Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P _F) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Funktion von Aquaporinen durch die Bestimmung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (PF) von pflanzlichen Protoplasten zu verstehen. Schneiden Sie ein Stück aus einem Blatt ohne axiale Epidermis aus und legen Sie es auf eine isotonische Lösung. Die Stücke in eine enzymatische Lösung geben und 20 Minuten bei 28 Grad Celsius inkubieren, dann in eine frische isotonische Lösung.

Sammeln Sie als Nächstes die Protoplasten, die die Lösung enthalten, mit einer abgeschnittenen Spitze. Bereiten Sie in einem zweiten Schritt eine Experimentierkammer vor. Befestigen Sie ein Deckglas mit Silikonfett an der Unterseite der Rutsche.

Bestreichen Sie dann den Kammerboden mit einem positiv geladenen Lagerkleber und füllen Sie die Kammer mit einer isotonischen Lösung. Isolierte Protoplasten werden dann in die Kammer gegeben, und die Kammer wird vorsichtig auf dem Mikroskoptisch platziert. Anschließend werden die Protoplasten einer hypotonen Lösung ausgesetzt, während Videos aufgenommen werden, um den zeitlichen Verlauf der Schwellung festzuhalten.

Als nächstes wird der Schwellungszeitverlauf numerisch mittels Software einschließlich Cur-Fiting-Verfahren analysiert, um das PF jedes Protoplasten auf der Grundlage der numerischen Analyseergebnisse zu bestimmen, die Unterschiede im PF zeigen, die beispielsweise durch die Expression verschiedener Aquaporin-Gene induziert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der zellulären Membranphysiologie zu beantworten, wie z.B. die Regulation der Funktion von Aquaporin. Obwohl diese Methode einen Einblick in matisches Wasser geben kann, kann die Durchlässigkeit von Pflanzenwasserpflanzen, die entweder heimisch oder gentechnisch verändert sind, liefern.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf ide exposed origin of interest. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die erforderlichen isotonischen und hypertonischen Lösungen vor und überprüfen Sie deren Osmolarität. Bei Verwendung eines OSM-Reglers muss die Osmolarität jeder Lösung innerhalb von 3 % des Zielwerts liegen.

Füllen Sie eine 10 Zentimeter große Petrischale mit etwa sechs Tropfen isotonischer Lösung. Schälen Sie das ABBA-Siegel oder senken Sie die Epidermis eines Kaninchens opsys ab und schneiden Sie das geschälte Blatt in Quadrate von etwa vier mal vier Millimetern. Legen Sie die kleinen Stücke mit der freiliegenden axialen Seite nach unten auf die isotonischen Lösungstropfen und berühren Sie die Lösung.

Als nächstes lösen Sie 5,7 Milligramm der Enzymmischung in 165 Mikrolitern isotonischer Lösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf und mischen Sie vorsichtig, indem Sie etwa eine Minute lang pipettieren, bis sie sich aufgelöst haben. Geben Sie mehrere gleiche Tropfen der enzymatischen Lösung in dieselbe Petrischale. Übertragen Sie die Blattstücke auf die enzymatische Lösung. Tropfen.

Schließen Sie die Schale und verschließen Sie den Deckel mit einer Runde Perfil. Lassen Sie das Gericht 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 28 Grad Celsius schwimmen. Geben Sie nach 20 Minuten einige weitere Tropfen der isotonischen Lösung mit einer Pinzette in die Schale.

Heben Sie jedes Blattstück an seiner Kante an, um es in einen neuen isotonischen Lösungstropfen zu übertragen, und dann nacheinander in einen zweiten Tropfen. Schütteln Sie das Blattstück im zweiten Tropfen, um die Protoplasten mit einer abgeschnittenen 100-Mikroliter-Pipettenspitze freizusetzen. Sammeln Sie die Tropfen mit den Protoplasten in einer 1,5 Milliliter Tube.

Bereiten Sie das Profusionssystem vor, indem Sie eine Säule mit der isotonischen Lösung und eine andere Säule mit der hypotonischen Lösung füllen. Öffnen Sie das Ventil, um etwas hypotonische Lösung fließen zu lassen, um den Schlauch bis zum Einlasskrümmer zu füllen. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, schließen Sie das Ventil.

Wiederholen Sie den Vorgang für die isotonische Lösung. Versiegeln Sie einen Deckglas mit Silikonfett, um einen Boden für die Kammer innerhalb des Plexiglasschiebers herzustellen, um den Kammerboden für Protoplasten klebrig zu machen, und beschichten Sie ihn mit positiv geladenem Protaminsulfat oder Poly-L-Lysin. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um diesen Kleber auf dem Deckglas zu verteilen.

