Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Invasion von Eierstockkrebszellen in Asteroiden-Mesothelzell-Cokulturmodellen der Metastasierung schnell und in Echtzeit zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Eierstockkrebs aus Zelllinien erzeugt wird, indem die Zellen unter nicht adhärenten Bedingungen in Methylcellulose kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, einen Echtzeit-Zellanalysator, eine CIM-Platte, herzustellen, indem die obere Kammer der beiden Kammern gut mit Matrigel codiert wird, um die Basalmembran nachzuahmen, die dem Mesothel der Peritonealhöhle und der mesothelialen Auskleidung selbst zugrunde liegt.

Als nächstes werden die Eierstockkrebssteroide entnommen und in die oberen Kammern der Echtzeit-Analyseplattenvertiefungen gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, den Echtzeit-Zellanalysator zu programmieren und zu starten, der über einen längeren Zeitraum des Assays in vordefinierten Intervallen periodische Messwerte vornimmt. Letztendlich stellen die erhaltenen Ergebnisse den kontinuierlichen Invasionsprozess dar, der verwendet wird, um die Schlüsselfaktoren zu bestimmen, die Eierstockkrebszellen regulieren, wenn sie in Zell- und Matrixbarrieren eindringen

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Standard-Transworld-Assays der Krebszellinvasion besteht darin, dass dieser Ansatz kontinuierliche Messungen der Krebszellinvasion über längere Zeiträume ermöglicht. Im Gegensatz zu einem Single-Endpoint-Assay, der die dynamische Natur von Metastasen von Eierstockkrebs nicht vollständig erfasst, kann diese Methode jedoch verwendet werden, um Einblicke in Eierstockkrebs zu erhalten, kann auch zur Untersuchung verschiedener Arten von Metastasierungsprozessen wie Brustkrebs oder der Bildung von Krebszellen durch eine Endothelschicht angewendet werden. Ebenso kann es verwendet werden, um normale Zellinvasionen wie die Trophoblasteninvasion während der Embryonenimplantation zu untersuchen, um Eierstockkrebszellen für die fluoreszierende Zellmarkierung vorzubereiten.

Zuerst werden Zellen mit 75 % Co-Flüssigkeit geerntet und die Zellen werden bei einer Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter in einem Milliliter PBS pro 0,1 % BSA suspendiert. Die Zugabe der optimalen Menge an Steroid pro Vertiefung und der vorsichtige Umgang mit dem Steroid sind entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Als nächstes geben Sie zwei Mikroliter eines fünf Millimolar Vorrats an Zellspuren-CSFE-Lösung in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu den Zellen und inkubieren Sie sie 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. In einem Wasserbad wird die Reaktion mit einem Milliliter eiskaltem Medium mit 10 % FBS abgeschreckt und durch Zentrifugation erneut pelletiert. Reus. In 10 Millilitern des geeigneten Vorwärmmediums werden Samenzellen in eine 75 Quadratzentimeter große, mit Filter verschlossene Kolbenkultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gegeben, bis der Grad der Fluoreszenzmarkierung für den Nachweis ausreichend ist.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das für jede Zelllinie geeignete Volumen des Kulturmediums abmessen, das 15 Milliliter abzüglich des für die Sphe-Erzeugung benötigten Zellvolumens beträgt. Geben Sie drei Milliliter Methylcellulose-Stammlösung in das Nährmedium, um eine endgültige Methylcellulosekonzentration von 20 % zu erreichen, und mischen Sie sie gründlich durch sanfte Inversion. Geben Sie 300.000 Zellen in das Methylcellulose-haltige Medium und mischen Sie es gründlich durch vorsichtige Inversionspipette. 150 Mikroliter des Zell-Methylcellulose-Mediums mischen Sie in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit konkaver Boden.

Dies ergibt insgesamt 3000 Zellen pro Well-Kultur bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid für ein bis vier Tage oder bis zur einheitlichen PHE-Form. In der Regel wird ein Steroid pro Vertiefung beobachtet: Der Echtzeit-Zellanalysator oder RTCA-Zellinvasionsassay verwendet eine 16-Well-RTCA-Zweikammer-CIM-Platte. Arbeiten Sie in Gruppen von jeweils vier Vertiefungen und geben Sie 50 Mikroliter Matrix in jede Vertiefung der oberen Kammer der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche abgedeckt ist.

