Name: Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Quantifizierung von Eierstockkrebs-Invasion in Mesothelzellen mittels RTCA-Analyzer. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Messungen der dynamischen Metastasierung über längere Zeiträume.

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Diese Arbeit wurde durch eine CASS Stiftung Wissenschaft und Medizin Zuschuss unterstützt; (MB); a National Health &amp; Medical Research Council of Australia Projekt Grant (KLS, 338516); und von der Regierung von Victoria Operational Infrastructure Support Program (Australien).

1. Vorbereitung der Zellen, Medien und Reagenzien <ol><li> Herstellung von Methylcellulose-Medium, enthaltend <ol><li> Man löst 1,5 g Methylcellulose in 100 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (ohne Zusätze) in einem 250 ml-Kolben. </li><li> Die Lösung wird auf Low in einer Mikrowelle für 5 min; kümmern sich um Überkochen zu vermeiden. </li><li> Sobald der Methylcellulose-Pulver ist halb gelöst, fügen Sie ein sauberes Magnetrührer und Medien, um das Volumen auf 125 ml zu nehmen. </li><li> Mischen, Invertzucker, und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden, gefolgt von Rühren bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in vier 50 ml Zentrifugenröhrchen und für 1,5 Stunden bei 2300 x g. </li><li> Sammeln Sie die klare, hochviskose Überstand (ca. 90-95% der Aktien), aliquoten in sterile 50-ml-Röhrchen, und bei 4 ° C bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Kultur und Markierung von Zellen <ol><li> Pflegen Eierstock-Krebszelllinien in Monolayer in einem tiUSGABE Kulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM KGN für die Zellen 17 und MCBD110: M199 für die OVCA429 und OVCA433 Zellinien 18) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L ergänzt -Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Aufrechterhaltung LP9 menschlichen Mesothelzellen in M199: Hams F12-Medium, enthaltend 15% FBS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 400 ng / ml Hydrocortison, in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Seed-Zellen in der gewünschten Größe und Kolben wachsen, um etwa 75% Konfluenz. Ernten der Zellen durch Trypsinierung mit 0,05% Trypsin / EDTA, Schleudern bei 186 × g für 5 min, und waschen Zellpellet zweimal mit PBS. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li></ol></li><li> Optional Fluorescent Zellmarkierungsmethode <ol><li> Resuspendieren Krebszellen in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in 1 ml vorgewärmtem PBS/0.1% BSA. </li><li> In 2 ul 5 mM Stammzell Trace CSFE Lösung (oder einer anderen Markierung, die bevorzugte Zelle langfristig beibehalten wird), um Zellen in einer Endkonzentration von 10 uM und bei 37 ° C für 10-15 min in einem Wasserbad. </li><li> Die Reaktion wird mit 1 ml eiskaltem Medium mit 10% FBS und Wieder Pellet durch Zentrifugation. Resuspendieren in 10 ml des entsprechenden vorgewärmten Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.1). </li><li> Samenzellen in einem 75 cm 2 Filter verschlossenen Kolben und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Check-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Niveau der Fluoreszenz-Markierung zum Nachweis ausreichender ist. Sobald Zellen erreichen ca. 75% Konfluenz, Ernte und zählen wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 oben. </li></ol></li></ol> 2. Generation Spheroids in Methylcellulose <ol><li> Berechnen Sie das Volumen von Eierstockkrebszellen aus Abschnitt 1 für Sphäroid Generation benötigt (insgesamt 300.000 Zellen werden für jedes volle 96-Well-Platte Experiment erforderlich). Nichtte: Wenn mit verschiedenen Zelllinien als hier dargestellt, können die Zelldichten für einheitliche Sphäroid Generation brauchen, um für jede Zeile optimiert werden. </li><li> Zur Verdünnung der Zellen in Methylcellulose Medien zu berechnen, zunächst subtrahieren Sie den Zellvolumen erforderlich ist (Schritt 2.1) von 15 ml. </li><li> 3 ml Methylcellulose-Stammlösung (um 20% Methylcellulose endgültig) auf ein Volumen von geeigneten Kulturmedium für jede Zelllinie in Höhe von 15 ml minus des Zellvolumens und gründlich durch vorsichtiges Umdrehen mischen. </li><li> In 300.000 Zellen auf die Methylcellulose enthaltenden Medium und gründlich durch vorsichtiges Schwenken gemischt. </li><li> Pipette 150 ul der Zell / Methylcellulose / Media-Mix (für insgesamt 3000 Zellen / Vertiefung) in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit konkaven und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1-4 Tage oder bis eine einheitliche Sphäroiden bilden (1 Sphäroid / Vertiefung ist in der Regel beobachtet). </li></ol> 3. RTCA Zellinvasion Assays NOTE: Impedanzmessungen werden als Zellindex (CI), eine dimensionslose Kennzahl, die eine relative Änderung der gemessenen Zellenimpedanz, die die Zellstatus ausgedrückt. Für die Analyse, Import von Daten in einer Tabellenkalkulation wie Microsoft Excel. <ol><li> Plattenvorbereitung <ol><li> Arbeiten in Gruppen von 4 Vertiefungen in einer Zeit, 50 &amp;mgr; l Matrix (1:10 verdünnt in Serum-freien Kulturmedien) in