Warten Sie ein bis zwei Minuten. Spülen Sie drei- bis viermal mit der isotonischen Lösung und schütteln Sie die restliche Lösung ab. Füllen Sie die Kammer mit der isotonischen Lösung.

Verwenden Sie dann eine abgeschnittene Pipettenspitze, um einen Tropfen Protoplasten, die Lösung enthalten, in die Kammer zu geben. Und warten Sie drei bis vier Minuten, bis sich die Protoplasten gesetzt haben. Decken Sie die Kammer mit einer transparenten Abdeckung ab, die die Lösungsoberfläche berührt.

Vermeiden Sie es, Luftblasen darunter einzuschließen. Legen Sie einen Objektträger vorsichtig auf einen inversen Mikroskoptisch und verbinden Sie ihn mit dem Perfusionssystem und der Pumpe, um Luftblasen im Schlauch zu vermeiden. Schalten Sie den isotonischen Lösungsfluss für eine konstante Perfusion bei einem Milliliter pro Minute ein.

Wählen Sie zum Aufzeichnen von Lautstärkeänderungen ein Ansichtsfeld mit möglichst vielen kugelförmigen Zellen und einer gut fokussierten Zellkontur am größten Umfang. Nehmen Sie ein 62. Video von ausgewählten unbeweglichen Protoplasten mit einer Geschwindigkeit von einem Bild pro Sekunde oder einem Hertz auf. Starten Sie die Aufnahme mit einer 15-sekündigen Wäsche der isotonischen Lösung und wechseln Sie für 45 Sekunden zur hypertonischen Lösung.

Speichern Sie den Film im Tiff-Format unter Um eine Reihe von Bildern einer anschwellenden Zelle zu analysieren, verwenden Sie den Image Explorer und die Protoplasten-Analyzer-Plugins in der Image J-Software. Starten Sie das Bild, J.To den Film zu öffnen, klicken Sie im Bedienfeld "Bild J" auf "Datei" und dann nacheinander in den Dropdown-Menüs, während der Import aufgeklappt wird. Dann Bild-Explorer.

Markieren Sie den ausgewählten Film. Klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und dann nach links. Klicken Sie auf Protoplasten-Analysator.

Zeichnen Sie auf dem ersten Bild mit der Maus Kreise um die ausgewählten Protoplasten. Klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie in der Tabelle der Erkennungsparameter, die zum Starten des Protoplasten-Erkennungsalgorithmus angezeigt wird, im oberen Bereich des Protoplasten-Bildes auf Lokal.

Dann verarbeiten. Untersuchen Sie im Dropdown-Menü die grünen Kreise um die ausgewählten Protoplasten im gesamten Film. Speichern Sie die Ergebnisse mit dem unteren Schieberegler in einer Excel-Datei.

Die Analyse erfolgt Frame für Frame. Daher ist bei mehr als einer Zelle eine Sortierung erforderlich, um die Zeilen zu trennen, die zu jeder Zelle Hier gehören. Die drei Zeitverläufe werden in einer Excel-Tabelle vor und nach der Sortierung dargestellt, wobei die Flächenwerte von Pixeln in Quadratmikrometer umgerechnet werden.

Jeder Zeitverlauf wird dann in eine separate Textdatei exportiert. Um diesen Vorgang zu starten, schließen Sie die Kammer an das Perfusionssystem und die Pumpe an und schalten Sie den Düsenfluss für eine konstante Perfusionsrate von einem Milliliter pro Minute ein, und nehmen Sie ein 62. Video mit einer Rate von einem Hertz auf. Starten Sie die Aufzeichnung mit 15 Sekunden Indikatorwürfel und wechseln Sie dann zur hypertonen Lösung. Stoppen Sie die Aufzeichnung für 45 Sekunden.

Bündig mit dem Indikator. Stirbt erneut für mindestens 30 Sekunden. Bevor Sie einen neuen Film starten, nehmen Sie fünf bis sechs Filme auf und speichern Sie sie, um die Filme zu analysieren.

Um einen durchschnittlichen Zeitverlauf des sich ändernden Transmissionsgrades des Indikators zu erhalten, starten Sie das Bild J und klicken Sie auf die Datei. Öffnen Sie dann den Film, und suchen Sie nach ihm. Zeichnen Sie für jeden Film ein 10 Pixel breites vertikales Rechteck an einer beliebigen Stelle auf dem ersten Bild des Films, klicken Sie auf das Bild im Hauptfenster von Image J.

Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Zuschneiden. Um die 60 Frames in einer Reihe auszurichten, klicken Sie auf Bild und dann nacheinander in die Dropdown-Menüs, während sie Stapel entfalten und montieren. Zeichnen Sie ein ein Pixel hohes horizontales Rechteck an einer beliebigen Stelle entlang der gesamten Bildreihe und klicken Sie im Hauptfenster von Bild J auf Analysieren.

Klicken Sie anschließend auf Profil plotten. Kopieren Sie im Dropdown-Menü die Listen der Übertragungsdaten in eine Excel-Datei. Durchschnittlich sind die Transmissionszeitverläufe, die aus den Sero-Filmen der Indikator-Die-Flushes erhalten wurden.

Generieren Sie eine Echtzeitbasis, indem Sie die fortlaufende Bildnummer mit 0,1 multiplizieren. Speichern Sie den durchschnittlichen Zeitverlauf in einer Textdatei, um die verschiedenen Parameter des Osmolaritätszeitverlaufs zu berechnen. Verwenden Sie das MATLAB-Anpassungsprogramm PF fit, das zur Verwendung zur Verfügung steht.

Kostenlos. Details zum Herunterladen und Verwenden dieses Programms finden Sie im Protokolltext. Im Bereich für die Anpassung des Indikators.

Importieren Sie die Daten des mittleren Zeitverlaufs des Farbstoffdurchlässigkeitsindikators. Geben Sie die aktuellen Experimentparameter manuell ein, die anfänglichen Schätzungen der Parameter mit Ameise H.Die Beschreibung des Zeitverlaufs der Farbstoffkonzentration des Indikators kann ebenfalls geändert werden. Klicken Sie auf Ausführen, um das Diagramm der Zeitverläufe des Indikators DAI-Konzentration und der modellierten Badosmolarität anzuzeigen.

Eine gute Anpassung an die Daten ist für die Bestimmung des Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten unerlässlich. Wechseln Sie zum Bereich Volumenanpassung. Wählen Sie für den Import die Datendatei des Bereichs aus.

Wählen Sie als Parameterquelle die letzte Indikatoranpassung aus. Wählen Sie die Modellklasse aus. Beginnen Sie mit zwei.

Die PF-Parameter pf slow PF und delay müssen z.B. wie gezeigt initialisiert werden, es sind aber auch andere Werte möglich. Markierungsprüfungen für alle drei Parameter, die angepasst werden sollen. Klicken Sie auf Ausführen.

Schauen Sie sich dann die Zwischenzahl an und passen Sie bei Bedarf den Delay-Parameter und die Länge der Aufnahme an. Untersuchen Sie das Ergebnisdiagramm, um die Anpassung und Qualität zu bewerten und den Anpassungsfehler aufzuzeichnen. Ändern Sie die Initialisierungsparameter jeweils um ein Vielfaches und führen Sie den Vorgang erneut aus.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, beginnend mit verschiedenen Kombinationen von Initialisierungsparametern, mit dem Ziel, den niedrigsten Wert des Anpassungsfehlers zu ermitteln, um den Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten oder pf zu bestimmen, und vergleichen Sie die Aktivität verschiedener Aquaporine Mesil Protoplasten aus einem Kaninchen-Opsys-Blatt wurden isoliert und separat mit drei Genkonstrukten mit Aquaporin-Genen von einem Kaninchen transformiert, Opsys und Labyrinth. Die Protoplasten wurden durch Co-Ran mit einem Vektor markiert, der für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein kodiert. Die Zeitverläufe der Zellvolumenänderungen bei Exposition gegenüber hypotoner Provokation wurden für jede Zelle sowie der zeitliche Verlauf der Badosmolaritätsänderung während der hypotonen Provokation ermittelt, die PF-Werte wurden für jede Zelle abgeleitet.

Unter Verwendung des PF FIT-Programms wurde beobachtet, dass die PF-Werte der PROTOPLASTEN, die mit jedem der drei Aquaporine transformiert wurden, signifikant höher waren als die PF der Kontrollzelle, die nur mit GFP transformiert wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik die Analyse von einigen Dutzend Zellen in wenigen experimentellen Tagen liefern, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die SMO-Wasserdurchlässigkeit in isolierten Protoplasten oder anderen fokalen Zellen bestimmt werden kann, die einem hypotonen Assay unterzogen werden.

Bei offenen Fragen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung.