Eine neue Methode zur Klärung biliäre Leberdegeneration Visualisieren Während Metamorphosis in Seeneunauge ( Petromyzon marinus)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die gesamte Leber und die Verbindung zum Darm zur globalen, strukturellen und zellulären Analyse der Gallengangdegeneration bei metamorphosierenden C-Lampreten zu klären. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst in der Hydrogel-Monomerlösung fixiert wird.

Anschließend wird das Hydrogel mit dem fixierten Gewebe polymerisiert. Danach wird die Plasmamembran des fixierten Gewebes entfernt, wodurch das Gewebe transparent wird. Schließlich erfolgt eine immunfluoreszenzmarkierte Färbung, wobei abschließend Laser-Scanning- und konfokale Mikroskopie angewendet werden, um globale strukturelle und zelluläre Veränderungen während der Gallengangdegeneration in metamorphem c Lampry darzustellen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich beantworten, beispielsweise die Erforschung der Connectome im zentralen Nervensystem und in unserem Fall die Gallengangdegeneration während der Serum-Punkt-Metamorphose. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose von menschlichen Gallengang- oder Atresieerkrankungen, da diese seltene angeborene Säuglingskrankheit ähnliche Merkmale mit der Ary-Degeneration während der Serum-Punkt-Metamorphose teilt. Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir einen Nachrichtenartikel in Nature fanden und das Online-Video während unseres Labortreffens präsentierten, das den Eingriff veranschaulicht. Die Durchführung erfolgt durch Ann Scott, eine Doktorandin aus unserem Labor, nachdem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Phosphatpuffer oder pb gemäß dem schriftlichen Protokoll hergestellt wurden.

Bereiten Sie in einem Abzug 400 Milliliter Hydrogel zu, indem Sie destilliertes Wasser, 40 % Acrylamid, 2 % Bis-Acrylamid, 10× PBS, 16 % Paraformaldehyd, Saponin und Ammoniumpersulfat kombinieren. Bereiten Sie einen Liter Klärungslösung aus 4 % SDS und 0,2 molaren Borsäure vor und stellen Sie 500 Milliliter 80 % Glycerin her, um das Gewebe im Abzug vorzubereiten. Pipettieren Sie 10 Milliliter Hydrogel-Monomerlösung in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Dissektieren Sie die Gewebeprobe und geben Sie das Gewebe in jedes Röhrchen mit Hydrogel-Fixierlösung bei vier Grad Celsius für zwei Tage. Nach der Inkubation unter dem Abzug die fixierten Gewebeproben durch Zugabe von fünf Mikrolitern Temid polymerisieren. Anschließend gut mischen und die Proben zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Nach der Inkubation das überschüssige Gel gründlich entfernen, um die Gewebeproben zu klären. Jede Probe in 15 Milliliter Klärungslösung geben und mehrere Tage bei 50 Grad Celsius und 70 U/min inkubieren, bis sie transparent wird. Die Klärungslösung mindestens einmal täglich wechseln und jegliches überschüssiges Gel entfernen.

Überführen Sie die Proben in 15 Milliliter 0,1 molarer PB mit 0,1 % Triton X-100 bei 37 Grad Celsius und 70 U/min über Nacht. Wiederholen Sie die Inkubation zwei weitere Male mit frischem Puffer. Da das Gewebe nun geklärt ist und von überschüssigem Gel befreit wurde, tauchen Sie die Proben in das primäre Antikörperpräparat in PB mit Triton X-100 ein und inkubieren Sie zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 70 U/min. Nach der Inkubation waschen Sie die Gewebeproben über Nacht mit 15 Milliliter PB mit 0,1 % Triton X-100 bei 37 Grad Celsius und 70 U/min.

Wiederholen Sie die Waschung dreimal, entfernen Sie anschließend den letzten Waschpuffer, geben Sie die fluoreszierende sekundäre Antikörperlösung in PB mit 0,1 % Triton X-100 und blockierendem Serum hinzu und inkubieren Sie einen Tag lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 70 U/min. Nach dreimaligem Waschen der Proben in je 10 Milliliter PB mit Triton X-100 bei 37 Grad Celsius und 70 U/min über Nacht führen Sie drei weitere Übernacht-Waschungen in PBS durch. Inkubieren Sie das geklärte Gewebe abschließend über Nacht in 80 % Glycerin, das mit Aluminiumfolie abgedeckt ist.

Die konfokale Mikroskopie wird anschließend im Dunkeln oder bei gedämpftem Licht durchgeführt, obwohl in diesem Video zur besseren Veranschaulichung das Licht eingeschaltet ist. Während der Metamorphose der c-Lampre treten mehrere wichtige Entwicklungsereignisse im HEPA-biliären System auf, beispielsweise, wie hier gezeigt, Apoptose und Degeneration des Gallengangs und der Gallenblase. Nach Anwendung der modifizierten Klärungsmethode und Färbung mit dem Leberzellmarker Cytokeratin 19 sowie dem antiapoptotischen Marker BCL zwei wurde die Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie verwendet, um optische Schnitte durch die intakte Leber durchzuführen.

Die Färbung zeigte, dass der degenerative Prozess in den metamorphen Stadien zwei bis vier auftritt. Die oberen Bilder stammen vom vorderen, die unteren vom hinteren Ende. Dargestellt ist hier der Gallengangbaum und hier dunkle, dendritisch aussehende apoptotische Zellen sowie umgebende Kanälchen und Ductuli in der Leber.

Diese Abbildung zeigt dreidimensionale Bilder, die aus der konfokalen Z-Serie von drei Lebern zwischen den metamorphen Stadien zwei und drei rekonstruiert wurden und mit Antikörpern gegen Cytokeratin 19 und BCL-2 markiert sind; der Gallengangbaum und die dunklen, dendritisch aussehenden apoptotischen Zellen sowie die umgebenden Kanälchen und Gallengänge sind jeweils mit weißen und schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Gezeigt ist hier ein konfokaler optischer Schnitt der Gallengänge eines Exemplars zwischen den metamorphen Stadien zwei und drei mit Gallentröpfchen im Lumen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das gesamte Gewebe für weitere bildgebende Analysen transparent gemacht werden kann.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Paraform, Aldehyd und Polyacrylamidlösungen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die Nutzung der Abzugshaube stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.