Nicht-invasive Beurteilung der Herzfehlbildungen in experimentellen autoimmunen Myokarditis von Magnetic Resonance Imaging Microscopy in der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kardiale Funktionsstörungen durch bildgebende Untersuchung der Herzen lebender Tiere mit entzündlicher Herzerkrankung zu ermitteln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Erkrankung, beispielsweise eine Myokarditis, ausgelöst wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Tier auf die Magnetresonanzmikroskopie vorzubereiten und es in der Tierhalterung zu platzieren.

Anschließend wird die Maus in das Magnetfeld gebracht, um die kardialen Bilder zu erfassen. Der letzte Schritt besteht in der Analyse der kardialen Funktionsparameter mithilfe der Segment-Software. Letztendlich dient diese Technik der Berechnung des enddiastolischen Volumens und der Ejektionsfraktion bei Mäusen mit autoimmuner Myokarditis.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Histopathologie liegt darin, dass sie nicht invasiv ist und eine dreidimensionale, hochauflösende Ansicht des Herzens ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Kardiologie im Zusammenhang mit der Diagnose entzündlicher Herzerkrankungen zu beantworten. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ihnen die Erfahrung mit der Vorbereitung von Tieren für die Gewinnung von Magnetresonanz-Mikrobildern fehlt.

Daher ist die visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend. Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie zunächst eine Peptidlösung zur Induktion einer autoimmunen Myokarditis herstellen: Lösen Sie das Peptid der schweren Kette des kardialen Myosins, Alpha 334 bis 352, in phosphatgepufferter Salzlösung, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro 1,5 Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie anschließend das Pertussis-Toxin vor, indem Sie ein Milliliter sterile, einfache phosphatgepufferte Salzlösung zu einem Gefäß mit 50 Mikrogramm lyophilisiertem Pertussis-Toxin hinzufügen.

Um eine Stammlösungskonzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten. Danach 20 Mikroliter der Stammlösung in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und 980 Mikroliter sterilem 1×-phosphatgepuffertem Kochsalzlösung hinzufügen, um eine Arbeitskonzentration von 1 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten. Außerdem vollständigen Freund-Adjuvans oder CFA herstellen, indem 40 Milligramm Mycobacterium-tuberculosis-H37RV- oder MTB-Extrakt zu 10 Milliliter CFA hinzugefügt werden, um eine Endkonzentration von 5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Bereiten Sie nun die Peptid-CFA-Emulsion vor. Um 1,5 Milliliter Emulsionsaliquot herzustellen, pipettieren Sie 750 Mikroliter der Peptidlösung aus dem schweren kettenförmigen alpha-Peptid 334 bis 352 des Herzmuskels in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und aliquotieren Sie ein gleiches Volumen CFA, angereichert mit MTB-Extrakt, in ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen. Ziehen Sie anschließend mit einer 3-Milliliter-Luer-Lock-Spritze zuerst die Peptidlösung und danach den CFA-MTB-Extrakt auf. Befestigen Sie die Spritze an einem Dreifach-Stoppcock und verbinden Sie den anderen Ausgang des Stoppcocks mit einer leeren 3-Milliliter-Spritze.

Stellen Sie den Durchlass des Stopcocks so ein, dass die Peptid-CFA-Mischung mit angemessenem Widerstand von einer Spritze in die andere fließt. Mischen Sie, indem Sie den Inhalt etwa eine Minute lang wiederholt von einer Spritze in die andere drücken, und stellen Sie danach die gesamte Apparatur etwa drei Minuten lang auf Eis.

Wiederholen Sie dieses Verfahren mindestens 10-mal. Bestimmen Sie die Konsistenz der Emulsion, indem Sie einen winzigen Tropfen vorsichtig auf stehendes Wasser in einem 100-Milliliter-Glaskolben geben. Der Tropfen sollte sich im Wasser nicht ausbreiten; falls doch, setzen Sie die Vermischung fort, bis die gewünschte Konsistenz erreicht ist.

Überführen Sie den Inhalt der Emulsion aus drei-Milliliter-Spritzen in eine Ein-Milliliter-Spritze. Ziehen Sie dazu eine der beiden an dem Stopfkran angebrachten drei-Milliliter-Spritzen ab und ersetzen Sie sie durch die Ein-Milliliter-Spritze. Anschließend wird eine Nadel mit 27,5 Gauge angebracht.

