Eine neue Methode zur Klärung biliäre Leberdegeneration Visualisieren Während Metamorphosis in Seeneunauge ( Petromyzon marinus)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Aufklärung der gesamten Leber und der Verbindung mit dem Darm für globale, strukturelle und zelluläre Analysen der Gallendegeneration. Im metamorphen C Neunauge. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gewebe in der Hydrogel-Monomerlösung fixiert wird.

Als nächstes wird das Hydrogel mit dem fixierten Gewebe polymerisiert. Dann wird die Plasmamembran des fixierten Gewebes entfernt und das Gewebe wird transparent. Schließlich wird eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, schließlich wird eine Laserhaut und konfokale Mikroskopie verwendet, um globale strukturelle und zelluläre Veränderungen während der Gallendegeneration in metamorphen c Lampry zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Konnektome im Zentralnervensystem und in unserem Fall die Gallendegeneration während der Serumpunktmetamorphose. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose der menschlichen Gallen- oder Atresie, da diese seltene angeborene Säuglingskrankheit ähnliche Merkmale aufweist wie die äre Degeneration während der Serumpunktmetamorphose. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir einen Nachrichtenartikel in der Natur fanden und das Online-Video während unseres Labortreffens präsentierten, das zeigte, dass das Verfahren Ann Scott, eine Doktorandin aus unserem Labor, nach der Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Phosphatpuffer oder pb gemäß dem Textprotokoll sein wird.

Bereiten Sie in einem Abzug 400 Milliliter Hydrogel vor, indem Sie destilliertes Wasser, 40 % Acrylamid, 2 % Bis, Acrylamid 10 XPBS, 16 % Paraform, Aldehyd, Saponin und Ammonium pro Sulfat kombinieren. Bereiten Sie einen Liter Reinigungslösung vor, die aus 4 % SDS und 0,2 molaren Borsäure besteht, und stellen Sie 500 Milliliter 80 % Glycerin her, um das Gewebe im Abzug vorzubereiten. Eloqua 10 Milliliter Hydrogelmonomerlösung in 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen geben.

Präparieren Sie die Gewebeprobe und legen Sie das Gewebe zwei Tage lang bei vier Grad Celsius in jedes Röhrchen mit Hydrogelfix. Nach der Inkubation unter einem Abzug polymerisieren Sie das fixierte Gewebe durch Zugabe von fünf Mikrolitern Temid. Dann gut mischen und die Proben zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Entfernen Sie nach der Inkubation das überschüssige Gel gründlich, um die Gewebeproben zu reinigen. Geben Sie jedes in 15 Milliliter Reinigungslösung und inkubieren Sie es mehrere Tage lang bei 50 Grad Celsius und 70 U/min, bis es transparent wird. Wechseln Sie die Reinigungslösung mindestens einmal täglich und entfernen Sie überschüssiges Gel.

Übertragen Sie die Proben in 15 Millilitern 0,1 molar PB mit 0,1 % Triton X 100 bei 37 Grad Celsius und 70 U/min über Nacht. Wiederholen Sie die Inkubation noch zwei weitere Male mit frischem Puffer. Jetzt, da das Gewebe gereinigt und frei von überschüssigem Gel ist, tauchen Sie die Proben in Primärantikörper in PB Tritton X 100 und inkubieren Sie nach der Inkubation zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 70 U/min, verwenden Sie 15 Milliliter PB mit 0,1 % Tritton X 100, um die Gewebeproben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 70 U/min zu waschen.

Wiederholen Sie die Wäsche dreimal, nachdem Sie den letzten Waschpuffer entfernt haben, fügen Sie fluoreszierende Sekundärantikörperlösung in PB mit 0,1 % Trix 100 und Blockserum hinzu und inkubieren Sie einen Tag lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 70 U/min. Nachdem Sie die Proben über Nacht dreimal in 10 Millilitern PB tritton X 100 bei 37 Grad Celsius und 70 U/min gewaschen haben, führen Sie drei Waschgänge über Nacht in PBS durch. Zum Schluss inkubieren Sie das geklärte Gewebe über Nacht in 80%igem Glycerin, das mit Folie bedeckt ist.

Die konfokale Mikroskopie wird dann bei dunklem oder schwachem Licht durchgeführt, obwohl die Lichter in diesem Video zu Visualisierungszwecken eingeschaltet sind. Während der Blutmetamorphose treten mehrere wichtige Entwicklungsereignisse im HEPA-Gallensystem auf, z. B. durchlaufen der Gallengang und die Gallenblase, wie hier gezeigt, eine Apoptose und eine Degeneration. Nach der Anwendung der modifizierten Klärungsmethode und der Färbung mit dem Leberzellmarker Cytokeratin 19 anti-apoptotischer Marker wurde die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie BCL zwei verwendet, um einen optischen Schnitt durch die intakte Leber durchzuführen.

Die Färbung zeigte, dass der degenerative Prozess in den metamorphen Stadien zwei bis vier abläuft. Die oberen Paneele stammen vom vorderen und die unteren Paneele vom hinteren Ende. Hier ist der Gallenbaum zu sehen, und hier sind dunkel dendritisch aussehende apoptotische Zellen und umgebende Canaliculi und Gangwerkzeuge in der Leber

Diese Abbildung zeigt dreidimensionale Bilder, die rekonstruiert sind: die konfokale Z-Serie von drei Lebern zwischen den metamorphen Stadien zwei und drei, die mit Antikörpern gegen Cytokeratin 19 und BCL zwei markiert sind, den Gallenbaum und die dunkel dendritisch aussehenden apoptotischen Zellen sowie die umgebenden Kanälchen und Gangwerkzeuge, die mit weißen bzw. schwarzen Pfeilen markiert sind. Hier ist ein konfokaler optischer Schnitt der Gallengänge einer Probe zwischen den metamorphen Stadien zwei und drei mit Gallentröpfchen im Lumen zu sehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das gesamte Gewebe für weitere bildgebende Analysen klären können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraform-, Aldehyd- und Polyacrylamidlösungen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die Verwendung des Abzugs getroffen werden sollten.