Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten
13. Juni 2014
Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Adhäsion zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst eine 96-Well-Mikroplatte mit Adhäsionsmolekülen beschichtet wird. Primäre humane T-Zellen werden aus dem Blut isoliert und mit CFSE markiert.
Als nächstes werden die T-Zellen mit Behandlungen stimuliert, um ihre Adhäsion zu beeinflussen. Im letzten Schritt werden die behandelten Zellen auf die Mikroplatte gegeben und die Adhäsion kann stattfinden. Letztendlich kann die Menge der Fluoreszenz pro Vertiefung gemessen werden, um den Prozentsatz der adhärenten Zellen pro Behandlungsbedingung zu bestimmen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der T-Zell-Zugabe zu Modell und Antorium besteht darin, dass keine Co-Kultur von T-Zelle und ERL-Zelle erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. wie sich bestimmte Medikamente auf die Lymphozytenadhäsion auswirken. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie des Linienfußes geben kann, kann sie auch auf andere Maie-Zellen wie Neutrophile angewendet werden.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte schwer zu beherrschen sind und Präzision und Geschicklichkeit erfordern. Um eine Mikroplatte mit den Adhäsionsmolekülen zu codieren, beginnen Sie mit dem Waschen von 24 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern Waschlösung und inkubieren Sie dann jede Vertiefung mit Ausnahme der unbeschichteten Kontrollvertiefungen mit 50 Mikrolitern Beschichtungslösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie anschließend die Beschichtungslösung vorsichtig an, ohne dass die Pipettenspitze den Boden der Vertiefungen berührt. Nachdem Sie die Vertiefungen mit weiteren 50 Mikrolitern Waschlösung gewaschen haben, inkubieren Sie die Mikroplatte mit 50 Mikrolitern Adhäsionslösung pro Vertiefung
.Wieder bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde aspirieren Sie die Adhäsionslösung vorsichtig und waschen Sie die Vertiefungen erneut mit 50 Mikrolitern Waschlösung. Um die T-Zellen zu isolieren, mischen Sie zunächst gründlich 50 Mikroliter menschlichen T-Zell-Anreicherungscocktail pro Milliliter Vollblut und inkubieren Sie dann das behandelte Blut 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend sechs Milliliter des behandelten Blutes und ein gleiches Volumen calcium- und magnesiumfreies PBS, angereichert mit 1%D Glukose, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur und mischen Sie die Lösung vorsichtig.
Geben Sie dann 15 Milliliter Lympho Prep in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schichten Sie die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Lymphozyten-Isoliermedium. Trennen Sie die Zellschichten für 20 Minuten bei 400 mal G und 20 Grad Celsius mit dem Abbruch. Entfernen Sie dann mit einer frischen Pasterpipette die obere Schicht, wobei die Lymphozytenschicht an der Grenzfläche ungestört bleibt.
Übertragen Sie die Lymphozytenschicht mit einer neuen Pesterpipette in ein frisches konisches Röhrchen. Geben Sie neun Milliliter PBS zu den Lymphozyten und verteilen Sie die Zellen dann gleichmäßig in der Suspension, indem Sie sie sanft ein- und ausziehen. Schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet dann wieder in Medien.
Anschließend werden die Zellen in einen Kulturkolben T 75 abgefüllt. 20 Milliliter Nährmedium zur Stimulation der Zellen nach der entsprechenden Kulturperiode. Zuerst wird den sechs T-Zellen 2,4 mal 10 Serum-freies Medium zugesetzt, dann werden die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit Serum ausgehungert.
Nach zwei Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder. Markieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS acht Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit einem fluoreszierenden Marker und stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 10 Milliliter PBS mit 37 Grad Celsius hinzufügen. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet in 1,2 Millilitern vorgewärmter Adhäsionslösung.
Erwärmen Sie die beschichtete Mikroplatte auf 37 Grad Celsius und teilen Sie die Zellen dann in acht 150-Mikroliter-Aliquots in 1,5 auf. Milliliter-Röhrchen stimulieren ein Röhrchen mit PMA bei 10 Nanogramm pro Milliliter, um als Positivkontrolle zu dienen. Lassen Sie drei Röhrchen unbehandelt, um die Stimulationskontrolle, die ungewaschene Beladungskontrolle und die Kontrolle für ICAM eine Beschichtung zu warten, und stimulieren Sie vier Röhrchen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-CD-3-Antikörpern.
Dann aliquotieren Sie sofort 50 Mikroliter von einer mal 10 bis zur fünften Zellte pro Vertiefung der stimulierten Zellmischungen in die entsprechenden Vertiefungen in der Mikroplatte und inkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Um den prozentualen Anteil einer adhärenten Zelle zu bestimmen, waschen Sie zuerst jede Vertiefung mit 150 Mikrolitern warmer Adhäsionslösung. Schütteln Sie die Platte einige Sekunden lang vorsichtig und saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung ab, ohne den Boden der Vertiefungen mit den Pipettenspitzen zu berühren.