Injizieren Sie 150 Mikroliter der Peptid-CFA-Emulsion in aufgeteilten Dosen subkutan in die beiden inguinalen Regionen von sechs bis acht Wochen alten weiblichen aj-Mäusen. Verabreichen Sie dann am Tag null und am Tag zwei nach der Immunisierung jeweils 100 Mikroliter Pertussis-Toxin-Suspension intraperitoneal an jedes Tier. Wiederholen Sie das Immunisierungsverfahren am Tag sieben, indem Sie 150 Mikroliter der Peptid-CFA-Emulsion in aufgeteilten Dosen subkutan auf beiden Seiten des Brustbeins verabreichen.

Bereiten Sie diese Emulsion frisch wie beschrieben zu. Dann unterziehen Sie die Tiere am Tag 21 der MRT-Bildgebung, um die Bildgebung vorzubereiten. Stellen Sie zunächst jede Maus in eine Narkoseinduktionskammer, die eine 2%ige ISO-Fluorin-Luftmischung enthält, und verwenden Sie eine Heizplatte, um die Wärme aufrechtzuerhalten.

Überführen Sie das Tier dann in einen speziell konzipierten Tierhalter. Sichern Sie den Kopf mit einer Beißeinrichtung, um das Tier in Bauchlage zu fixieren. Die Schnauze sollte in den Nasenkegel passen, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.

Schalten Sie die Luftgebläsheizung ein, wobei der Auslassschlauch in die vertikale Bohrung des Scanners eingeführt wird, um die Körpertemperatur des Tieres während des Experiments aufrechtzuerhalten. Halten Sie die Anästhesie während der gesamten Bildgebungssitzung mit einem Isoflurananteil von 1 bis 2 % und einer Flussrate von zwei Millilitern pro Minute aufrecht. Überprüfen Sie die Anästhesie durch einen Zehenquetschtest.

Als Nächstes richten Sie einen pneumatischen Polstersensor und eine rektale Temperatursonde ein, um die Atmung und Körpertemperatur während der gesamten Bildgebungssitzung zu überwachen. Ein faseroptischer Pulsoximetriesensor sollte außerdem am linken Knöchel angebracht werden, und der Fuß sollte mit einer Fadenchiffre fixiert und mit Klebeband gesichert werden, um die Position beizubehalten. Die Bildgebung wird durch Gating der Atem- und Herzsignale ohne Verwendung von Kontrastmitteln erreicht.

Ein Magnet mit großem Durchmesser und einer Feldstärke von 9,4 Tesla im vertikalen Bohrloch sollte verwendet werden, um hochauflösende dreidimensionale Bilder der Magnetresonanzmikroskopie zu erhalten. Nach der Vorbereitung des Versuchstiers wird die Maus in den Scanner platziert, wobei das Herz in der Mitte des Bildfeldes positioniert sein sollte. Anschließend wird die Bildgebungssoftware gestartet, im Befehlsfeld der neue Untersuchungstyp mune ausgewählt, die Abstimmungsseite aufgerufen und danach die Optionen Startsonde, Abstimmen und automatische Skalierung ausgewählt.

Verwenden Sie die Fernabstimmknöpfe am Ende der Spule, um die HF-Spule auf die Protonenresonanzfrequenz von 400 Megahertz abzustimmen. Gehen Sie anschließend zur Vorscan-Seite. Um die Frequenz- und Leistungsabgleichung durchzuführen, drücken Sie die x, Y, Z-Schnelltaste, um die Abstimmseite aufzurufen.

Danach alle Iterationen auswählen und eine automatische Abstimmung durchführen. Eine Scout-Sequenz auswählen. Das Sichtfeld auf 35 Millimeter ändern.

Belassen Sie die anderen Standardeinstellungen und führen Sie die Sequenz aus. Falls sich das Herz nicht in der Mitte des Sichtfeldes befindet, passen Sie die Position des Tierhalters an, stellen Sie die HF-Spule erneut ab und nehmen Sie den Scout erneut auf. Wählen Sie anschließend die GEM-Sequenz aus.