jede Vertiefung der oberen Kammer einer 16-Well-Platte RTCA CIM, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist . Entfernen Sie 30 ul Matrix sofort, aber langsam, zu jeder überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für 4 Stunden vor der Verwendung in einem Gewebekultur-Inkubator verwendet. </li><li> Hinzufügen von 30 &amp;mgr; l serumfreiem Medium (SFM) für jeden Krebszelllinie mit der oberen Kammer und 160 ul Medium mit oder ohne Serum (nach Ihrer experimentelles Design) in die untere Kammer geeignet. </li><li> Montieren Sie den CIM-Platte, indem Sie auf die untere Kammer in die obere Kammer und equilibraß in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde in einem Gewebekultur-Inkubator. </li></ol></li><li> Programmierung der RTCA Instrument <ol><li> Öffnen Sie das RTCA-Programm und wählen Sie die Registerkarte &quot;Layout&quot;. Markieren Sie alle Versuchsbrunnen. </li><li> Klicken Sie rechts auf Brunnen und wählen Sie &quot;Schalten Sie Brunnen &#39;; dann in Versuchsbedingungen und Zellennamen füllen, wie gewünscht. </li><li> Um Schritte oder Teilschritte in das Programm, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte, und klicken Sie rechts auf &quot;Add a step &#39;. Der erste Schritt ist eine vorprogrammierte Hintergrund Sweep, die automatisch in das Programm aufgenommen wird einmal &quot;fügen Sie einen Schritt&quot; gewählt wird. </li><li> Geben Sie die gewünschten Programmdetails für Schritt 2 des RTCA-Programm, das bei der Gründung der LP9 Monowerte aufzeichnet. In die Zeitintervalle zwischen Impedanzmessungen indem Sie die Registerkarte &quot;Interval&quot; und Eingabe von &#39;15 min &#39;. In Versuchsdauer durch Auswahl der &#39;Dauer&#39; Register eind Eingabe einer Zeit zwischen 24.12 h. </li><li> Um weitere Schritte hinzufügen, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte und klicken Sie rechts auf &quot;Hinzufügen einen Schritt &#39;und geben Details der weiteren Schritte, wie oben. Schritt 3 des RTCA-Programm wird das Instrument zu Lesungen während der Sphäroid-Invasion nehmen zu leiten; Geben &#39;5 Minuten &#39;unter dem&#39; Intervall &#39;Registerkarte und &#39;48 Stunden&#39; auf der Registerkarte &#39;Dauer&#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;Teller&#39; in der Menüleiste und sparen. </li></ol></li><li> Generierung von LP9 Monolayer und Messung der Sphäroid-Invasion <ol><li> Zeigen CIM Platte in RTCA Instrument und offenes Programm aus Schritt 3.2. Vor der Zugabe Zellen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; in der Menüleiste und dann &quot;Start&quot;. Ein Hintergrund-Sweep wird automatisch durchgeführt werden (Schritt 1 in den RTCA Software-Anweisungen). </li><li> Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät nach dem Sweep Hintergrund und in einer Gewebekultur Kapuze. </li><li> Teller 50,000 LP9 Zellen in 160 ul SFM in die obere Kammer jedes CIM Platte gut suspendiert. </li><li> Die Platte wird in der RTCA Instrument und nehmen Messwerte alle 15 Minuten während der LP9 Monolage wird über Nacht Gründung (Schritt 2 des RTCA-Programm). </li><li> Ernte Krebs Sphäroiden unter Schritt 2 &quot;Generation von Sphäroiden in Methylcellulose &#39;erzeugt, vor. <ol><li> Aseptisch, schneiden 1 mm aus der Spitze von einer 1 ml-Pipettenspitze und verwenden, um sanft und rufen Sie die Inhalte von jedem. Transfer zu einem sterilen Röhrchen. </li><li> Centrifuge Sphäroide bei 120 g für 8 min, und entfernen Methylcellulose enthaltenden Medium durch leichtes Ansaugen. </li><li> Zweimal mit PBS waschen Sphäroiden, Zentrifugieren bei 120 g für 8 min zu pelletieren Sphäroiden nach jeder Wäsche. </li><li> Für jede Versuchs gut resuspendieren insgesamt 10 Kügelchen in 160 ul Medium ohne FBS. </li><li> Pause das RTCA Experiment durch Auswahl und Kontrolle und &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste# 8216; Pause. Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät, und legen in einer Gewebekultur Kapuze. Absaugen der Medien aus jeder Vertiefung und ersetzen Sphäroid haltigen Medien (10 Kugeln in 160 ul) oder frische Medien für LP9 nur Kontrollvertiefungen. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Platte an der RTCA Instrument. Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen &quot;Schritt abbrechen&quot;. Das Programm wird mit dem nächsten Schritt automatisch zu bewegen. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen Sie &#39;Start / Weiter &quot;. Schritt 3 in der RTCA Programm zu initiieren. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Um das Niveau der Sphäroid Zelle Invasivität bestimmen, subtrahieren, die für die LP9 Monoschicht nur aus den für die Eierstockkrebszelllinien zu jedem Zeitpunkt erhalten, einzelne Messwerte erhalten wurden. </li><li> Um &#39;Sphäroid-Invasion &quot;des Grundstückes, zu normalisieren alle Werte auf den Zeitpunkt, zu dem die Sphäroide wurden zu der Platte gegeben, mit setting diesem Zeitpunkt auf &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Open-Access-Gebühr wird von ACEA Biosciences, Inc. und dem MIMR-PHI Institute of Medical Research bezahlt.

