Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration
6. September 2014
Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit <30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reine und respirationskompetente Mitochondrien schnell aus Rattengewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem Gewebeproben zuerst assoziiert und homogenisiert werden. Die nächsten Schritte bestehen darin, Subin A in das Homogenat einzumischen und auf Eis zu inkubieren.
Anschließend wird der Homogenatansatz mit BSA versetzt und filtriert, gefolgt von einer erneuten Filtration. Die abschließenden Schritte bestehen darin, das Filtrat zu zentrifugieren und die mitochondrialen Pellets in einem Atmungspuffer erneut aufzususpenderen. Letztendlich können Ergebnisse zeigen, dass die isolierten Mitochondrien lebensfähig sind und über eine funktionelle Atmungskapazität verfügen, wie durch eine Atmungsanalyse und einen ATP-Lumineszenz-Assay nachgewiesen werden kann.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, bei denen die Isolierung von Mitochondrien zwischen 60 und hundert Minuten dauert, liegt darin, dass lebensfähige und atembereite Mitochondrien in weniger als 30 Minuten isoliert werden können. Allison Mackay, eine Technikerin aus einem kooperierenden Labor, wird kurz vor Beginn den ATP-Lumineszenz-Assay demonstrieren. Lösen Sie das Subin A in einem Milliliter Homogenisierungspuffer und lösen Sie das BSA ebenfalls in einem Milliliter Homogenisierungspuffer auf.
Sammeln Sie nun zwei frische Gewebeproben mit einer sechs Millimeter großen Biopsieproben-Stanzvorrichtung und lagern Sie diese in einem 50-Liter-Zentrifugenrohr in XPBS auf Eis. Sobald bereit, überführen Sie das Gewebe in ein C-Gefäß für die Gewebe-Dissizierung, das fünf Milliliter eiskalte Homogenisierungspuffer enthält. Anschließend homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie das Gefäß in die Gewebe-Dissizierungsvorrichtung einsetzen und den voreingestellten Zyklus für die Mitochondrien-Isolierung auswählen.
Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, stellen Sie das Gefäß erneut auf Eis und geben Sie 250 µL Sub zu Lyin einer Stammlösung hinzu. Mischen Sie dies durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen. Sobald die Mischung gleichmäßig verteilt erscheint, inkubieren Sie das Homogenat 10 Minuten lang auf Eis.
Als Nächstes stellen Sie ein 40-Mikron-Maschensieb auf ein 50-Milliliter-kegelförmiges Zentrifugenröhrchen und stellen dieses auf Eis. Befeuchten Sie das Sieb mit Homogenisierungspuffer und entsorgen Sie den Puffer in einen Abfallbehälter. Sobald alles vorbereitet ist, gießen Sie das Homogenat durch das Sieb, um das Filtrat zu erhalten.
Fügen Sie 250 µL BSA-Stammlösung hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtig-Invertieren. Dieser Schritt sollte jedoch bei der Analyse von mitochondrialen Proteinen übersprungen werden. Bereiten Sie nun zwei weitere vor.
50-Milliliter-Konischzentrifugenröhrchen auf Eis, eines mit einem 40-Mikron-Filter und das andere mit einem 10-Mikron-Filter bestücken. Beide Filter mit etwas Homogenisierungspuffer benetzen und diesen Puffer anschließend verwerfen. Danach das Homogenat zuerst durch den 40-Mikron-Filter und dann durch den 10-Mikron-Filter gießen.
Diese Filtrationsschritte verbessern die Reinheit der Mitochondrien erheblich. Verteilen Sie nun das Filtrat gleichmäßig auf zwei vorab gekühlte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie diese bei 9.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren und vereinigen Sie die beiden gereinigten mitochondrialen Pellets.
In einem Milliliter eiskaltem Atmungspuffer ist es entscheidend, dass der gesamte Vorgang bei vier Grad Celsius durchgeführt wird. Die gereinigten Mitochondrien können nun daraufhin untersucht werden, um die Stoffwechselaktivität der isolierten Mitochondrien zu bestimmen. Ein ATP-Lumineszenz-Assay kann mithilfe eines ATP-Assay-Kits durchgeführt werden.
Zunächst bringen Sie die Kit-Reagenzien auf Raumtemperatur. Danach bereiten Sie die HT P-Stammlösung vor und stellen sie auf Eis. Als nächster Schritt geben Sie fünf Milliliter Substratpuffer zu der lyophilisierten Substratlösung hinzu.
Vorsichtig mischen und im Dunkeln aufbewahren. Dann 100 Mikroliter Atmungspuffer in jedes Loch einer undurchsichtigen schwarzen 96-Loch-Platte geben. 10 Mikroliter der vorbereiteten Mitochondrien zu den Löchern hinzufügen, die sich unterhalb der ATP-Standards befinden.
