmedium überführt.

Vor dem Plattieren der E 13,5 bis E 14,5 Schilddrüse X explanieren. Zuerst waschen Sie das Gewebe durch sukzessive Übertragung in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die einen Milliliter vorwarmes Kulturmedium enthält, um die Lappen auf die vorbeschichteten Kammern zu plattieren. Aspirieren Sie zunächst das Kulturmedium und verwenden Sie eine Mikropipette mit gefilterten Spitzen, um vorsichtig einen Schilddrüsenlappen in jede der Kulturkammern zu stecken.

Entfernen Sie überschüssiges Medium und stellen Sie die Kulturkammer in einen Gewebekultur-Inkubator, damit sich die Explantate an der Matrix anheften können. Geben Sie dann nach zwei Stunden vorsichtig 200 bis 300 Mikroliter vorwärmtes Kulturmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Kammern wieder in den Inkubator ein, um die E 12,5-Luftröhrenregion oder die Schilddrüsenlappen auf halbporösen Filtern zu plattieren. Füllen Sie zunächst die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit hundertund30 Mikrolitern Prewarm-Kultur.

Medium Filter auf das Medium legen. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen unter dem Kulturfilter eingeschlossen werden. Verwenden Sie dann eine Mikropipette mit gefilterten Spitzen, um den Schilddrüsen-Explan oder die Schilddrüsenlappen vorsichtig zu übertragen, und geben Sie ein minimales Volumen des Mediums auf die Mitte jedes der Filter bis zu einem Maximum von vier x Explan pro Filter.

Wenn Sie die X-Explakate auf den Filter legen, ist es wichtig, sie mit einer minimalen Menge an Medium in die Mitte des Filters zu übertragen, um zu vermeiden, dass das Medium mit der Filterwand in Kontakt kommt und einen Meniskus bildet. Entfernen Sie zum Schluss überschüssiges Medium und verwenden Sie eine Wolframnadel, um es zu verteilen. Legen Sie diese dann für bis zu sieben Tage in den Gewebekultur-Inkubator, wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage unter der Laminar-Flow-Haube.

Nach einem Tag in Kultur auf einem Filter ist die Mittellinie an der Laa als längliches Gewebe sichtbar, das sich über die obere Länge erstreckt und auf jeder Seite der Luftröhre zwei Lappen bildet. Mit der Kultur dehnen sich die Lappen aus und durchlaufen eine Morphogenese-Organisation der Epithelzellen zu makroskopisch sichtbaren Follikelstrukturen. Wie in diesen Bildern gezeigt, kann die Organisation und Polarisation der kohärenten, positiven Epithelzellen durch Ezrin-Immunmarkierung sichtbar gemacht werden.

Im Laufe der Zeit verschmolzen die ezrin-positiven intrazellulären Strukturen mit dem Pol der Zelle, der zum apikalen Pol wird. Während dieses Prozesses vermehren sich Endothelzellen mit positiven vier pcam und organisieren sich um die sich entwickelnden Follikel herum, um Angio-Follikeleinheiten zu bilden. Um die Differenzierung der Thro-, Cyten- und C-Zellen zu quantifizieren, kann die Genexpression mittels R-T-Q-P-C-R von RNA getestet werden, die aus den kultivierten Schilddrüsenlappen isoliert wurde.

Während sich die Expression des Schilddrüsentranskriptionsfaktors NK X 2.1 während der Kultur nicht verändert, steigt die Expression des thy-spezifischen Thyreoglobulins und des C-Zell-spezifischen Calcitonins dramatisch an, was auf eine funktionelle Differenzierung hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Schilddrüse diseziert und kultiviert. Sie sind nicht bereit, ein Experiment mit Funktionszunahme und -verlust mit Wildtyp- oder NOCO-Embryonen durchzuführen.