Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Adhäsion zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst eine 96-Well-Mikroplatte mit Adhäsionsmolekülen beschichtet wird. Primäre humane T-Zellen werden aus dem Blut isoliert und mit CFSE markiert.

Als nächstes werden die T-Zellen mit Behandlungen stimuliert, um ihre Adhäsion zu beeinflussen. Im letzten Schritt werden die behandelten Zellen auf die Mikroplatte gegeben und die Adhäsion kann stattfinden. Letztendlich kann die Menge der Fluoreszenz pro Vertiefung gemessen werden, um den Prozentsatz der adhärenten Zellen pro Behandlungsbedingung zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der T-Zell-Zugabe zu Modell und Antorium besteht darin, dass keine Co-Kultur von T-Zelle und ERL-Zelle erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. wie sich bestimmte Medikamente auf die Lymphozytenadhäsion auswirken. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie des Linienfußes geben kann, kann sie auch auf andere Maie-Zellen wie Neutrophile angewendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte schwer zu beherrschen sind und Präzision und Geschicklichkeit erfordern. Um eine Mikroplatte mit den Adhäsionsmolekülen zu codieren, beginnen Sie mit dem Waschen von 24 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern Waschlösung und inkubieren Sie dann jede Vertiefung mit Ausnahme der unbeschichteten Kontrollvertiefungen mit 50 Mikrolitern Beschichtungslösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie anschließend die Beschichtungslösung vorsichtig an, ohne dass die Pipettenspitze den Boden der Vertiefungen berührt. Nachdem Sie die Vertiefungen mit weiteren 50 Mikrolitern Waschlösung gewaschen haben, inkubieren Sie die Mikroplatte mit 50 Mikrolitern Adhäsionslösung pro Vertiefung

Wieder bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde aspirieren Sie die Adhäsionslösung vorsichtig und waschen Sie die Vertiefungen erneut mit 50 Mikrolitern Waschlösung. Um die T-Zellen zu isolieren, mischen Sie zunächst gründlich 50 Mikroliter menschlichen T-Zell-Anreicherungscocktail pro Milliliter Vollblut und inkubieren Sie dann das behandelte Blut 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend sechs Milliliter des behandelten Blutes und ein gleiches Volumen calcium- und magnesiumfreies PBS, angereichert mit 1%D Glukose, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur und mischen Sie die Lösung vorsichtig.

Geben Sie dann 15 Milliliter Lympho Prep in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schichten Sie die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Lymphozyten-Isoliermedium. Trennen Sie die Zellschichten für 20 Minuten bei 400 mal G und 20 Grad Celsius mit dem Abbruch. Entfernen Sie dann mit einer frischen Pasterpipette die obere Schicht, wobei die Lymphozytenschicht an der Grenzfläche ungestört bleibt.

Übertragen Sie die Lymphozytenschicht mit einer neuen Pesterpipette in ein frisches konisches Röhrchen. Geben Sie neun Milliliter PBS zu den Lymphozyten und verteilen Sie die Zellen dann gleichmäßig in der Suspension, indem Sie sie sanft ein- und ausziehen. Schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet dann wieder in Medien.

Anschließend werden die Zellen in einen Kulturkolben T 75 abgefüllt. 20 Milliliter Nährmedium zur Stimulation der Zellen nach der entsprechenden Kulturperiode. Zuerst wird den sechs T-Zellen 2,4 mal 10 Serum-freies Medium zugesetzt, dann werden die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit Serum ausgehungert.

Nach zwei Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder. Markieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS acht Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit einem fluoreszierenden Marker und stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 10 Milliliter PBS mit 37 Grad Celsius hinzufügen. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet in 1,2 Millilitern vorgewärmter Adhäsionslösung.

Erwärmen Sie die beschichtete Mikroplatte auf 37 Grad Celsius und teilen Sie die Zellen dann in acht 150-Mikroliter-Aliquots in 1,5 auf. Milliliter-Röhrchen stimulieren ein Röhrchen mit PMA bei 10 Nanogramm pro Milliliter, um als Positivkontrolle zu dienen. Lassen Sie drei Röhrchen unbehandelt, um die Stimulationskontrolle, die ungewaschene Beladungskontrolle und die Kontrolle für ICAM eine Beschichtung zu warten, und stimulieren Sie vier Röhrchen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-CD-3-Antikörpern.

Dann aliquotieren Sie sofort 50 Mikroliter von einer mal 10 bis zur fünften Zellte pro Vertiefung der stimulierten Zellmischungen in die entsprechenden Vertiefungen in der Mikroplatte und inkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Um den prozentualen Anteil einer adhärenten Zelle zu bestimmen, waschen Sie zuerst jede Vertiefung mit 150 Mikrolitern warmer Adhäsionslösung. Schütteln Sie die Platte einige Sekunden lang vorsichtig und saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung ab, ohne den Boden der Vertiefungen mit den Pipettenspitzen zu berühren.

Wiederholen Sie den Waschgang dreimal und ändern Sie den Winkel der Pipette bei jeder Aspiration. Schalten Sie dann den Tellerleser ein und öffnen Sie die Tellerlesesoftware unter dem Aufgabenmenü. Klicken Sie auf Neu, um ein neues Protokoll einzurichten.

Wählen Sie dann im Menü "Aktionen" die Option "Lesen" aus. Klicken Sie auf Fluoreszenzintensität und dann auf OK. Geben Sie die Anregungswellenlänge als 485 und die Emissionswellenlänge als 528 ein.

Wählen Sie dann im Menü der optischen Option unten aus und klicken Sie auf OK. Gehen Sie dann zurück zum Aktionsmenü, stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und klicken Sie auf OK. Laden Sie abschließend die Mikroplatte und klicken Sie auf Ausführen.

Nachdem Sie die Ergebnisse in eine Tabelle exportiert haben, verwenden Sie die Formel, um den Prozentsatz der Adhärenzzellen in diesen Bildern zu berechnen. Es wird ein Beispiel für einen Adhäsionsassay mit primären T-Zellen gezeigt, die mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-Zöliakie-3-Antikörpern stimuliert wurden. Die unstimulierten Zellen dienen als Negativkontrolle.

Die PMA-behandelten Zellen dienen als Positivkontrolle Für die Anti-Zöliakie-3-Antikörper zeigt die Tabelle die relativen Fluoreszenzintensitäten von CFSE. Markierte primäre T-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen von löslichen Anti-CD-Drei-Antikörpern stimuliert und auf IAM-beschichteten Vertiefungen plattiert. Für jede Bedingung kann die durchschnittliche Intensität der dreifachen Wells berechnet und in den relativen Prozentsatz der insgesamt geladenen Zellen umgerechnet werden.

In einem typischen Experiment liegt der Prozentsatz der adhärenten PMA-behandelten Zellen zwischen 40 und 50 %, während der Prozentsatz der nicht stimulierten Zellen zwischen fünf und 10 % liegt. Beachten Sie, dass der Prozentsatz der Adhärenzzellen zunimmt, wenn die Konzentration der zur Stimulation verwendeten Anti-CD-3-Antikörper zunimmt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in weniger als drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Fluoreszenz einer ungewaschenen Vertiefung zu messen, um den Fluoreszenzeintrag zu bestimmen.

Ein kritischer Wert in der Datenanalyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die statische Zelladhäsion quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Blutproben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten.