In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, selbstreaktive T-Zellen mit hoher Spezifität mithilfe von MHC-Klasse-II-Dex-Trimmern nachzuweisen. In diesem Video wird zerebrales Gewebe aus dem Gehirn einer Maus mit experimentell autoimmune Enzephalomyelitis, die durch myelinassoziertes Proteolipidprotein induziert wurde, gewonnen. Dies erfolgt, indem zunächst sorgfältig das Gewebe entnommen und die Aros-Blöcke vorbereitet werden.

Der zweite Schritt besteht darin, das eingebettete Gewebe mit einem Viome in 200 Mikrometer dicke Schnitte zu zerschneiden. Die Schnitte werden anschließend in Gewebekammern einer 24-Loch-Platte überführt, wo sie gefärbt und fixiert werden. Der letzte Schritt ist das Aufbringen der Gewebeschnitte auf mikroskopische Objektträger.

Schließlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Zellen darzustellen, die mit Dex-Trimern und CD4-Antikörpern gebunden sind. Wir entwickelten diese Idee erstmals, als wir zeigten, dass die MHC-Klasse-II-Dex-ERs empfindlicher waren als herkömmliche MHC-Klasse-II-Tetramere zur Detektion antigen-spezifischer, selbstreaktiver CD4-T-Zellen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Schneiden frischer Gewebe und deren Handhabung ziemlich anspruchsvoll ist.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Schneiden, Montieren und Analysieren aufgrund ihrer Schwierigkeit schwer zu erlernen sind. Zusätzlich zu Ting werden zwei Postdoktoranden aus meiner Gruppe, Chandy und Aaron, sowie Christian aus dem Labor von Dr. Zoe dieses Verfahren demonstrieren. Nach der Tötung von Mäusen mit experimentell-autoimmuner Enzephalomyelitis oder EAE wird der Schädel durch kreisförmiges Abschneiden des Schädeldaches mit einer gebogenen Schere freigelegt und die Schädelknochen vorsichtig mit einer Pinzette angehoben. Das Gehirn wird mittels stumpfer Dissektion mit einem sauberen Skalpell entnommen.

Trennen Sie das Rerum vom Kleinhirn. Legen Sie das Rerum in ein Gefäß mit kalter 1×-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und stellen Sie das Gefäß bis zur Weiterverarbeitung auf Eis. Legen Sie das Rerum in eine Einweg-Histokassette mit tiefem Boden, die auf Eis aufbewahrt wird.

Danach wird geschmolzenes 4 % PBS-puffertes Low-Melting-Agarose in die Kassette gegossen. Unmittelbar anschließend wird das Großhirn vorsichtig mit einer Pinzette niedergedrückt, um das Gewebe vollständig zu überdecken, und die Kassette auf Eis gestellt, bis die Erstarrung vollständig ist. Nach dem Erstarren wird überschüssige Agarose an allen Seiten des eingebetteten Gewebes abgetrimmt und die ventrale Oberfläche des Großhirns leicht freigelegt.

Als Nächstes bestreichen Sie den Vibram-Gewebeklotz mit Sekundenkleber und übertragen das in Aros eingebettete Gewebe auf die geklebte Oberfläche, indem Sie die freigelegte ventrale Seite des Cerebro auf den Kleber legen, um Querschnitte anzufertigen. Bewegen Sie das Gewebe nicht mehr, sobald es auf dem Klotz platziert ist. Stellen Sie den Vibratomklotz mit dem darin enthaltenen, in Aros eingebetteten Gewebe auf Eis und lassen Sie den Kleber 15 Minuten lang trocknen.

Unterdessen die vorbereiteten Gewebekammern in eine 24-Loch-Platte geben, wobei sich pro Kammer ein Loch befindet. Die Löcher mit den Gewebekammern mit einem Milliliter kalter 1× PBS auffüllen und die Platte auf Eis stellen. Sobald der Kleber getrocknet ist, die Vibram-Sägeklinge auf die Höhe der oberen Oberfläche des Gewebes absenken.

Stellen Sie die Vibram-Geschwindigkeit auf 0,22 Millimeter pro Sekunde ein und beginnen Sie mit dem Schneiden durch eine Vorwärtsbewegung, um 200 Mikrometer dicke Schnitte herzustellen. Übertragen Sie mithilfe eines weichen Aquarellpinsels einen zerebralen Schnitt in jede Gewebe-Kammer. Halten Sie die 24-Loch-Platte während des gesamten Schneidens auf Eis, um eine Gewebezerstörung zu verhindern.

