Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein-Interaktionspartner für ein bestimmtes Protein von Interesse zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst in Zellkulturmedien gezüchtet werden, die Arginin und Lysin enthalten, die mit verschiedenen stabilen Isotopen von Kohlenstoff und Stickstoff markiert sind. Der zweite Schritt besteht darin, ein Protein von Interesse oder ein Kontrollplasmid in die markierten Zellen zu transfizieren, zu plasmiden und zu beschichten.

Als nächstes werden die Zellen lysiert und Proben aus den Lysaten immunpräzipitiert. Dann werden gleiche Volumina von Kontroll- und Proben-Immunpräzipitaten kombiniert und für die lc MS MS-Analyse eingereicht. Der letzte Schritt besteht darin, die massenspektrometrischen Daten zu analysieren, um Proteine zu identifizieren, die mit dem interessierenden Protein interagieren.

Letztendlich ist die Markierung stabiler Isotope von Aminosäuren in Zellkulturen oder Silac-Aminofällungen in der Lage, eine große Anzahl von direkten und indirekten Wechselwirkungen mit einem Protein von Interesse aus Gewebekulturzellen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem Tap Tagging, besteht darin, dass der Untersucher keine einzelnen Banden aus der Massenspektrometrie mehr wegschicken muss. Dadurch wird eine wichtige Quelle für Verzerrungen beseitigt und gleichzeitig die Empfindlichkeit erhöht.

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in zelluläre Proteine zu erhalten, können Proteininteraktionen auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Untersuchung von Krankheitserreger-Wirts-Interaktionen. Um mit dem Scrapen von SLAC-markierten HEK 2 93 T-Zellen zu beginnen, exprimieren Sie das GFP-markierte Protein von Interesse oder die GFP-Kontrolle aus der Zellkulturschale in eiskaltes PBS, zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 220 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, waschen Sie die Zellen drei weitere Male in 10 Millilitern eiskaltem PBS, resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Zelllysepuffer, der den frisch hinzugefügten Proteasehemmer-Cocktail enthält drei in einer X-Konzentration und fügen Sie fünf Mikroliter RNAs-Cocktail pro Milliliter Lysepuffer hinzu, inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann das Zelllysat bei 13.000 Mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und behalten Sie den Überstand als lösliches Zelllysat bei.

Messen Sie die Proteinkonzentration des Zelllysats mit einem A BCA-Assay. Normalisieren Sie dann die Proteinkonzentration in jeder Probe mit Lysat in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern unter Verwendung des Lysepuffers, der Proteaseinhibitoren enthält. Fügen Sie 500 Mikroliter Verdünnungspuffer hinzu, der einen x Proteaseinhibitor-Cocktail enthält, drei zu jedem der normalisierten Zelllysate, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter einzustellen.

Halten Sie die Lysate auf Eis, während Sie Anti-GFP-Kügelchen vorbereiten, und bewahren Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern jeder Probe auf, das für die Probeneingabe verwendet werden soll. Wirbeln Sie die Bead-Aufschlämmung auf, um die Beads wieder zu suspendieren. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit dem Endausschnitt, um 25 Mikroliter Kügelchen pro Probe in ein frisches Röhrchen zu übertragen.

Für jeweils 25 Mikroliter Bead-Slurry 20 Volumen Verdünnungspuffer zum Waschen hinzufügen und die Beads fünf Minuten lang bei 2.700 mal G zentrifugieren. Waschen Sie die Kügelchen weitere Male mit 20 Volumen Verdünnungspuffer. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Verdünnungspuffer pro 25 Mikroliter Bead-Slurry hinzu.

Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit dem Endausschnitt, um 85 Mikroliter der resuspendierten Bead-Aufschlämmung auf jeden der SLAC-markierten Probenlysate zu übertragen. Inkubieren Sie die Proben mit Kügelchen auf einem Rotator zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius, nachdem die Proben mit den Kügelchen inkubiert wurden, und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 2.700 mal G. 50 Mikroliter des Überstands werden als ungebundene Probe aufbewahrt und der Rest des Überstands verworfen.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in jedem Röhrchen in einem Milliliter Verdünnungspuffer und zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 2.700 μg. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, um das Protein aus den Kügelchen zu eluieren. Geben Sie 50 Mikroliter von zwei XSDS-Ladepuffern zu jeder Probe und erhitzen Sie sie 10 Minuten lang auf 95 Grad Celsius.

Sobald das Erhitzen beendet ist, zentrifugieren Sie jede Probe fünf Minuten lang bei 2.700 G bei vier Grad Celsius. Den Überstand in vorgeschmierte Röhrchen überführen und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis er für die MS-Analyse eingereicht werden kann. Mischen Sie dann gleiche Volumina an Kontroll- und Probenaminopräzipitaten und senden Sie die kombinierte Probe zur lcms MS-Analyse an eine Massenspektrometrieeinrichtung.

Kopieren Sie vor der Analyse der Massenspektrometriedaten die Rohdaten in eine neue Tabelle. Entfernen Sie dann in dieser Tabelle alle Spalten mit Ausnahme der Spalten, die die Zugangsnummer, die Anzahl der eindeutigen Peptidverhältnisse, den Vergleich von Proben, die Variabilität des Verhältnisses und die Proteinbeschreibung enthalten. Verwenden Sie die Excel-Sortierfunktion, um die Daten nach der Anzahl der Peptide zu sortieren und die Einträge für Proteine zu entfernen, denen mehr als ein Peptid fehlt.