Geben Sie die hier gezeigten Erfassungsparameter im Register „Acquire“ ein, um zwei orthogonale Ebenen entlang der kurzen und langen Achse des Herzens zu erhalten. Wählen Sie anschließend die Cine-Sequenz aus, um die Cine-Bilder der kurzen Achse mittels Pulsoximetrie-Messung zu erfassen und die linksventrikulären, anatomischen und funktionellen Parameter zu bestimmen. Geben Sie die hier dargestellten Parameter ein, um die Gradientenecho-Cine-Sequenz zu erhalten.

Passt die Position und den Winkel der Bildgebungsschnitte basierend auf der Langachsenansicht des Herzens an. Führt dann die Sequenz aus. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist.

Konvertieren Sie die gewonnenen Bilder mithilfe des IO-Tabs in das DICOM-Format und übertragen Sie die entsprechenden Dateien zur Verarbeitung an das Datenzentrum. Am Ende des Bildgebungsverfahrens ermöglichen Sie dem Tier, sich unter einem Filterdeckel aus der Narkose zu erholen. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie ausreichend bei Bewusstsein ist, um die Brustlage aufrechtzuerhalten.

Hier wird Segment-Software verwendet, um die anatomischen und funktionellen Parameter des linken Ventrikels zu analysieren. Beginnen Sie damit, die DICOM-formatierten Cine-Bilder in die Software zu laden. Wählen Sie dann MRGE als Bildgebungsverfahren, Cine als Bildtyp und kurze Achse mittlere Ventrikelregion aus.

Legen Sie als Bildebene die Zeitpunkte für das Ende der Diastole und das Ende der Systole fest, indem Sie jeweils die Untermenüs „aktuellen Zeitpunkt auf Ende der Diastole setzen“ und „aktuellen Zeitpunkt auf Ende der Systole setzen“ im Bearbeiten-Menü verwenden. Verwenden Sie anschließend die LV- sowie die endo- und EPI-Befehlsschaltflächen im unteren rechten Bereich. Um den linken Ventrikel, das Endokard und das Epikard manuell zu zeichnen, entfernen Sie die Papillarmuskeln, indem Sie die entsprechende Befehlsschaltfläche betätigen.

Um die Genauigkeit der Berechnungen zu erhöhen, lesen Sie die quantifizierten Parameter des linken Ventrikels, wie diastolisches Volumen, systolisches Volumen, Schlagvolumen und Ejektionsfraktion, im oberen rechten Bereich ab. Verwenden Sie anschließend die Schaltfläche „mis“ und danach die Schaltfläche „measurement caliper“, um linke Ventrikelparameter wie Wanddicke und Ventrikeldurchmesser zu messen. Schließlich sollten Sie unbedingt die Option „save both image stacks and segmentation“ verwenden, um die Bilder einschließlich der Segmentierungen im .mat-Format zu speichern, sodass die Bilder bei Bedarf erneut verarbeitet werden können.

Der Winkel, in dem das Herz für die Aufnahme der Zwei-Kammer-Ansicht geschnitten wurde, ist hier zu sehen. Hier sehen wir eine ungefähre 1,5-fache Zunahme der Dicke des linken Ventrikels, was auf strukturelle Defekte in den Herzen von Mäusen mit experimentell induzierter autoimmuner Myokarditis im Vergleich zu gesunden Mäusen hinweist. Die auf der Grundlage des linksventrikulären diastolischen Volumens und der Ejektionsfraktion berechnete Herzleistung war bei Mäusen mit autoimmuner Myokarditis im Vergleich zu gesunden Mäusen vermindert.

Schließlich wurden die Herzen der oben genannten Behandlungsgruppen hinsichtlich einer Entzündung durch eine histologische Bewertung mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung untersucht. Bei myokarditischen, jedoch nicht bei gesunden Mäusen zeigten sich multifokale lymphozytäre Infiltrate. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die Körpertemperatur des Tieres konstant bleibt, damit die Herzfrequenz und Atemfrequenz während der Experimente nicht signifikant verändert werden. Dies ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der magnetresonanzmikroskopischen Technik zur Beurteilung funktioneller Störungen entzündlicher Herzerkrankungen wie Myokarditis und Mäuse haben. Vergessen Sie jedoch nicht, dass das Arbeiten mit hohen Magnetfeldern äußerst gefährlich sein kann, weshalb der Tierhalter und andere Komponenten nichtmagnetisch sein sollten.