Bereiten Sie als Nächstes eine zweite 24-Loch-Platte vor, indem Sie 300 µL eines Cocktails, der IA von S Myelin Proteolipid Protein 1 39 bis 1 51 dextro und CD vier Antikörper enthält, zu drei der Löcher hinzufügen. Geben Sie anschließend 300 µL des Kontroll-IA von S Tyler Murine Encephalomyelitis Virus 70 bis 86 dextro und CD vier Antikörper-Cocktails zu einem weiteren Satz von drei Löchern hinzu. Fahren Sie danach mit der Beschriftung der Löcher fort.

Überführen Sie dann drei Gewebekammern, die die für die Färbung mit spezifischen Dex-Trimern vorgesehenen Schnitte enthalten, in die drei dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, wobei sich jeweils eine Kammer pro Vertiefung befindet. Überführen Sie auf ähnliche Weise die drei Gewebekammern, die die für die Färbung mit kontrollierten Dex-Streamern vorgesehenen Schnitte enthalten, in die entsprechenden Vertiefungen. Decken Sie die Vertiefungen jeweils mit einer Kammer pro Vertiefung mit einem Deckel ab.

Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und stellen Sie sie für 1,5 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur auf eine schwingende Plattform, die auf sanfte Rotation eingestellt ist. Nach der Inkubationszeit waschen Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie in eine neue Vertiefung mit einem Milliliter kalter 1×PBS-Waschlösung überführen und mindestens 10 Minuten auf der schwingenden Plattform waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.

Stellen Sie sicher, dass die Gewebeschnitte nicht austrocknen, da sie sonst an den Seiten der Kammer haften können. Fixieren Sie die Schnitte, indem Sie die Gewebebehälter in eine frische Vertiefung überführen. Verwenden Sie eine 24-Loch-Platte, die ein Milliliter filtriertes, mit PBS gepuffertes 4 % Paraformaldehyd enthält, und inkubieren Sie zwei Stunden lang auf einer schwingenden Plattform mit sanften Rotationen.

Nachdem die Schnitte nochmals dreimal gewaschen wurden, bringen Sie die gefärbten und fixierten Schnitte auf einen sauberen mikroskopischen Objektträger auf. Mit einem weichen Aquarellpinsel wird überschüssiges Wasser abgewischt, ohne den Schnitt zu berühren, und der Schnitt wird mit Eindeckmedium aufgenommen. Mit einem mikroskopischen Deckglas abdecken und die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.

Verwenden Sie im Dunkelraum ein konfokales Mikroskopsystem Nikon A one Eclipse 90 I für die routinemäßige Abtastung und Aufnahme von Bildern. Öffnen Sie zunächst die NIS-Elements-AR-Software und wählen Sie die Kanäle Tetraethyl, Rumine, Isothiocyanat oder Trit C sowie Cyan fünf oder SCI fünf aus dem Bedienfeld aus. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen für die Trit-See- und Sci-Fi-Kanäle werden standardmäßig angezeigt.

Weisen Sie dem Trit-Sea-Kanal die Pseudofarbe Grün und dem SCI-Fünf-Kanal die Pseudofarbe Rot zu. Legen Sie die zu untersuchende Probe auf den Mikroskopständer und fokussieren Sie manuell bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die HV auf eins 10 und den Offset auf null, klicken Sie auf Fokus und stellen Sie die Spannung ein.

Um die Laser zu optimieren, führen Sie einen Fokus-Scan des Abschnitts von oben nach unten durch und stellen Sie die Z-Ebene für die Bildaufnahme ein. Klicken Sie dann auf CH-Serie und nehmen Sie das Bild sequenziell auf. Identifizieren Sie dextro- oder positiv CD-vier-positive T-Zellen, die als gelbe punktförmige Zellen erscheinen, basierend auf der Kolokalisation der Signale aus den roten und grünen Kanälen.

Verwenden Sie ein konfokales Olympus FV 500 BX 60-Mikroskop für die einfache quantitative Erfassung von dextro- oder positiven CD4-positiven T-Zellen. Öffnen Sie zunächst die Fluovu-Software. Wählen Sie die Farbstoffe SSI3 und SCI5 aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf „Übernehmen“, um die entsprechenden Laser zu laden.

Platzieren Sie den zu untersuchenden Objektträger auf dem Mikroskoptisch und fokussieren Sie manuell unter niedriger Vergrößerung, während der SI-drei-Laser eingeschaltet ist, und fokussieren Sie den entzündlichen Herd. Wechseln Sie das Objektiv auf 100fache Vergrößerung. Stellen Sie die Dateigröße im Dropdown-Menü auf fünf zwölf durch fünf zwölf ein, klicken Sie auf Fokus und passen Sie die Werte für PMT-Verstärkung und Offset an, um den Laser separat für S SI drei und sci fünf zu optimieren. Klicken Sie auf Z-Tisch und dann auf Fokus, während beide Laser eingeschaltet sind.