Entfernen Sie sofort 30 Mikroliter der Matrix, aber langsam, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie in einem Gewebekultur-Inkubator verwenden. Nach vier Stunden geben Sie 30 Mikroliter des serumfreien, für jede Krebszelllinie geeigneten Mediums in die obere Kammer und 160 Mikroliter Medium mit oder ohne Serum.

Bauen Sie die CIM-Platte gemäß dem Versuchsplan für die untere Kammer zusammen, indem Sie die untere Kammer in die obere Kammer einklicken und in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator äquilibrieren. Öffnen Sie eine Stunde lang in einem Gewebekultur-Inkubator das RTCA-Programm und wählen Sie die Registerkarte Layout. Markieren Sie alle Versuchsbohrungen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Vertiefungen und wählen Sie Vertiefungen einschalten.

Geben Sie dann die Versuchsbedingungen ein und verkaufen Sie die Namen nach Belieben. Um dem Programm Schritte oder Unterschritte hinzuzufügen, wählen Sie die Registerkarte Zeitplan und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Schritt hinzufügen. Der erste Schritt ist ein vorprogrammierter Hintergrund-Sweep, der automatisch in das Programm eingebunden wird.

Sobald Sie einen Schritt hinzufügen ausgewählt haben, geben Sie die gewünschten Programmdetails für den zweiten Schritt des RTCA-Programms ein, das die Messwerte während der Etablierung der LP neun menschlichen Mesothelzell-Monoschicht aufzeichnet. Fügen Sie die Zeitintervalle zwischen den Impedanzmesswerten hinzu, indem Sie die Registerkarte Intervall auswählen und 15 Minuten eingeben. Fügen Sie die Versuchsdauer hinzu, indem Sie die Registerkarte Dauer auswählen und eine Zeit zwischen 12 und 24 Stunden eingeben.

Nachfolgende Schritte werden auf die gleiche Weise hinzugefügt. Schritt drei des RTCA-Programms weist das Instrument an, während der Invasion Messungen vorzunehmen. Geben Sie fünf Minuten unter der Registerkarte Intervall und 48 Stunden unter der Registerkarte Dauer ein.

Wählen Sie die Platte in der Menüleiste aus und speichern Sie. Um diesen Vorgang zu starten, setzen Sie die CIM-Platte in das RTCA-Instrument ein und öffnen Sie das Programm, das Sie zuvor gespeichert haben. Wählen Sie in der Menüleiste Ausführen und dann Starten Ein Hintergrund-Sweep wird automatisch durchgeführt.

Entfernen Sie nach dem Hintergrund-Sweep die CIM-Platte aus dem Instrument und legen Sie sie in eine Gewebekultur-Haubenplatte. 50.000 LP-Neun-Zellen, suspendiert in 160 Mikrolitern serumfreiem Medium, in die obere Kammer jeder CIM-Platte. Legen Sie die Platte in das RTCA-Gerät und messen Sie alle 15 Minuten, während sich die LP-Neun-Monoschicht über Nacht am nächsten Tag etabliert, schneiden Sie aseptisch einen Millimeter von der Oberseite einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab und verwenden Sie sie, um den Inhalt jeder Vertiefung für jede Zelllinie vorsichtig zu entnehmen.

Pool 10 Steroide in einer sterilen Röhrchenzentrifuge. Steroide bei 120 GS für acht Minuten und dann Methylcellulose enthaltendes Medium durch sanfte Aspiration entfernen. Waschen Sie die Spritze noch zweimal mit PBS-Zentrif, um sie acht Minuten lang bei 120 GS zu verwenden, um Steroide nach jedem Waschen zu pelletieren.

Für jede experimentelle Vertiefung geben Resus insgesamt 10 Steroide in 160 Mikrolitern Medium ohne PBS aus. Halten Sie das RTCA-Experiment an, indem Sie in der Menüleiste Ausführen auswählen und die Option Pause aktivieren. Entfernen Sie die CIM-Platte vom Instrument und legen Sie sie in eine Gewebekulturhaube.

Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie es durch steroidhaltige Medien. Setzen Sie die Platte wieder in das RTCA-Gerät ein. Wählen Sie in der Menüleiste Ausführen und aktivieren Sie den Abbruchschritt.

Das Programm geht automatisch zum nächsten Schritt über. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie in der Menüleiste Ausführen aus, und aktivieren Sie Start weiter. Schritt drei im RTCA-Programm wird in diesem Experiment zwei epitheliale Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCA 4, 33 und OVCA 4 29 sowie eine Ovarial-Granulosa-Zelltumorlinie initiieren.