Wiederholen Sie den Waschgang dreimal und ändern Sie den Winkel der Pipette bei jeder Aspiration. Schalten Sie dann den Tellerleser ein und öffnen Sie die Tellerlesesoftware unter dem Aufgabenmenü. Klicken Sie auf Neu, um ein neues Protokoll einzurichten.
Wählen Sie dann im Menü "Aktionen" die Option "Lesen" aus. Klicken Sie auf Fluoreszenzintensität und dann auf OK. Geben Sie die Anregungswellenlänge als 485 und die Emissionswellenlänge als 528 ein.
Wählen Sie dann im Menü der optischen Option unten aus und klicken Sie auf OK. Gehen Sie dann zurück zum Aktionsmenü, stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und klicken Sie auf OK. Laden Sie abschließend die Mikroplatte und klicken Sie auf Ausführen.
Nachdem Sie die Ergebnisse in eine Tabelle exportiert haben, verwenden Sie die Formel, um den Prozentsatz der Adhärenzzellen in diesen Bildern zu berechnen. Es wird ein Beispiel für einen Adhäsionsassay mit primären T-Zellen gezeigt, die mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-Zöliakie-3-Antikörpern stimuliert wurden. Die unstimulierten Zellen dienen als Negativkontrolle.
Die PMA-behandelten Zellen dienen als Positivkontrolle Für die Anti-Zöliakie-3-Antikörper zeigt die Tabelle die relativen Fluoreszenzintensitäten von CFSE. Markierte primäre T-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen von löslichen Anti-CD-Drei-Antikörpern stimuliert und auf IAM-beschichteten Vertiefungen plattiert. Für jede Bedingung kann die durchschnittliche Intensität der dreifachen Wells berechnet und in den relativen Prozentsatz der insgesamt geladenen Zellen umgerechnet werden.
In einem typischen Experiment liegt der Prozentsatz der adhärenten PMA-behandelten Zellen zwischen 40 und 50 %, während der Prozentsatz der nicht stimulierten Zellen zwischen fünf und 10 % liegt. Beachten Sie, dass der Prozentsatz der Adhärenzzellen zunimmt, wenn die Konzentration der zur Stimulation verwendeten Anti-CD-3-Antikörper zunimmt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in weniger als drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Fluoreszenz einer ungewaschenen Vertiefung zu messen, um den Fluoreszenzeintrag zu bestimmen.
Ein kritischer Wert in der Datenanalyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die statische Zelladhäsion quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Blutproben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten.
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Übersicht
Der statische Adhäsionsassay ist eine Methode zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und anderen Zelltypen. Dabei wird eine Mikroplatte mit Adhäsionsmolekülen beschichtet und die adhärenten T-Zellen mittels Fluoreszenzmessung quantifiziert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zelladhäsion
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der T-Zell-Interaktionen ist entscheidend für die immunologische Forschung.
- Adhäsionsmoleküle spielen eine bedeutende Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion.
- Die Quantifizierung der Adhäsion kann Einblicke in das Verhalten von T-Zellen liefern.
- Dieser Assay kann an verschiedene experimentelle Bedingungen angepasst werden.
Zweck der Studie
- Quantifizierung der zellulären Adhäsion von T-Lymphozyten.
- Beurteilung der Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Adhäsivität von T-Zellen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung von T-Zell-Interaktionen.
Verwendete Methoden
- Beschichten einer 96-Well-Mikroplatte mit Adhäsionsmolekülen.
- Isolierung primärer humaner T-Zellen aus Blut.
- Markierung der T-Zellen mit CFSE zur Fluoreszenzmessung.
- Stimulation der T-Zellen mit Behandlungen zur Modifizierung ihrer Adhäsivität.
Hauptergebnisse
- Die Fluoreszenzmessung zeigt den Prozentsatz der anhaftenden Zellen an.
- Verschiedene Behandlungen beeinflussen die Adhäsionsniveaus von T-Zellen.
- Der Test liefert quantitative Daten zu den Wechselwirkungen von T-Zellen.
- Die Ergebnisse können weiterführende Untersuchungen zu Immunantworten beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Der statische Adhäsionsassay eignet sich zur Untersuchung von T-Zell-Interaktionen.
- Eine quantitative Analyse der Adhäsion kann wichtige biologische Erkenntnisse liefern.