Stellen Sie die Dicke der Z-Ebene durch Klicken auf die Pfeile nach oben und unten ein. Legen Sie das Z-Intervall auf zwei Mikrometer fest. Klicken Sie auf „Stop“ und „Wählen“.

Suchen Sie 1, 2, 3. Klicken Sie dann auf X, y, Z und beginnen Sie mit der Aufnahme von Z-Serienbildern für den ausgewählten Bereich innerhalb des entzündlichen Herdes. Speichern Sie die Z-Serienbilder als VI-Dateien. Um Bilddateien zu speichern, wählen Sie das Bild aus der Z-Serienaufnahme aus und speichern Sie es anschließend im TIFF-Format.

Speichern Sie immer Multi-TIFF-Bilder. Zunächst, um die Daten zu schützen, folgt als nächster Schritt die Untersuchung von drei gepaarten Schnitten, die mit beiden Sätzen von Dex-Trimern gefärbt wurden. Erstellen Sie zunächst die Z-Serienbilder, indem Sie die Objektträger in einer horizontalen vertikalen Aufwärts- horizontalen vertikalen Abwärts-Bewegung abscannen, um Wiederholungen der Z-Serie innerhalb desselben Fokus zu vermeiden.

Nachdem die Z-Serielle-Bilder aufgenommen wurden, benennen Sie die Dateien, indem Sie die Objektträgernummern, den Namen der Schnitte und die Anzahl der aufgenommenen Z-Serielle-Bilder identifizieren. Verwenden Sie die Image-J-Software, um dextro-positive CD4-positive T-Zellen in Bezug auf die Gesamtanzahl der CD4-positiven T-Zellen zu zählen. Wählen Sie den Zähler-Typ in Image J, aktivieren Sie „Alle anzeigen“ und beginnen Sie mit dem Zählen, indem Sie auf die Mitte jeder Zelle klicken, und fahren Sie mit dem Zählen in verschiedenen Z-Serielle-Bildern fort, indem Sie die seitlichen Pfeile verwenden.

Nachdem alle CD4-T-Zellen gezählt wurden, wählen Sie einen anderen Zählertyp und zählen Sie die dextro-positiven CD4-positiven T-Zellen. Klicken Sie auf den Reiter „Ergebnisse“, um die Gesamtanzahl der Zellen zu erhalten, die mit den beiden verschiedenen Zählern erfasst wurden. Der Nachweis myelinbasierter Proteolipidprotein- oder PLP-spezifischer CD4-T-Zellen erfolgte unter Verwendung frisch geschnittener zerebraler Schnitte von EAE-Mäusen, die mit Cocktails gefärbt wurden, die anti-CD4 sowie PLP 139 bis 151 Dextere oder Kontroll-TMEV 70 bis 86 Dextere enthielten, und anschließender LSCM-Analyse.

Die Analyse von Doppelfärbungen von Gehirnschnitten zeigt Zellen, die positiv für PLP 1 39 bis 1 51 Dex-Trimer in Rot und Zellen, die positiv für den CD4-Antikörper in Grün sind, wobei doppelt positive Zellen gelb erscheinen. Die doppelt gefärbten Zellen zeigten punktförmige Strukturen am Rande. Ein solches Merkmal fehlte in Schnitten, die mit dem Kontrollpeptid TMEV 70 bis 86 gefärbt wurden.

Die Detektion herzspezifischer CD4-T-Zellen mittels Dex-Trimern durch In-situ-Färbung mit dem schweren Ketten-Peptid von kardialem Myosin Alpha 334 bis 352 Dextern wurde ebenfalls durchgeführt. Die Analyse dieser Bilder mittels LSCM zeigte Zellen, die positiv für MYHC 334 bis 352 Dextern (rot) und Zellen, die positiv für CD4 (grün) waren, sowie Zellen, die sowohl an Dexter als auch an CD4 gebunden waren, als gelbe punktförmige Strukturen. Die Hintergrundfärbung für Kontroll-RNAs 43 bis 56 Dextern war vernachlässigbar. Sobald man die Methode beherrscht, kann sie in etwa acht bis zehn Stunden durchgeführt werden, im Gegensatz zu drei Tagen bei anderen publizierten Protokollen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Reagenzien rechtzeitig vorzubereiten und die Schritte systematisch zu befolgen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Gewebeproben geschnitten und gefärbt werden, um C-reaktive CD4-T-Zellen in den Zielstrukturen zu zählen.