KGN wurden zur Erzeugung von Steroiden nach Übernachtkultur und U-Bodenverweilen verwendet, die in methylcellulosehaltigen Medien suspendiert waren. Alle drei Zelllinien bildeten kompakte Steroidstrukturen mit einem Durchmesser von etwa 400 bis 500 Mikrometern. Die unteren Felder zeigen die passende Zelllinie, die in einer Monolayer-Skala gewachsen ist.

Stäbe stellen 100 Mikrometer dar, sobald sie gebildet sind. Steroide wurden entnommen und auf einer LP-Neun-Mesothelzell-Monoschicht in einer R-T-C-A-C-I-M-Platte plattiert. In regelmäßigen Abständen wurden Bilder unter Phasenkontrastmikroskopie oder unter Fluoreszenzmikroskopie von Parallelkulturen aufgenommen, um die Interpretation der RTCA-Daten zu erleichtern.

Es ist aufschlussreich, sowohl die basale Schicht der Invasion einer Krebszelllinie als auch die chemoinduzierte induzierte Invasion zu beurteilen. In diesem Beispiel wird die basale Invasivität durch Zugabe von freiem Serummedium oder SFM sowohl in der oberen als auch in der unteren Kammer gemessen. Ein komplettes Medium mit 10 % FBS, das viele potenzielle Chemolockstoffe enthält, wird verwendet, um die durch Chemolockstoffe induzierte Invasion zu untersuchen.

Hier sind repräsentative Ergebnisse aus einem Vergleich der Zellinvasion zwischen den kgn-Zellen und den LP-Neun-Mesothelzellen dargestellt. Der RTCA-Invasionsassay wurde mit und ohne FBS in der unteren Kammer der A CIM-Platte durchgeführt. Die Ergebnisse werden als mittlerer positiver minus SD-Zellindex aus dreifachen Wells zum 24-Stunden-Zeitpunkt und über einen gesamten Assay-Zeitraum von zwei Tagen angezeigt.

Diese Ergebnisse bestätigen, dass LP-Neun-Zellen über zwei Tage entweder unter basalen oder chemolockstoffinduzierten Bedingungen minimalinvasiv sind und daher ein guter Zelltyp für den Einsatz in Co-Kultur-Assays mit Eierstockkrebszellen sind. Im Gegensatz dazu zeigten KG und Eierstockkrebs-Steroide die Fähigkeit, in Richtung eines Chemo-Lockstoffs einzudringen. Diese Grafik zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs der Invasivität von K-G-N-O-V-C-A 4 29 und OVCA 4 33 Zelllinien über einen Zeitraum von 24 Stunden über den zweitägigen Assay

Alle drei Zelllinien zeigten die Fähigkeit, in Richtung eines Chemolockstoffs einzudringen, was durch die steigenden Zellindizes angezeigt wird. Die Zelllinien wiesen ähnliche Invasionsraten auf, wie die parallelen Liniensteigungen der Kurven zeigen. Die OVCA 4 29-Kurve weist jedoch eine höhere obere Asim-Tote auf, was auf ein höheres maximales Invasionsniveau im Vergleich zu den anderen Zelllinien hinweist.

Im Gegensatz dazu waren die basalen Invasionsniveaus aller Zelllinien gering. Darüber hinaus wiesen die Zelllinien Unterschiede in ihrer Zeit bis zum Beginn der Invasion auf, wie eine detailliertere Analyse der Invasionsdaten über einen Zeitraum von 2,5 Stunden zeigt. Die KGN-Zellen dringen schnell in die Zell- und Matrixbarrieren ein, während die Zellen OVC 4, 33 und OVC 4 29 drei- bzw. fünfmal länger brauchen, um einzudringen.

Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion nicht prädiktiv für ihre Gesamtfähigkeit zur Invasion war. Dies deutet auf unterschiedliche inhärente Fähigkeiten der Krebszelllinien hin, könnte aber auch darauf hindeuten, dass verschiedene Faktoren das frühe und spätinvasive Verhalten von Steroiden regulieren. Sobald diese Technik gemeistert ist, ist sie leicht anpassbar, um verschiedene Signalmoleküle und zelluläre Signalwege innerhalb der peritonealen Mikroumgebung zu untersuchen, die das Metastasierungsverhalten beeinflussen.

Dies kann durch die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Inhibitoren entweder in die untere oder obere Kammer der Vertiefung erreicht werden. Alternativ können Sie die Krebszellen selbst oder die peritonealen Zielzellen genetisch manipulieren.