Jede einzigartige mitochondriale Probe sollte in dreifacher Ausfertigung gepflanzt werden; drei Vertiefungen allein mit Atmungspuffer als negative Kontrolle. Fahren Sie fort, indem Sie 50 µL lytische Lösung für Säugerzellen zu jeder Vertiefung hinzufügen, sobald diese befüllt ist. Inkubieren Sie die Platte 5 Minuten bei 37 °C auf einem Rotationserschütterer bei 120 min⁻¹.
Während der Inkubation bereiten Sie Verdünnungen des ATP-Standards von einem Zehntel Millimolar bis zu einem Zehntel Mikromolar vor. Nach der Inkubation geben Sie 10 Mikroliter jedes der ATP-Standards in die entsprechenden Vertiefungen, die auf der Plattenkarte angegeben sind. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter der rekonstituierten Substratlösung zu jeder hinzu.
Danach die Platte erneut wie zuvor für fünf Minuten inkubieren. Fahren Sie fort, indem Sie die Platten im Plattenreader untersuchen. Die Software unter öffnen.
Erstellen Sie ein neues Element. Klicken Sie auf Experiment. Danach klicken Sie auf Standardprotokoll und bestätigen mit OK.
In der linken Spalte wählen Sie Protokoll. Danach weiter, anschließend Verzögerung auswählen und auf 10 Minuten einstellen. Danach OK, der Eintrag.
Wählen Sie nun im Dropdown-Menü Lumineszenz aus, lesen Sie diese und treffen Sie eine Auswahl. Passen Sie die weiteren Einstellungen wie folgt an: Messmodus Endpunktintegration, Integrationszeit.
Eine Sekunde. Filter-Sets: Position der Emissionsblendenoptik, obere Empfindlichkeit 100, vertikaler Versatz der oberen Sonde um einen Millimeter. Nachdem diese Einstellungen geändert wurden, klicken Sie auf „Okay“.
Klicken Sie auf „Plate Layout“ und richten Sie es entsprechend ein. Klicken Sie auf „Okay“. Wenn nun alles eingestellt ist, klicken Sie auf das „Read Plate“-Symbol in der oberen Zeile und anschließend auf „Read“.
Wenn das Spektrophotometer geöffnet wird, stellen Sie die Platte so in das Fach, dass sich Vertiefung A1 in der oberen linken Ecke befindet. Nun öffnet sich ein Fenster, das die Temperatur anzeigt; klicken Sie auf „OK“ und fahren Sie anschließend mit der Analyse der Daten fort. Skelettmuskelproben mit einem Nassgewicht von etwa 0,18 Gramm ergaben basierend auf der Partikelgrößenzählung etwa 24 Milliarden Mitochondrien.
Leberproben gleicher Größe ergaben einige Milliarden mehr. Die Mitochondrien-Hämocytometerablesungen wurden mittels Partikelzähler unterschätzt. Es wurde eine repräsentative Aufzeichnung erhalten, die zeigt, dass isolierte Mitochondrien unter einem einzigen Peak lokalisiert sind, mit einem mittleren Durchmesser von etwa vier Zehntel eines Mikrons.
Dies stimmt mit früheren Berichten überein, die den Bi-Säure-Assay verwenden. Das mitochondriale Protein wurde in einer Menge von wenigen Milligramm pro Gramm Gewebe aus Skelettmuskel und Leber gemessen. Das Produkt war lebensfähig und atemfähig.
Mitochondrien, die innerhalb eines Zeitrahmens isoliert wurden, der für klinische und chirurgische therapeutische Eingriffe geeignet ist. Transmissions-Elektronenmikrografien zeigten, dass die isolierten Mitochondrien alle elektronendicht waren, mit Schäden bei weniger als einem von 10.000, die Kontamination betrug weniger als einen von 100.000 im ATP-Assay. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mitochondrien lebensfähig waren und der ATP-Gehalt etwa 11 bis 15 Nanomol pro Milligramm mitochondriales Protein betrug.
Die Analyse der mitochondrialen Atmung wurde mit einer Clark-Elektrode durchgeführt und ergab, dass der Sauerstoffverbrauch etwa 180 MLE Sauerstoff pro Minute betrug. Pro Milligramm mitochondriales Protein lagen die RCI-Werte jeweils bei etwa 2,5, wobei die Leber eine leicht höhere Bewertung aufwies. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine schnelle Methode zur Isolierung reiner und atemkompetenter Mitochondrien aus Ratten-Gewebeproben. Das Verfahren verkürzt die Isolationszeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erheblich auf unter 30 Minuten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mitochondrienforschung
Hintergrund
- Mitochondrien sind für die zelluläre Atmung und die Energieproduktion unerlässlich.
- Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Mitochondrien können zeitaufwendig sein.
- Schnelle Isolationsverfahren können die experimentelle Effizienz verbessern.
- Lebensfähige Mitochondrien sind entscheidend für genaue Stoffwechseluntersuchungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnelleren Methode zur Isolierung von Mitochondrien aus Säugetiergeweben.
- Gewährleistung, dass die isolierten Mitochondrien rein und funktionell intakt sind.
- Vereinfachung anschließender Atmungsanalysen und ATP-Assays.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Rattenleber- oder Skelettmuskelproben.