Invasion der Eierstockkrebszellen interagieren mit einer Vielzahl von Zelltypen an der Oberfläche des Bauchfells, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten und Mesothelzellen und bidirektionale Kommunikation zwischen den Krebszellen und Peritonealzellen wird gedacht, um eine Schlüsselrolle bei der Vertreibung der metastatischen Prozess 2 zu spielen. Sobald sie beherrscht, ist die hier beschriebene Protokoll leicht an der Untersuchung dieser Wechselwirkungen innerhalb der Bauchmikroumgebung, z. B. durch die Zugabe von exogenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren auf die oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut oder Genmanipulation der Krebs oder peritonealen Zelllinien. Darüber hinaus kann diese Methode mit primären Eierstocktumorzellen frisch aus malignem Aszites und / oder primäre Bauch Zellen geerntet, direkte Einblicke in die Regulationssignale und zelluläre Wechselwirkungen, die die Einrichtung einer metastatischen Läsion in der Bauchhöhle regieren zu gewinnen verwendet werden <sbis&gt; 2. Die Nutzung der RTCA Instrument, um die invasive Kapazität der einzelnen Zellen oder Kügelchen messen bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzel Endpunkt-Assays und Bild Zeitraffer-Analysen. Der RTCA Gerät misst Zellinvasion in definierten Abständen kontinuierlich innerhalb eines Assays, die Stunden oder Tage sein kann. Dies ermöglicht die Bestimmung von Änderungen in der Geschwindigkeit der Invasion im Laufe der Zeit, die die Grenzen der einzelnen Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise die Prüfung der Invasion von Daten aus den verschiedenen Krebszelllinien in einem einzigen Endpunkt (Fig. 2), z. B. 3 Stunden, möglicherweise fehlerhaften Ergebnis, dass KGN und OVCA433 Zellen waren viel invasiv als OVCA429 Zellen geführt. Ein weiterer Vorteil dieser Technologie ist, dass die RTCA Gerät misst Änderungen in der elektrischen Impedanz. Dies bedeutet, dass Tests können ohne Markierung von Zellen mit einer exogenen Mittel, die unbeabsichtigten Auswirkungen auf die Zell phen haben könnte ausgeführt werdenOTYPE oder Funktion. Dies wird besonders wichtig, wenn das Studium primären Eierstockkrebszellen von malignem Aszites, mit dem es zwingend notwendig, um Manipulationen auf ein Minimum zu halten, um zu vermeiden, um die Einführung der molekularen und phänotypischen Veränderungen, die nicht repräsentativ für ihre in vivo Natur 2 abgeleitet. Außerdem Nutzung des RTCA Instrument ermöglicht die Erfassung von quantitativen Daten in Echtzeit, die nicht nur vermeidet die zeitaufwendige Analysen mit Zeitraffer-Mikroskopie verbunden, sondern ermöglicht auch die schnelle Bestimmung von Schlüssel experimentelle Fenster für die Assay-Optimierung. Dies ist besonders nützlich, wenn man die Wirkungen einer Reihe von Faktoren auf Sphäroid Invasion, als unterschiedliche Faktoren ihre maximale Wirkung zu verschiedenen Zeitpunkten oder mit sehr unterschiedlichen Profilen über die Zeit zu nehmen. Obwohl dieses Protokoll zugänglich Veränderungen (z. B. Verwendung von verschiedenen ECM-Matrix, verschiedenen Krebszelllinien oder andere Ziel celLS), wenn dies so ist, ist es wichtig zu beachten, dass verschiedene Versuchsbedingungen zunächst optimiert werden. Beispielsweise vor Beginn der Studien der Sphäroid-Invasion, die optimale Anzahl von Krebszellen / CIM Platte sollte auch zunächst durch Assay der Zellzahl Titrationen in Monolayer-Kultur bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Sphäroiden pro gut gebrauchen wird dann auf dieser Analyse. Beispielsweise in der aktuellen Methode, Sphäroide enthalten etwa 3.000 Zellen jeweils als erstes erzeugt. Wenn Anfangszellzahl Titrationen zeigen, dass 30.000 Zellen in Monolayer sind optimal für die Detektion in Invasion analysiert, dann 10 Sphäroide pro CIM Platte hinzugefügt. Wenn ferner die Durchführung Co-Kultur-Experimente ist es wichtig, das Verhalten der &quot;Ziel&quot;-Zellmonoschicht getrennt, um zu bestimmen, ob diese Zellen sind von Natur aus invasiv, da dies die Ergebnisse verwechseln studieren. In dem Beispiel gezeigt werden Krebs Sphäroide auf der Oberseite eines Zell LP9 Monola plattiertyer, mit und ohne FBS an der Unterseite hinzugefügt sowie ein chemoattractant. Parallel werden LP9 Zellen allein unter jedem Behandlungszustand kultiviert. Ebenso, wenn die Untersuchung der Invasionskapazität von Zellen und Sphäroiden, ist es auch wichtig, ihre Migrations Kapazitäten, um die beiden Verhaltensweisen (dh Invasion erfordert den proteolytischen Abbau eines ECM-Barriere während der Migration nicht) unterscheiden zu untersuchen als auch. Um dies zu tun, lassen Sie den ECM-Schranke (Schritte 3.1.1 - 3.1.3) und führen den Test parallel mit der ECM-Barriere im Ort. Letztere &quot;Invasion&quot; Maßnahme kann auf der ehemaligen &quot;Migration&quot; Maß korrigiert werden, falls gewünscht. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Informationen aus Maßnahmen der elektrischen Impedanz gewonnen begrenzten: einmal Zellen in der unteren Kammer eingedrungen, können Veränderungen in ihrer Befestigung, Verbreitung, und Proliferation auf der Unterseite der Membran auf Veränderungen beitragen Impedanz reaDellen. Daher ist diese Methode sehr informativ, wenn sie in Verbindung mit anderen Tests der Sphäroid Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Migration und Morphologie, um umfassend zu beurteilen Sphäroid Zellverhalten verwendet. Zum Beispiel ideal, um die Sphäroid-mesothelial Wechselwirkungen zu verstehen, separaten Co-Kulturen sollte auch in regelmäßigen Abständen unter Standard-Phasenmikroskopie abgebildet werden, so dass qualitative Beurteilungen der Sphäroid Morphologie und Gesundheit können parallel mit quantitativen Assays RTCA der Invasion gemacht werden. Wenn das optionale Markierungsschritt durchgeführt wird, dann werden die Verhaltensweisen der einzelnen Krebszellen unter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, da sie von der Sphäroid zerlegen und interagieren mit den unmarkierten Mesothelzellen. Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenzmarkierung, die Krebszellen bei Co-Kultivierung mit einem zweiten Zelltyp ist, dass es dann möglich, zu bestätigen, dass nur die Krebszellen durch die Zelle und ECM Barrieren fallen. <p class="jove_content"&gt; Zusammenfassend stellt diese Methode einen hohen Durchsatz quantitative Analyse von Eierstockkrebs Sphäroid Invasion der Mesothelzellen und ECM-Barrieren. Durch die Zugabe von exogenen Zytokinen, Wachstumsfaktoren, oder spezifische Inhibitoren zu den oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrixbarrieren über Regulierung Zeit.

