Name: Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Glykosom-Dynamiken in afrikanischen Trypanosomen mit fluoreszierenden Proteinen und Durchflusszytometrie in Echtzeit analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung metabolischer Anpassungen in lebenden Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom Creative Inquiry Program for Undergraduate Research und dem Calhoun Honors College an der Clemson University finanziert.

1. Allgemeine Trypanosom Haltung <ol><li> Wiegen Feststoffe zur Herstellung SDM79 Medien (Tabelle 1). </li><li> Lagerung bei 4 ° C in 50 ml konischen oder einem Plastikbeutel. HINWEIS: Die Reagenzien sind für mindestens 6 Monate stabil. </li><li> Auftau fötalem Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad und periodisch mischen durch Umkehrung. HINWEIS: FBS wird vom Lieferanten als sterile Lösung erhalten. Filtersterilisieren FBS verringert seine Fähigkeit, das Wachstum des Parasiten zu unterstützen. </li><li> Sobald die gesamte Flasche aufgetaut, Hitze inaktiviert Serum für 30 min in einem 56 ° C Wasserbad, periodisch Mischen, um eine Ausfällung von Serumkomponenten zu minimieren. </li><li> Tauwetter Penicillin / Streptomycin-Lösung (Pen / Strep), Hämin (2 mg / ml in 50 mM NaOH) und Grundmedium Adler Vitamin-Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Um einen 1.000 ml-Messzylinder, fügen 20,2 g SDM79 Feststoffe (Tabelle 1) mit den flüssigen Komponenten (Tabelle 2) und gut mischen auf einer Rührplatte. </li><li> PH-Wert auf 7,35 und das Volumen auf 850 ml mit Wasser. </li><li> Filter sterilisieren Medien, indem ein Vakuumschlauch an der Unterseite des Filterflasche. Ziehe Vakuum bis die Lösung filtriert. </li><li> Filter entfernen oben in der biologischen Sicherheitsschrank und fügen Sie 150 ml hitzeinaktiviertem FBS. Kunststoffabdeckung entfernen aus sterilen Kappe und Dichtung Medien Flasche. </li><li> Vorbereitung SDM80 Medien in der gleichen Weise wie SDM79 mit folgenden Ausnahmen; nicht Glucose oder Glucosamin hinzufügen und MEM ohne Glutamin. Anstelle von 150 ml hitzeinaktiviertem FBS, fügen Sie 135 ml dialysiert, Hitze inaktiviert FBS und 15 ml hitzeinaktiviertem FBS. </li><li> Kultur PCF Parasiten in 25 cm 2-Kolben mit 10 ml geeigneten Medium bei 27 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Zellen sollten täglich mit einer Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer gezählt werden (siehe Abschnitt 6) und Kulturen sind bei Dichten zwischen 1 x 10 5 und 5 x 10 6 Zellen / ml gehalten werden. </li></ol> 2. Transfection von PCF Parasiten mit dem fluoreszierenden Reporterkonstrukt HINWEIS: Um glycosome Dynamik zu folgen, ein Reporterprotein, das die peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) von Aldolase zu mehr gelb fluoreszierenden Protein fusioniert ist in den Parasiten ausgedrückt. Die Sequenz für das Fusionsprotein kodiert, in pXS2bla 12, die den procyclin Promotor und die Tubulin intergenen Regionen, die direkt homologe Rekombination in das Genom und die Blasticin Resistenzgen zur Selektion enthält, kloniert. Prozyklischen Zelllinien, die Gene beherbergen, die T7-Polymerase und Tetracyclin-Repressor (PF29-13) kodieren, sind mit dem Targeting-Konstrukt, pXS2 verwandelt: PTS2eYFP. <ol><li> Bereiten cytomix durch Mischen der in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren und lagern bei RT. </li><li> Linearisieren von Plasmid-DNA mit MluI durch Pipettieren von 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul Restriktionsenzym-Puffer, 33 ul Wasser und 2 μL MluI Enzyms in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Reinige den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1 Volumen von Bindungspuffer zu dem Restriktionsenzym-Verdau. Mischen Bindungspuffer und verdauten DNA durch Verwirbelung. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Legen Sie eine DNA-bindende Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen, und Übertragung verdaute DNA / Bindungspufferlösung Spalte. </li><li> Zentrifuge für 10.000 g für 1 min. Nach der Zentrifugation verworfen Filtrat von Sammelröhrchen und gibt die Spalte an die Sammelröhrchen. </li><li> Fügen Sie 700 ul Waschpuffer SPW und Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min. </li><li> Verwerfen Filtrat von Sammelröhrchen, kehren die Spalte an die Sammelröhrchen und wiederholen SPW Waschschritt und Zentrifugieren. </li><li> Verwerfen Filtrat, Rück Spalte Sammelröhrchen und Zentrifuge leere Spalte für 3 min bei 10.000 × g Rest Ethanol zu entfernen. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank, wegwerfen colwahl Rohr und Ort Spalte in einem sterilen Reaktionsgefäß. </li><li> Zur Elution der DNA, fügen Sie 25 ul sterilem Wasser auf Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifugieren bei 10000 × g für 1 min. </li><li> Fügen Sie weitere 25 ul sterilem Wasser in biologischen Sicherheit Haube Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank übertragen gesamte Volumen der DNA auf eine neue sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Dieser Schritt verhindert die Kontamination von der offenen Deckel während der Zentrifugation. </li><li> Hinzufügen des sterilen, gereinigt linearisierte DNA (10 ug) in 400 ul sterilfiltriert cytomix. </li><li> Zählen von Zellen, wie in Abschnitt 6 durch Zentrifugation bei 800 g für 15 min bei RT beschrieben und ernten 5 x10 7 -10 8 Zellen. </li><li> Überstand abgießen und Zellpellet in 450 ul DNA + cytomix mit einer 1 ml serologische Pipette. </li><li> Transfer-Lösung enthält ce<html> lls, DNA und cytomix in ein steriles Abstand von 4 mm Küvette und Ort in der Küvette Elektroporationskammer. </li><li> Wählen Sie &quot;exponentiellen Abfall&quot; und geben Sie manuell die folgenden Einstellungen: Spannung: 1,5 kV, Kapazität: 25 mF, Widerstand: Ω und Küvette: 4 mm. Drücken Puls. Sobald der Impuls beendet ist, entfernen Küvette aus dem Elektroporationskammer und zum Biosicherheitswerkbank. </li><li> In eine neue sterile Flasche, Pipette 10 ml SDM79. Übertragen der transformierten Zellen in den Kolben mit 10 ml SDM79. </li><li> Inkubieren ohne Arzneimittel Selektion für 24 h bei 27 ° C, 5% CO 2. Nach 24 Stunden hinzu G418 (15 ug / ml), Hygromycin (50 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformierten Zellen mit Drogen in 9 ml SDM79 mit Drogen. </li><li> Analysieren Sie die Zellen täglich, wie in Abschnitt 6 und 7. Wenn Zellen fluoreszierende sind beschrieben und haben eine Zelldichte von 1 x 10 7 / ml erreicht, stellen stabilates für die Langzeitspeicherung (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Erstellen Stabilates <ol><li> Um das Einfrieren Medien, ein gleiches Volumen von 100% Glycerin zu cytomix und Filter sterilisieren. </li><li> Geben Sie 200 ul des Einfrierens Medien bis 800 ul von Zellen (1 x 10 7) in einem Kryoröhrchen, vorsichtig mischen und Inversion zwischen zwei Styropor-Racks und frieren bei -80 ° C. </li><li> Einmal gefroren (~ 24 h), Transfer Zellen in flüssigen Stickstoff. HINWEIS: Es ist wichtig, Zellen in LN 2 nach 24 h bei -80 bewegen, wie eine längere Lagerung ° C führt zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 4. Auftauen Aktien <ol><li> Entfernen gefrorenen Ampulle von -80 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur für etwa 10 min. </li><li> Pipette 9 ml SDM79 mit Drogen in eine neue sterile Flasche. Fügen Sie aufgetauten Zellen zu diesen Kolben. Geben Zellen 1:10 Zugabe von 1 ml dieser Kultur in 9 ml SDM79 in einen neuen Kolben (Endkonzentration von 1 x 10 5 / ml). </li><li> Bevor die Zellen eine Dichte von 10 7 / ml erreichen, beginnen Durchflusszytometer eingestelltund Verdünnungsanalysen. </li></ol> 5. Durchflusszytometer-Setup <ol><li> Schalten Sie das Durchflusszytometer und CFlow Plus-Programm zu öffnen. HINWEIS: Bevor Sie irgendwelche Proben sollten die Fluidik gemäß den Schritten 5,2-5,7 rückgespült und ausgespült werden. </li><li> Ersetzen Sie den Schlauch von Nanopure Wasser, in dem die SIP ist mit einem Leerrohr gespeichert. </li><li> Wählen Sie die &quot;Rückspülung&quot;-Taste. </li><li> Nach Rückspülung abgeschlossen ist, entfernen Mikrozentrifugenröhrchen von Schluck und entsorgen. </li><li> Legen Sie eine neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml neuen nanoreinem Wasser auf dem Schluck. </li><li> Wählen Sie einen neuen Brunnen in CFlow Programm. Unter &quot;Ausführen Limits&quot; eingestellte Zeit für 2 min. Unter &quot;Fluidtechnik&quot; wählen Sie &quot;schnell&quot; und &quot;Ausführen&quot;. </li><li> Sobald die 2 min Frist abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Löschen Beispieldaten&quot;. </li></ol> 6. Zellzählung mit dem Durchflusszytometer <ol><li> Wasser zu ersetzen mit der Probe, die gezählt werden. Set &quot;Führen Limits &quot;bis 30 Sekunden&quot;, Fluidik &quot;auf&quot; schnell &quot;und wählen Sie dann&quot; Ausführen &quot;. </li><li> Nach Ablauf der 30 Sekunden Frist abgeschlossen ist, CFlow Plus wird die Ereignisse / ul unter &quot;Last Run&quot;. Zahl für jede Kultur Wiederholen bieten. HINWEIS: Bevor Zellen erreichen 1 x 10 7 Zellen / ml, fahren Sie mit Verdünnungsanalyse. Zellen sollten nicht fort nach einer Verdünnungsanalyse abgeschlossen ist. Zellen für längere Zeiträume kultiviert verlieren ihre Fähigkeit, sich an Umweltbedingungen zu reagieren. </li></ol> 7. Messung der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer <ol><li> , Um die Fluoreszenz zu beurteilen, setzen Sie &quot;Run Limits&quot; zu 10.000 Ereignisse und &quot;Fluidtechnik&quot; auf &quot;langsam&quot;. Wählen Sie &quot;Schwelle&quot;. Unter &quot;Primary Threshold&quot;, wählen Sie &quot;dauerhaft zu beseitigen Veranstaltungen&quot;, &quot;FSC-H&quot; (in Drop-Down-Box) und geben Sie weniger als 30.000. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot; und dann auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Wählen Sie die220; Histogramm &quot;-Taste in einem der neuen Plot-Fenster und wählen Sie&quot; FSC-A &quot;aus der Dropdown-Liste, wählen Sie&quot; FL1-A &quot;. HINWEIS: FL1-A Maßnahmen Fluoreszenz in der 530 nm Wellenlänge. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; und wiederholen Sie für alle Kulturen. </li><li> Führen Sie die Reinigungslösung durch die Fluidik Linie für 2 Minuten und Wasser für 2 min. </li></ol> 8. Verdünnungsanalysen <ol><li> Geben Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 5 Zellen / ml in 3 ml SDM79 in einer 25 cm 2 Kulturflasche und Messen Fluoreszenz unmittelbar nach Durchgang und dann 3 Stunden und 24 Stunden. </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Wählen Sie &quot;Analysieren&quot; Vorsprung auf CFlow Plus an. </li><li> Klicken Sie wird &quot;Histogramm&quot; unter &quot;Machen Sie eine neue Handlung.&quot; Wählen einer Dropdown-Liste &quot;FSC-A&quot; und erscheinen. Wählen Sie den Kanal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Markieren Sie eine gut zu analysieren. Wählen Sie &quot;Gate&quot;-Taste und manuell zeichnen eine Gate-für die Bevölkerung von Interesse. </li><li> Flow Plus liefert Zelle &quot;Count&quot; in diesem Tor und &quot;% dieser Plot&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetoplastids%3A+related+protozoan+pathogens%2C+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li>
<li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li>
<li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids%3A+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes%2C+glyoxysomes+and+glycosomes+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li>
<li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes%3A+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li>
<li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function%2C+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li>
<li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li>
<li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li>
<li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li>
<li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%3A+RNA+interference+studies+of+PEX14%2C+hexokinase%2C+and+phosphofructokinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li>
<li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li>
<li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li>
<li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li>
<li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li>
<li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+medical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li>
<li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li>
<li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li>
<li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+trypanosomatid+PEX19%3A+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li>
<li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi%27s+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li>
<li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells%3A+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li>
<li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li>
<li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li>
<li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem eine schne...

Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle 1 erfordert. Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen 13. Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird 14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen 14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP 16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine ​​mit glykolytischen Proteine ​​in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine ​​im TCA-Zyklus und Atmungskette 13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen. Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit 20 niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit 17 Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um 18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt. Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei 2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei 12. Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen 25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine ​​wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert. Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) 12 verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren. Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoesäure</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraktionskit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Serum Fisher</td><td></td> <td>in Forschungsqualität03-600-511</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Glucosamin HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Gefriermedium</td></tr><tr><td>Graces Insektenzellmedium</td><td>Pulver GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Guanosin</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix Zutat</td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>MEM Aminosäuren (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>NEAA Mischung (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) mit L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>Natriumbiocarbonat</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Lösung</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix Zutat</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch wasserfrei</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix Zutat</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>L-Serin</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure, Natriumsalz</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Zutat</td></tr><tr><td>L-Taurin</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>L-Threonin</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>ICN Biomedicals</td><td></td><td>103183 SDM79 Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Bindungspuffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>SPW Waschpuffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Genpulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosomentransformation</td></tr><tr><td>4 mm Elektroporationsküvetten</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosomentransformation</td></tr></tbody></table>

mit fluoreszierenden proteinen zu glycosome dynamics in der afrikanischen trypanosomen auf monitor

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern 1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen 2-5. Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt 4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden. Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen 12 leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.

In diesem System wurde eine glucoseabhängige Änderung glycosome Zusammensetzung beobachtet. Wenn Zellen in Glucose enthaltenden Medien gezüchtet werden zwei Populationen beobachtet; eine helle und eine dim (Abbildung 2a). Dim Zellen beherbergen unreifen Glykosomen, die nicht importiert haben die PTS2eYFP während helle Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Glykosomen 12. Wenn Glukose in den Medien vorhanden ist, ist Fehllokalisation von Proteinen tödliche glycosome 15,2...

Die Glykosomendynamik in afrikanischen Trypanosomen ist mit traditionellen zellbiologischen Techniken wie Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie schwer zu untersuchen. Um das Verhalten dynamischer Organellen zu beobachten, wurde ein Fluoreszenz-Organellen-Reportersystem in Verbindung mit der Durchflusszytometrie verwendet, um die Echtzeit-Glykosomendynamik in lebenden Parasiten zu überwachen.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zeitliche Veränderungen in der Glyko-Zusammensetzung in lebenden Zellen in Echtzeit zu beobachten. Dies wird erreicht, indem ein fluoreszierendes Protein, das an eine Peroxisom-Targeting-Sequenz PTS2 fusioniert ist, exprimiert wird. Das Fusionsprotein wird in reife Glykozonen importiert, die dadurch zu fluoreszierenden Organellen werden.Abbau und Recycling führen zu einem Verlust der Fluoreszenz, der mittels Durchflusszytometrie überwacht werden kann. Zellen werden unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt, um Faktoren zu identifizieren, die eine Glykoumgestaltung auslösen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Glykozusammensetzung als Reaktion auf Umweltveränderungen verändert, basierend auf Änderungen der zellulären Fluoreszenz, wenn Zellen von nährstoffarmen in nährstoffreiche Medien übergehen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie liegt daher darin, dass eine Echtzeitanalyse von Tausenden von Zellen ermöglicht wird.Den Versuchsdurchgang werden Sarah Bauer, eine Doktorandin, und Megan Conlan, eine Studentin aus meinem Labor, demonstrieren. D

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Die Effektortranslokation in Wirtszellen über ein Typ-III-Sekretionssystem ist eine gängige Virulenzstrategie bei gramnegativen Bakterien. Es wurde ein auf Beta-Lactamase-Effektorfusion basierender Assay zur quantitativen Analyse der Translokation angewendet. In Yersinien-infizierten Zellen wird die Umwandlung eines FRET-Reporters durch die Beta-Lactamase mittels Laser-Scanning-Mikroskopie überwacht.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Das Hinzufügen eines Tags zu einem Protein ist eine mächtige Möglichkeit, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Hunderte von Trypanosoma brucei-Proteinen parallel endogen zu markieren, so dass eine Markierung im Genommaßstab möglich ist.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Erfahren Sie, wie Sie Glykosom-Dynamiken in afrikanischen Trypanosomen mit fluoreszierenden Proteinen und Durchflusszytometrie in Echtzeit analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung metabolischer Anpassungen in lebenden Zellen.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Weitere Videos entdecken