- Verwendung eines kommerziellen Gewebedissociators für eine effiziente Vermischung.
- Sequenzielle Filtration durch Nylon-Mesh-Filter.
- Wiederinlösung der mitochondrialen Pellets in einem Atmungspuffer.
Hauptergebnisse
- Die Isolationszeit beträgt weniger als 30 Minuten.
- Die isolierten Mitochondrien zeigten Vitalität und Atmungskompetenz.
- Die Ergebnisse wurden durch Atmungsanalysen und ATP-Lumineszenz-Assays bestätigt.
- Die Methode zeigt Potenzial für weiterreichende Anwendungen in der Stoffwechselforschung.
Schlussfolgerungen
- Die schnelle Isolationsmethode ist wirksam zur Gewinnung funktioneller Mitochondrien.
- Diese Technik kann Forschungsprozesse in mitochondrialen Studien vereinfachen.
- Zukünftige Studien könnten ihre Anwendung in verschiedenen Säugetiergeweben untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle Isolierung von Mitochondrien in unter 30 Minuten ermöglicht eine zeitnahe funktionelle Beurteilung für präklinische Stoffwechselstudien und therapeutische Screening-Verfahren. Diese Methode unterstützt die Zielvalidierung, indem sie atmungskompetente Mitochondrien aus Gewebeproben bereitstellt und so die biologische Variabilität in der frühen Entdeckungsphase verringert. Der standardisierte Workflow zur Gewebe-Dissociation und -Filtration verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und erleichtert die Erzeugung konsistenter Daten für Go/No-Go-Entscheidungen in Programmen mit mitochondrialem Target.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der mitochondrialen Funktion als therapeutisches Ziel in Modellen metabolischer Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Ersetzt die manuelle Homogenisierung durch standardisierte Gewebe-Dissociation für eine einheitliche Probenvorbereitung.
- Prädiktiver Wert: Liefert vitale Mitochondrien für Atmungs- und ATP-Assays und unterstützt so die mechanistische Entschärfung von Leitverbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert gereinigte Mitochondrien, die für hochauflösende Atmungs- und lumineszenzbasierte Assays geeignet sind.
- Operativer Wert: Beseitigt wiederholte Zentrifugationsschritte durch differentielle Filtration und erhöht so die Durchsatzrate.
- Bereitschaft für Assays: Stellt konsistente mitochondriale Ausbeuten (~2x10^10 pro 0,18 g Gewebe) für zuverlässige Wirkstoff-Screenings bereit.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die mitochondriale Integrität und Atmungskompetenz, die für präklinische Wirksamkeitstests entscheidend sind.
- Operativer Wert: Vereinbar mit klinischen Zeitrahmen, ermöglicht die Isolierung innerhalb der chirurgischen Eingriffszeiten.
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Biomarker-Abstimmung durch Messungen des ATP-Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Beurteilung der Mitochondrienfunktion ein und bietet einen schnellen, reproduzierbaren Schritt vor der Verbindungsscreening- oder Wirksamkeitsuntersuchung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mitochondrialer Dysfunktionen in Krankheitsmodellen durch funktionelle Messgrößen.
- Screening: Ermöglicht assaysichere mitochondriale Präparationen mit verbesserter Reinheit durch sequenzielle Filtration über 40 µm und 10 µm.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse für die Atmungsanalyse (Sauerstoffverbrauch) und ATP-Lumineszenz, wodurch Vergleiche zwischen Bedingungen erleichtert werden.
- Translationale Forschung: Ermöglicht den Übergang zur präklinischen Validierung mittels respirationskompetenter Mitochondrien, die für Tests ex vivo geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Standardisierter Protokollablauf unter Verwendung eines kommerziellen Gewebe-Dissociators ermöglicht die Übernahme in verschiedene Labore und die Integration in bestehende Arbeitsabläufe.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Sicherheit beim mitochondriellen Target-Engagement durch validierte Atmungs- und ATP-Assays.
- Operationaler Wert: Kürzere Isolationszeit (<30 min) und Wegfall von Dichtegradientenzentrifugationsschritten steigern die Laboreffizienz.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Iterationen bei der Leitsubstanz-Identifizierung, indem zeitnahe mitochondriale Funktionsdaten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem falsch-positive Ergebnisse bei der mitochondriellen Target-Screening reduziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Gewebe und in mitochondrialen Assay-Methoden.
- Setzt den Zugang zu einem kommerziellen Gewebe-Dissociator mit voreingestelltem Zyklus zur Isolierung von Mitochondrien voraus.
- Benötigt sterile Nylon-Mesh-Filter (40 µm und 10 µm) sowie temperaturgesteuerte Zentrifugation (4 °C, 9.000 × g).
- Die Standardisierung über verschiedene Gewebetypen hinweg (z. B. Skelettmuskel, Leber) kann eine Optimierung der Dissociationsparameter erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Methode wurde an Rattengewebe validiert; eine Übertragung auf menschliches oder anderes Säugetiergewebe erfordert zusätzliche Validierung.