Eierstockkrebs hat die höchste Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Krebserkrankungen ein. Weltweit gibt es ~ 230.000 Fälle und mehr als 100.000 Todesfälle durch die Krankheit jedes Jahr ein. Die meisten Patienten (&gt; 75%) werden diagnostiziert, nachdem der Krebs bereits Metastasen gebildet hat, wenn die Behandlung durch erhöhte Resistenz gegen Chemotherapie kompliziert und die Prognose ist schlecht 2. Patienten mit Stadium III-IV Metastasen haben 5 Jahres-Überlebensraten von nur 30-40% 3. Somit besteht ein dringender Bedarf für ein besseres Verständnis der zellulären Verhaltensweisen, um effektiv zu behandeln fortgeschrittener Erkrankung zugrunde liegenden Eierstockkrebsmetastasen. Das aktuelle Modell von Eierstock-Krebs Metastasen schlägt mehrere Schritte in der metastatischen Prozess, von denen jeder tritt in einer ausgeprägten Mikro welche Auswirkungen auf Tumorverhalten. Metastasierenden Eierstockkrebszellen zunächst aus dem Primärtumors zu vergießen und zu überleben in einer nonadherent Zustand innerhalb der Peritonealflüssigkeit als einzelne Zellen oder dreidimensionale Strukturen vielzelligen, genannt vielzelligen Aggregaten oder Sphäroiden 2,4,5. Zellen, die in Suspension nicht Sphäroide bilden, sind anfälliger für anoikis 2,4,5. Sphäroide auch eine erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika, Beitrag zur Resterkrankung und nachfolgende Wiederauftreten des Krebses 2,4,5. Ein zweiter kritischer Schritt bei Eierstockkrebsmetastasen ist der Übergang von Zuschlagstoffen aus frei schwebenden Cluster etabliert Sekundärtumoren in der Bauchwand und Netz 5,6. Zell-Zell-und Zell-Substrat-Wechselwirkungen in Aggregatbildung, das Überleben und die Einhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) von der Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells 4-11 hergestellten Verbindung gebracht. Bisher werden diese Prozesse kaum verstanden. Um die Mechanismen bei der Verbreitung von Eierstockkrebs beteiligt zu definieren, können Sphäroiden Gener seinte an etablierten Tumorzelllinien unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturmethoden, die Aufrechterhaltung Zellen in Suspension entweder durch Zugabe von Methylcellulose zu den Kulturmedien 12,13 oder durch Kultivieren von Zellen auf Low-Befestigungsplatten 2,14. Wenn auf diese Weise kultiviert, montieren Eierstockkrebszellen in multizellulären Aggregaten oder Kügelchen, die ähnlich zellulären, molekularen und biochemischen Eigenschaften denen von Tumor Aggregate in vivo 2,14 gefunden aufweisen. Nach der Bildung kann Sphäroide anschließend von dem nicht anhaftenden Medium geerntet und auf eine Vielzahl von festen Oberflächen für die weitere funktionelle Studien wieder ausplattiert werden. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber Assays in Monolayer-Kultur, die nicht genau zu modellieren sie das Verhalten der metastasierenden Eierstockkrebszellen in einem nicht-adhärenten Umgebung wie die intraperitoneale Flüssigkeit. Die invasive Kapazität von Krebs Sphäroiden in traditionellen Endpunkt-Assays in Boyden-Kammern 2 bewertet </sup&gt;, aber dieser Ansatz kann irreführend sein, da Eierstockkrebszellinvasion ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Eine aktuelle Echtzeit-Verfahren wurde mit Zeitraffer-Videomikroskopie von Mesothelzelle Freigabe durch eindringende Eierstockkrebs entwickelt Sphäroiden 15,16; jedoch ist die Analyse von Zeitreihen-Daten zeitaufwendig und kann subjektiv sein. Hierbei wird eine schnelle, quantitative Methode zur Bestimmung der invasiven Verhalten von Eierstockkrebs Sphäroide in Echtzeit beschrieben. Zunächst wurde ein Sphäroid-Mesothelzelle Modell eingesetzt, der die Bühne von Eierstockkrebsmetastasen stellt, wenn mehrzelligen Sphäroiden befestigen und dringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden. Dann Methodik für eine Echtzeit Zell Analyzer (RTCA, siehe Tabelle Materialien für Firmendaten) wurde angepasst, um quantitative Echtzeit-Messungen der Invasionskapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen und in diesem Modell getestet befragen. In der RTCA inInstrument, zelluläre Reaktionen werden kontinuierlich über den Verlauf eines Assays durch Messung von Veränderungen der elektrischen Impedanz überwacht wird, ohne die Notwendigkeit einer exogenen Etiketten. Speziell entwickelten Kulturplatten mit Gold beschichteten Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran an der Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Kammern eines Kammer 2 gut (&quot;CIM&quot;-Platten) liegt. Die Lage der Elektroden in der unteren Kammer ermöglicht die Messung von Veränderungen in der elektrischen Impedanz als Zellen eindringen oder durch eine ECM ECM / Zellbarriere. Die Membran-Grenzfläche zwischen den 2 Kammern jedes CIM Platte auch zunächst mit der ECM-Komponente von Interesse beschichtet. In der Sphäroid-Mesothelzelle Modellsystem wird die Schnittstelle mit einer Schicht aus Matrigel (siehe Tabelle Materialien für Firmendaten), um die komplexe ECM die Mesothelzellen Auskleidung der Bauchfell zugrunde liegenden imitieren, gefolgt von einem Monolayer der menschlichen Mesothelzellen &#39;beschichtet Ziel &quot;-Zellen. Schließlich sind die vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroiden Anzeigeded. Eierstockkrebs Sphäroid Zellen müssen aktiv durch die Zielzellen Schicht und Matrix eindringen, um die Bodenkammer zu erreichen und elektrische Impedanzmesswerte verändern. Zielzellen allein sind ebenfalls bewertet, um sicherzustellen, dass sie nicht durch die Matrixschicht eindringen und sich in diesem Assay geeignet.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analysator</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM Platten&nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose (4.000 Centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Mittel 199&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham's F-12 Nährstoffmischung</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Konkav-Kulturplatte&nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Menschliche mesotheliale Zelllinie</td><td>Coriell Institute for Medical Research&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Wachstumsfaktor-reduzierte Matrigel-Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>Artikel-Nr.: 354230</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung von eierstockkrebs sphäroid bindung und invasion von mesothelzellen in echtzeit