Sortieren Sie dann nach Verhältnis und entfernen Sie Proteine, denen SLAC-Verhältnisse fehlen. Konvertieren Sie als Nächstes die Slac-Verhältnisse, um zwei Werte zu protokollieren. Bei Verwendung der Formel werden die logarithmischen Klammern, das SLAC-Verhältnis zwei und die Klammern verwendet, wobei das SLAC-Verhältnis an die Stelle des Zellenbezeichners tritt.

Erstellen Sie dann eine neue Spalte in der Excel-Datei, und berechnen Sie Log two SLAC-Verhältnisse für alle Beispiel-Mock-Spalten für die Konvertierung eines Mock-Stichprobenverhältnisses in ein Stichproben-Mock-Verhältnis. Verwenden Sie die Formel gleich eins geteilt durch das Verhältnis. Öffnen Sie das GraphPad-Prisma.

Wählen Sie neue Datentabelle und Grafik aus: Spalte auswählen aus der Liste auf der linken Seite des Fensters und wählen Sie die Option Importdaten ein. Geben Sie Replikatwerte ein, die in Spalten gestapelt sind. Drücken Sie auf Erstellen.

Wählen Sie dann eine bestimmte Spalte für das Mock-SLAC-Verhältnis aus dem Protokoll aus, und kopieren Sie sie aus der Excel-Tabelle in die neue Prismendatei. Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü "Einfügen" und wählen Sie "Neue Analyse" aus. Wählen Sie unter Spaltenanalyse die Option Häufigkeitsverteilung aus.

Behalten Sie die Standardoptionen bei und klicken Sie auf OK. Im Ergebnisordner wurde ein neuer Histogrammabschnitt generiert. Wählen Sie den Abschnitt Häufigkeitsverteilung aus, klicken Sie dann auf das Dropdown-Menü Einfügen und wählen Sie Neue Anpassung der XY-Regressionskurve für die Analyse aus.

Klicken Sie auf Gaußsche Verteilung und dann auf OK. Im angezeigten Ergebnisfenster werden der Mittelwert und die Standardabweichung angegeben. Generieren Sie einen Schwellenwert, indem Sie der Excel-Datei 1,96 Standardabweichungen zum Mittelwert hinzufügen.

Erstellen Sie eine neue Registerkarte mit dem Namen "Kombinierte Beschriftungsspalte Ein Zugang" und kopieren Sie alle Zugangsnummern aus jedem der einzelnen Experimente in diese einzelne Spalte. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Daten und dann die Option Duplikate entfernen. Erstellen Sie dann Spalten für die SLAC-Verhältnisse und die Verhältnisvariabilität aus jedem Experiment sowie für die Spalte mit der Beschreibung des Proteinnamens.

Verwenden Sie auf der Registerkarte "Beschreibung" die SVERWEIS-Formel, um die Beschreibung jeder Zugangsnummer zu erfassen. Ziehen Sie die Formel in der Spalte nach unten, um die Proteinbeschreibung auszufüllen, und verwenden Sie dann diese Formel, um die Verhältnis- und Variabilitätsdaten aus den einzelnen Experimenten abzurufen. Um interagierende Proteine im kombinierten Datensatz hervorzuheben, notieren Sie sich den Schwellenwert für ein bestimmtes Experiment.

Wählen Sie die Spalte "Verhältnis" aus und klicken Sie auf die Registerkarte "Start". Gefolgt von der bedingten Formatierung, markieren Sie die Zellen mit weiteren Regeln, markieren Sie die Regeln für Zellen und wählen Sie dann den Stil "Klassisches Format nur für Verkäufe, die einen Verkaufswert größer oder gleich enthalten". Geben Sie in das Feld den Wert für eine Standardabweichung von 1,96 ein und klicken Sie auf OK.

Bewerten Sie die Verhältnisvariabilität für jede positive Interaktion. Wenn Sie die prozentuale Variabilität subtrahieren, würde ein Treffer unter den Schwellenwert fallen. Dies ist mit Vorsicht zu genießen.

Wiederholen Sie dies für jede der Ergebnisspalten und vergleichen Sie die in zwei oder mehr Experimenten hervorgehobenen Proteine, die in zwei oder mehr Experimenten identifiziert wurden, stellen eine Interaktion mit hohem Konfidenzniveau dar. Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Aufreinigung des interessierenden GFP-markierten Proteins. Das Fehlen einer Lücken-DH-Bande in den gebundenen Proben deutet darauf hin, dass nicht-interagierende Proteine durch den Immunpräzipitationsschritt aus den Proben depletiert wurden, während das Vorhandensein einer EIF-4G-Bande in diesen Proben darauf hindeutet, dass bekannte interagierende Bindungspartner beibehalten wurden.

Mehrere der identifizierten EIF-Vier-A-Bindungsproteine wurden zwischen den beiden Isoformen konserviert. Die Proteine, die mit EIF four A interagieren, sind durch das hohe LAC-Verhältnis gekennzeichnet, während die unspezifisch gebundenen Proteine in diesem Experiment ein Verhältnis von weniger als 0,96 aufweisen. In diesem Diagramm des Initiationsfaktor-Komplexes sind die vier AIF-Bindungsproteine, die im SLAC-Aminofällungsexperiment identifiziert wurden, rot bis weiß schattiert.

Gemäß dem SLAC-Verhältnis log zwei verdeutlicht die hohe Abdeckung sowohl direkter als auch indirekter Bindungspartner des EIF vier A-Eins- und Zwei-Komplexe die Wirksamkeit dieses Ansatzes zur Identifizierung von Proteininteraktionen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass zwar eine gewisse Variation der Proteinspiegel in der Phase der Datenanalyse kompensiert werden kann, Es ist am besten, wenn dies vermieden werden kann, indem eine genaue Normalisierung der Proteinzufuhrmengen sichergestellt und der Verlust von AROS-Kügelchen während der Waschschritte vermieden wird.