- Diese Methode kann in verschiedenen immunologischen Forschungskontexten angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Integrin-vermittelten Adhäsion in T-Lymphozyten liefert einen mechanistischen Endpunkt zur Bewertung immunmodulatorischer Substanzen, die den Immunzellverkehr und die Synapsenbildung beeinflussen. Dieser statische Adhäsionsassay ermöglicht die Target-Validierung, indem er intrazelluläre Signalereignisse mit funktionellen adhäsiven Ergebnissen verknüpft und so die Absicherung von Kandidaten für Immunmodulatoren in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Die Anpassungsfähigkeit des Assays an andere Integrin-Ligand-Paare (z. B. VLA-4/Fibronektin) erweitert seine Anwendbarkeit auf entzündliche und autoimmune Erkrankungsbereiche.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht Signalwege der Inside-out-Signalübertragung, die die Affinitätszustände von Integrinen regulieren, und ermöglicht so die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen, die an der T-Zell-Aktivierung beteiligt sind.
- Operationaler Wert: Bietet einen quantitativen, fluoreszenzbasierten Endpunkt zur Beurteilung der Adhäsionsniveaus unter verschiedenen Behandlungsbedingungen und unterstützt dadurch die Hypothesenprüfung bei der Identifizierung von Immunmodulatoren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Dosis-Wirkungs-Daten für Verbindungen, die die Lymphozytenadhäsion beeinflussen, wie anti-CD3-Antikörper oder PMA, und ermöglicht die Identifizierung von Leitsubstanzen basierend auf funktioneller Immunmodulation.
- Operationaler Wert: Verwendet ein standardisiertes 96-Well-Format mit CFSE-Markierung und Kompatibilität mit Plattenlesegeräten, wodurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays für mittelhochdurchsatzfähige Screening-Anwendungen unterstützt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet molekulare Mechanismen der Integrinaktivierung mit zellulären Phänotypen, die für die Migration von Immunzellen und die Bildung des immunologischen Synapses relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Bewertung von adhäsionsmodulierenden Substanzen in einem krankheitsrelevanten System unter Verwendung primärer humaner T-Zellen und unterstützt so die translationale Abstimmung von Biomarkern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitsubstanz-Identifizierung ein, wobei quantitative Adhäsionsmessungen dabei helfen, Immunmodulatoren anhand ihres funktionellen Einflusses auf das T-Zell-Verhalten zu priorisieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Inside-Out-Signalwegen durch Messung von Veränderungen in der Integrin-vermittelten Adhäsion unter kontrollierter Stimulation.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Fluoreszenzsignale, die den Vergleich der Wirkung von Substanzen auf die Adhäsivität von T-Zellen über mehrere Wiederholungen hinweg ermöglichen.
- Analytik: Ermöglicht die Berechnung des Prozentsatzes adhärenter Zellen im Vergleich zu Kontrollen und liefert so eine normalisierte Kenngröße für die Struktur-Wirkungs-Beziehungsanalyse.
- Translationale Forschung: Verwendet primäre humane T-Zellen, die mit physiologischen Liganden beschichtet sind (z. B. ICAM-1), wodurch die Relevanz für humane Immunantworten erhöht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an alternative Integrin-Ligand-Paare, wodurch eine Wiederverwendung in mehreren Immunologieprojekten ohne Neuentwicklung der Kernmethodik ermöglicht wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Rezeptorstimulation mit funktionellen Adhäsionsereignissen verknüpft wird, wodurch das Vorhersagevertrauen in Immunmodulationsmechanismen erhöht wird.
- Operationaler Wert: Macht Co-Kultursysteme überflüssig, vereinfacht den Arbeitsablauf und reduziert die Variabilität im Vergleich zu zellbasierten Adhäsionstests, die antigenpräsentierende Zellen erfordern.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühere Go/No-Go-Entscheidungen, indem Verbindungen identifiziert werden, die keine Modulation der T-Zell-Adhäsion bewirken, und senkt so die Investitionen in mechanistisch inaktive Kandidaten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Immunmodulatoren basierend auf quantitativen Adhäsionsprofilen und verbessert die Kapitalnutzung in der präklinischen Entwicklung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung primärer humaner T-Zellen und in fluoreszenzbasierten Assay-Techniken.
- Setzt den Zugang zu einem Fluoreszenz-Plattenreader voraus, der zur Anregung von CFSE (485 nm) und Detektion der Emission (528 nm) in der Lage ist.
- Erfordert die Standardisierung der Beschichtungs-, Stimulations- und Waschschritte, um reproduzierbare Adhäsionsmessungen zwischen verschiedenen Vertiefungen und Experimenten zu gewährleisten.
- Die Anpassung auf andere Integrin-Ligand-Paare (z. B. VLA-4/Fibronektin) erfordert die Validierung der Beschichtungseffizienz und der Ligandspezifität.
- Zu den Einschränkungen gehören statische Bedingungen, die die scherkräfteabhängige Adhäsion, wie sie in vivo beobachtet wird, möglicherweise nicht vollständig nachbilden.