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Eierstockkrebs Metastasen durch den Abbau in die Bauchfellflüssigkeit und Dispergieren distalen Stellen innerhalb des Bauchfells. Monolayer-Kulturen nicht genau das Verhalten von Krebszellen zu modellieren innerhalb einer nichthaftende Umwelt, wie Krebszellen in sich zusammenfassen in multizellulären Strukturen, die auf den metastatischen Prozess, indem es an und Eindringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden beitragen. Um diese wichtige Phase von Eierstockkrebs Metastasen, vielzelligen Aggregaten, Sphäroiden oder modellieren, können von etablierten Eierstockkrebszelllinien unter Bedingungen gehalten, nicht anhaftende erzeugt werden. In die Bauchmikroumgebung von Tumorzellen in vivo angetroffen nachzuahmen, wurde ein Sphäroid-Mesothelzellen Co-Kulturmodell etabliert, in dem vorgeformten Kügelchen werden auf einem menschlichen Mesothelzellen Zellmonoschicht überzogen, auf einer extrazellulären Matrix Barriere gebildet. Methoden wurden dann mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysegerät, um quantitative real durchzuführen entwickeltZeitmessungen der invasiven Kapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die kontinuierliche Messung der Invasion über lange Zeiträume, die mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays und mühsamer Bild Echtzeit-Mikroskopie analysiert hat. Kurz gesagt, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrix-Barrieren im Laufe der Zeit zu regulieren.

Ovarialkarzinom Sphäroide können aus vielen Arten von Zelllinien durch Kultivieren derselben in Suspension oder durch Ernten primäre Tumorzellen von malignem Aszites 2,14 erzeugt werden. Hier zwei epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien, OVCA433 und OVCA429 und ein Eierstock-Granulosazelltumor Tumorlinie, KGN, wurden verwendet, um Sphäroiden (Abbildung 1A) zu generieren. Bei diesem Verfahren werden Zellen in U-förmigen Vertiefungen gezüchtet, während in Medien, die durch Zugabe von Methylcellulose viskos gemacht wurde, suspendiert. Unter diesen Bedingungen sind viele Eierstockkrebszellen weisen eine inhärente Fähigkeit zu aggregieren, um Sphäroide 13 zu bilden. Nach Übernacht-Kultur in Methylcellulose / Medium suspendiert, gebildet alle drei Zelllinien kompakten kugelförmigen Strukturen von ungefähr 400-500 &amp;mgr; m im Durchmesser (Fig. 1A). Währenddessen wird die RTCA CIM-Platte hergestellt, zunächst durch Beschichten des porösen Membranoberfläche mit Matrix und eine konfluente Monoschicht der menschlichen Melothelial Zellen (1B). Einmal gebildet, Sphäroide werden dann auf die vorbereitete CIM-Platte übertragen. Geerntet Krebs Sphäroide auf dem LP9 Monoschicht plattiert und bewertet, wie unten beschrieben. Bilder unter Standard-Phasenmikroskopie (oder unter Fluoreszenzmikroskopie, wenn die optionale Zellmarkierung Schritt folgte) von Parallelkulturen werden in regelmäßigen Abständen in der Interpretation der Daten RTCA (Abbildung 1C) Hilfe genommen. Es ist informativ, sowohl das Basisniveau der Invasion einer Krebszelllinie, sowie chemoattractant-induzierte Invasion zu beurteilen. Typischerweise wird die basale Invasivität durch Zugabe von SFM auf den oberen und unteren Kammern gemessen. Vollmedium (10% FBS), die vielen möglichen chemischen Lockstoffe enthält, wird in dem vorliegenden Beispiel verwendet werden, um &quot;Chemoattractant-induzierte Invasion (Fig. 2) zu prüfen. Parallelstudien von LP9 Mesothelzellen allein bestätigt, dass diese Zellen minimalinvasive über 2 Tage entweder unter basalen oder &quot;chemoattractant &#39;induzierten Bedingungen und damit waren eine gute Zelltyp in Co-Kultur-Assays mit Eierstockkrebszellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu zeigten Eierstock erzeugt unter Verwendung einer der drei Krebszelllinien Sphäroide in der Lage, zu einem Chemoattraktor (FBS) (Fig. 2A-2C) einzudringen. Der große Vorteil der Verwendung der RTCA Echtzeit gegenüber herkömmlichen Instrumenten Endpunkt-Assays ist, dass Veränderungen in der Zell / Sphäroid Verhalten kann über die Zeit quantifiziert werden. Mit dem 2-tägigen Versuches, die KGN, OVCA429 und OVCA433 Zellinien zeigten alle die Fähigkeit, zu einem Chemoattraktor (durch Erhöhung Zellindizes angegeben), aber niedrige basale Niveaus der Invasion (2C) einzudringen. Die Zelllinien zeigten ähnliche Raten von Invasion, wie die parallel Steigungen der Kurven (Abbildung 2C) angegeben; jedoch zeigte die Kurve OVCA429 eine höhere obere Asymptote,die eine höhere maximale Höhe der Invasion angegeben im Vergleich zu den anderen Zelllinien. Darüber hinaus zeigten die Zelllinien Unterschiede in ihrer Zeit zu Beginn der Invasion, wobei die KGN-Zellen schnell Invasion der Zell-und Matrixbarrieren und die OVCA433 und OVCA429 Zellen unter 3-5x mehr zu erobern, bzw. (2D). Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion war kein Anzeichen für ihre allgemeine Fähigkeit zur Invasion (2C und 2D). Dies legt nahe, verschiedene inhärente Funktionen der Krebszelllinien als auch anzeigen, dass verschiedene Faktoren frühen und späten invasive Verhalten von Sphäroiden zu regulieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1 Sphäroid-Generation und das Modell der experimentellen einen Satz:.. IMagier unter Phasenkontrastmikroskopie von Sphäroiden bilden in Methylcellulose / media (oben) und der passenden Zelllinie als Monoschicht (unten) gewachsen. B: Schematische Darstellung der RTCA 2 Kammern CIM Platte gut aufgestellt, in dem vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroide auf einer Monoschicht aus einem LP9 Mesothelzellen Schicht / Barrierematrix in der oberen Kammer und Medien ± FBS als chemoattraktive plattiert ist, um die untere Kammer gegeben. Elektroden unterhalb der Schnittstelle der zwei Kammern Maßnahme Erhöhung der elektrischen Impedanz mehr Zellen eindringen durch die Barrieren in die untere Kammer C:. Bilder von KGN Sphäroiden auf der LP9 Mono unter Phasenkontrastmikroskopie (links) oder Fluoreszenzmikroskopie (rechts). Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> .. Abbildung 2 Echtzeit-Eierstockkrebs Sphäroid Invasion Daten A - B: Repräsentative Ergebnisse einer RTCA Invasionstest mit und ohne FBS in der Bodenkammer eines CIM-Platte gut durchgeführt. KGN Zellinvasion auf LP9 Mesothelzellen verglichen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD Zell Index von drei Vertiefungen an der 24-Stunden-Zeitpunkt (A) und über einen gesamten Zeitraum 2 Tage-Test (B) gezeigt C - D:. Ein Vergleich der invasiven Kapazität von KGN, OVCA429 und OVCA433 Zelle Leitungen über einen Zeitraum von 24 Std. (C) und in detaillierter Art und Weise über einen Zeitraum 2,5 h (D) dargestellt.

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Invasion von Ovarialkarzinomzellen in einem Asteroiden-Mesothelzell-Kokultursystem als Modell für Metastasen in Echtzeit schnell zu quantifizieren. Dies wird zunächst erreicht, indem Ovarialkarzinomzellen aus Zelllinien durch Kultivierung unter nicht-ankerkontrollierten Bedingungen in Methylcellulose generiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Echtzeit-Zellanalysevorrichtung vorzubereiten, indem die obere Kammer einer zweikammerigen Vertiefung in der CIM-Platte mit Matrigel beschichtet wird, um die Basalmembran nachzuahmen, die dem Mesothel der Peritonealhöhle und der mesothelialen Auskleidung selbst unterliegt.Anschließend werden die Steroide aus dem Ovarialkarzinom geerntet und den oberen Kammern der Vertiefungen der Echtzeit-Analysatorplatte hinzugefügt. Der letzte Schritt besteht darin, den Echtzeit-Zellanalysator zu programmieren und zu starten, der über einen längeren Zeitraum der Assaydurchführung in vordefinierten Intervallen periodische Messungen vornimmt. Letztendlich zeigen die erhaltenen Ergebnisse den kontinuierlichen Invasionprozess auf, der verwendet wird, um die entscheidenden Faktoren zu bestimmen, die die Invasion von Ovarialkarzinomzellen durch zelluläre und Matrixbarrieren regulieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie standardmäßigen Transwell-Assays zur Untersuchung der Invasion von Krebszellen liegt darin, dass mit diesem Ansatz kontinuierliche Messungen der Invasion von Krebszellen über längere Zeiträume hinweg möglich sind. Im Gegensatz zu Endpunkt-Assays, die die dynamische Natur von Metastasen des Ovarialkarzinoms nicht vollständig erfassen, ermöglicht diese Methode nicht nur Einblicke in das Ovarialkarzinom, sondern kann auch zur Untersuchung verschiedener Arten metastatischer Prozesse, wie beispielsweise des Mammakarzinoms oder der Migration von Krebszellen durch eine endotheliale Schicht, eingesetzt werden. Ebenso kann sie zur Untersuchung normaler Zellinvasionen, wie beispielsweise der Trophoblasteninvasion während der Embryoimplantation, verwendet werden, um Ovarialkarzinomzellen für die fluoreszenzmarkierte Zellfärbung vorzubereiten.Ernten Sie zunächst die Zellen bei 75 % Konfluenz und resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von einem Milliliter vorgewärmtem PBS pro Million Zellen pro Milliliter bei einer Endkonzentration von 0,1 % BSA. Das Hinzufügen der optimalen Menge Steroid pro Vertiefung sowie die sorgfältige Handhabung des Steroids sind entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Fügen Sie danach zwei Mikroliter einer fünf Millimolar-Stammlösung der CellTrace CSFE-Lösung zu den Zellen hinzu, sodass eine Endkonzentration von 10 Mikromolar erreicht wird, und inkubieren Sie 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. In einem Wasserbad wird die Reaktion mit einem Milliliter eiskaltem Medium, das 10 % FBS enthält, gestoppt und die Zellen durch Zentrifugation erneut pelletiert. Resuspendieren Sie in 10 Milliliter des geeigneten vorgewärmten Wachstumsmediums und säen Sie die Zellen in einer 75 cm² Zellkulturflasche mit Schraubverschluss bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aus, bis die Fluoreszenzmarkierung ausreichend für die Detektion ist.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das für jede Zelllinie geeignete Volumen des Kulturmediums abmessen, das 15 Milliliter abzüglich des Volumens der für die Sphäroid-Generierung benötigten Zellen beträgt. Geben Sie drei Milliliter der Methylcellulose-Stocklösung zum Kulturmedium hinzu, um eine endgültige Methylcellulose-Konzentration von 20 % zu erreichen, und mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Umstülpen. Geben Sie 300.000 Zellen zum Methylcellulose-haltigen Medium hinzu und mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Umstülpen. Pipettieren Sie 150 Mikroliter der Zell-Methylcellulose-Medien-Mischung in jedes Loch einer 96-Loch-Kulturplatte mit konkavem Boden.Dies führt zu einer Gesamtdichte von 3000 Zellen pro Bohrung in Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid über einen Zeitraum von ein bis vier Tagen oder bis zur Ausbildung einer gleichmäßigen PHE. In der Regel wird ein Steroid pro Bohrung beobachtet. Der Echtzeit-Zellanalysator oder RTCA-Zellinvasionsassay verwendet eine 16-Bohrungs-RTCA-CIM-Platte mit zwei Kammern. Jeweils in Gruppen von vier Bohrungen geben Sie 50 Mikroliter Matrix in jede Bohrung der oberen Kammer der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist.Entfernen Sie langsam, aber unverzüglich 30 Mikroliter Matrix, um überschüssige Flüssigkeit zu beseitigen. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang vor der Verwendung in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach vier Stunden 30 Mikroliter serumfreies, für jede Krebszelllinie geeignetes Medium in die obere Kammer und 160 Mikroliter Medium mit oder ohne Serum hinzu.Wie es dem experimentellen Design für die untere Kammer entspricht, montieren Sie die CIM-Platte, indem Sie die untere Kammer in die obere Kammer einrasten lassen, und äquilibrieren Sie sie eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Öffnen Sie das RTCA-Programm und wählen Sie den Layout-Tab. Markieren Sie alle experimentellen Vertiefungen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Vertiefungen und wählen Sie „Vertiefungen aktivieren“.Dann füllen Sie die experimentellen Bedingungen und Verkaufsbezeichnungen nach Wunsch aus. Um Schritte oder Unterschritte zum Programm hinzuzufügen, wählen Sie den Reiter „Ablaufplan“ und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf „Schritt hinzufügen“. Der erste Schritt ist ein vorgegebenes Hintergrundabtasten, das automatisch in das Programm integriert wird.Wählen Sie nach dem Hinzufügen eines Schritts die gewünschten Programmdetails für Schritt zwei des RTCA-Programms aus, das während der Einrichtung der LP-neun menschlichen Mesothelzell-Monolayer Messwerte aufzeichnet. Fügen Sie die Zeitintervalle zwischen den Impedanzmessungen hinzu, indem Sie den Intervall-Tab auswählen und 15 Minuten eingeben. Fügen Sie die Versuchsdauer hinzu, indem Sie den Dauer-Tab auswählen und eine Zeit zwischen 12 und 24 Stunden eingeben.Die nachfolgenden Schritte werden auf die gleiche Weise hinzugefügt. Schritt drei des RTCA-Programms weist das Gerät an, während der Frid-Invasion Messungen durchzuführen. Geben Sie unter der Registerkarte Intervall fünf Minuten und unter der Registerkarte Dauer 48 Stunden ein.Wählen Sie im Menü die Platte aus und speichern Sie sie. Um dieses Verfahren zu beginnen, platzieren Sie die CIM-Platte im RTCA-Instrument und öffnen Sie das zuvor gespeicherte Programm. Wählen Sie im Menü „Ausführen“ aus, woraufhin automatisch eine Hintergrundmessung durchgeführt wird.Nach dem Hintergrundabgleich die CIM-Platte aus dem Gerät nehmen und in einen Zellkulturtischplatz stellen. 50.000 LP9-Zellen, die in 160 Mikroliter serumfreiem Medium suspendiert sind, in die obere Kammer jeder CIM-Platte geben. Die Platte in das RTCA-Gerät stellen und alle 15 Minuten Messungen vornehmen, während die LP9-Monoschicht über Nacht wächst. Am folgenden Tag aseptisch einen Millimeter von der Spitze einer 1-Milliliter-Pipettenspitze abschneiden und diese verwenden, um vorsichtig den Inhalt jedes Wells für jede Zelllinie abzusaugen.Vereinigen Sie 10 Steroide in einem sterilen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Steroide bei 120 ×g für acht Minuten und entfernen Sie dann das Methylcellulose-haltige Medium durch vorsichtiges Absaugen. Waschen Sie das Pellet anschließend zweimal erneut mit PBS, wobei jeweils bei 120 ×g für acht Minuten zentrifugiert wird, um die Steroide nach jedem Waschschritt erneut zu pelletieren.Für jedes experimentelle Well resuspendieren Sie insgesamt 10 Steroide in 160 Mikrolitern Medium ohne PBS. Unterbrechen Sie das RTCA-Experiment, indem Sie im Menüleistenmenü „Ausführen“ auswählen und „Pause“ aktivieren. Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät und stellen Sie sie in eine Zellkulturhaube.Entfernen Sie das Medium aus jedem Well und ersetzen Sie es durch Medium, das Steroide enthält. Stellen Sie die Platte wieder in das RTCA-Gerät. Wählen Sie „Ausführen“ aus der Menüleiste und aktivieren Sie „Schritt abbrechen“.Das Programm wechselt automatisch zum nächsten Schritt. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie „Ausführen“ in der Menüleiste und aktivieren Sie „Start fortsetzen“. Schritt drei im RTCA-Programm wird in diesem Experiment zwei epitheliale Ovarialkarzinom-Zelllinien, OVCA 4 33 und OVCA 4 29, sowie eine ovarielle granulosa Zelltumorlinie initiieren.KGN wurden verwendet, um nach einer Übernacht-Kultur Steroide zu bilden, wobei U-förmige Vertiefungen in einem Methylcellulose-haltigen Medium suspendiert wurden. Alle drei Zelllinien bildeten kompakte steroidproduzierende Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 400 bis 500 Mikrometern. Die unteren Bilder zeigen die entsprechenden Zelllinien, die in monolayerartigem Wachstum kultiviert wurden.Die Balken entsprechen 100 Mikrometern, sobald sie gebildet sind. Steroide wurden gewonnen und auf eine LP9-Mesothelzell-Monoschicht in einer RTCA CIM-Platte aufgebracht. Bilder unter Phasenkontrastmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie paralleler Kulturen wurden in regelmäßigen Abständen aufgenommen, um die Interpretation der RTCA-Daten zu unterstützen.Es ist aussagekräftig, sowohl die basale Invasion einer Krebszelllinie als auch die durch Chemotaktika induzierte Invasion zu bewerten. In diesem Beispiel wird die basale Invasivität durch Zugabe von serumfreiem Medium (SFM) in beide Kammern, die obere und die untere, gemessen. Komplettes Medium mit 10 % FBS, das zahlreiche potenzielle Chemotaktika enthält, wird verwendet, um die durch Chemotaktika induzierte Invasion zu untersuchen.Hier werden repräsentative Ergebnisse eines Vergleichs der Zellinvasion zwischen den KGN-Zellen und den LP9-Mesothelzellen gezeigt. Der RTCA-Invasionsassay wurde mit und ohne FBS in der unteren Kammer einer CIM-Platte durchgeführt. Die Ergebnisse werden als mittlerer positiver Zellindex minus Standardabweichung (SD) aus dreifach durchgeführten Ansätzen zum Zeitpunkt von 24 Stunden sowie über den gesamten zweitägigen Assayzeitraum dargestellt.Diese Ergebnisse bestätigen, dass LP9-Zellen über einen Zeitraum von zwei Tagen unter basalen oder chemoattraktanteninduzierten Bedingungen minimal invasiv sind und sich daher gut für Kokultur-Assays mit Ovarialkarzinomzellen eignen. Im Gegensatz dazu zeigten KG- und Ovarialkarzinomzellen die Fähigkeit, in Richtung eines Chemoattraktans zu wandern. Dieses Diagramm zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs der invasiven Kapazität der Zelllinien KGN-OVCA 429 und OVCA 433, dargestellt über einen 24-Stunden-Zeitraum innerhalb des zweitägigen Assays.Alle drei Zelllinien zeigten die Fähigkeit, in Richtung eines Chemoattractans zu invadieren, wie durch die ansteigenden Zellindizes angezeigt. Die Zelllinien wiesen ähnliche Invasionsraten auf, was durch die parallelen Steigungen der Kurven veranschaulicht wird. Die Kurve von OVCA 4 29 zeigt jedoch ein höheres oberes Asymptoten-Niveau, was auf ein höheres maximales Invasionsausmaß im Vergleich zu den anderen Zelllinien hindeutet.Im Gegensatz dazu waren die basalen Invasionsraten aller Zelllinien gering. Darüber hinaus zeigten die Zelllinien Unterschiede hinsichtlich ihres Zeitpunkts des Beginns der Invasion, wie eine detailliertere Analyse der Invasionsdaten über einen Zeitraum von 2,5 Stunden zeigt. Die KGN-Zellen durchdringen die Zell- und Matrixbarrieren schnell, während die OVC 4 33- und OVC 4 29-Zellen dafür drei beziehungsweise fünfmal länger benötigen.Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion nicht vorhersagbar war für ihre gesamte Invasionskapazität. Dies deutet auf unterschiedliche inhärente Fähigkeiten der Krebszelllinien hin, könnte aber auch bedeuten, dass verschiedene Faktoren das frühe und späte invasive Verhalten von Steroiden regulieren. Sobald man die Technik beherrscht, lässt sie sich leicht anpassen, um verschiedene Signalmoleküle und zelluläre Signalwege im peritonealen Mikromilieu zu untersuchen, die das metastatische Verhalten beeinflussen.Dies kann durch die Zugabe exogener Wachstumsfaktoren, Zytokine oder Inhibitoren entweder in die untere oder obere Kammer des Wells erreicht werden. Alternativ können Sie die Krebszellen selbst oder die peritonealen Zielzellen genetisch verändern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Die Mesothelzellen-Clearance-Test hier beschriebenen nutzt die Vorteile der fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu visualisieren und quantitativ zu messen die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Test modelliert die frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

In diesem Video demonstrieren wir die Entwicklung eines in vitro dreidimensionalen Modells der Auskleidung der Bauchhöhle. Diese organotypische Kultur kann helfen, die Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen zu untersuchen.

Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Dieses Video beschreibt eine Technik zur quantitativen Messung der Interaktion von Eierstockkrebs-Sphäroiden mit Mesothelzellen, unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Videomikroskopie. Dieser In-vitro-Assay modelliert die Interaktion zwischen metastasierenden Sphäroiden von Eierstockkrebszellen und Mesothelzellen, die die Bauchhöhle auskleiden, in vivo.

Mesothelialer Clearance-Assay: Eine in vitro Technik zur Quantifizierung der Invasionsfähigkeit von Eierstockkrebs-Sphäroiden in mesotheliale Zellmonoschichten

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Wir skizzieren ein Protokoll, das sowohl in vivo als auch ex vivo Ansätze zur Untersuchung der Besiedlung von peritonealem Fettgewebe, insbesondere des Omentums, bei Eierstockkrebs implementiert. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung und Analyse von Immunzellstrukturen im Omentum vor, die als Milchflecken bekannt sind und Metastasen des Peritonealfettgewebes begünstigen.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

Metastasierung bei Eierstockkrebs ist durch zahlreiche diffuse intraperitoneale Läsionen gekennzeichnet, so dass eine genaue visuelle Quantifizierung der Tumorlast eine Herausforderung darstellt.  In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur in situ und ex vivo Quantifizierung der metastasierten Tumorlast unter Verwendung von rot fluoreszierenden Protein (RFP)-markierten Tumorzellen und optischer Bildgebung.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

ovarian Tumorprogression in einem physiologisch relevanten Modell, mehrzelligen Sphäroiden wurden in einem Mikroeinrichtung unter simulierten Fluidstrom zu studieren. Diese dynamische 3D-Modell emuliert die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten, bei denen Ovarialkarzinom Metastasen auftreten.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Erfahren Sie die Echtzeit-Quantifizierung von Eierstockkrebs-Invasion in Mesothelzellen mittels RTCA-Analyzer. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Messungen der dynamischen Metastasierung über längere Zeiträume.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

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