Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, schnell reine und atmungskompetente Mitochondrien aus Rattengewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Gewebeproben assoziiert und homogenisiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, Subin A in das Homogenat einzumischen und auf Eis zu inkubieren.

Anschließend wird das Homogenat filtriert, sich in BSA vermischt und erneut filtriert. Die letzten Schritte bestehen darin, das Filtrat herunterzuschleudern und die mitochondrialen Pellets in Atmungspuffer zu resuspendieren. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass isolierte Mitochondrien lebensfähig und atmungsaktiv sind, und zwar durch eine Atmungsanalyse und einen A-TP-Lumineszenz-Assay

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die mitochondriale Isolationszeiten von 60 bis hundert Minuten angeben, besteht darin, dass lebensfähige und atmungskompetente Mitochondrien in weniger als 30 Minuten isoliert werden können. Allison Mackay, eine Technikerin aus einem kooperierenden Labor, wird kurz vor Beginn den A TP-Lumineszenz-Assay vorführen. Das Subin A wird in einem Milliliter Homogenisierungspuffer aufgelöst und das BSA wird ebenfalls in einem Milliliter Homogenisierungspuffer gelöst.

Beginnen Sie nun mit der Entnahme von zwei frischen Gewebeproben mit einem Sechs-Millimeter-Biopsiestanzer und lagern Sie sie in einem XPBS auf Eis in einem 50-Liter-Zentrifugenröhrchen. Wenn das Gewebe fertig ist, überführen Sie es in ein Dissoziations-C-Röhrchen mit fünf Millilitern eiskaltem Homogenisierungspuffer. Homogenisieren Sie dann das Gewebe, indem Sie den Schlauch an die Gewebedissoziation anpassen und den voreingestellten mitochondrialen Isolationszyklus auswählen.

Wenn Sie fertig sind, stellen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie 250 Mikroliter Sub zu Lyin, einer Stammlösung, hinzu. Mischen Sie dies durch Inversion. Wenn die Mischung gleichmäßig verteilt aussieht, inkubieren Sie das Homogenat 10 Minuten lang auf Eis.

Setzen Sie als nächstes einen 40-Mikron-Maschenfilter auf ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und packen Sie dieses in das Eis. Befeuchten Sie den Filter mit Homogenisierungspuffer und entsorgen Sie den Puffer in einem Abfallbehälter. Wenn alles fertig ist, gießen Sie das Homogenat in das Filtrat.

250 Mikroliter BSA-Stammlösung zugeben und durch Inversion untermischen. Dieser Schritt sollte jedoch für die mitochondriale Proteinanalyse übersprungen werden. Bereite nun zwei weitere vor.

In konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis passt eines mit einem 40-Mikron-Filter und das andere mit einem 10-Mikron-Filter. Befeuchten Sie beide Filter mit etwas Homogenisierungspuffer und entsorgen Sie diesen Puffer. Gießen Sie dann das Homogenat zuerst durch den 40-Mikron-Filter und dann durch den 10-Mikron-Filter.

Diese Filtrationsschritte verbessern die Reinheit der Mitochondrien erheblich. Teilen Sie nun das Filtrat auf zwei vorgekühlte 1,5-Milliliter-Mikrofugeröhrchen auf und zentrifugieren Sie sie bei 9.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren und kombinieren Sie die beiden gereinigten mitochondrialen Pellets.

In einem Milliliter eiskaltem Atmungspuffer ist es wichtig, dass der gesamte Eingriff bei vier Grad Celsius durchgeführt wird. Die gereinigten Mitochondrien können nun getestet werden, um die Stoffwechselaktivität der isolierten Mitochondrien zu bestimmen. Ein A-TP-Lumineszenz-Assay kann mit einem A-TP-Assay-Kit durchgeführt werden.

Bringen Sie zunächst die Reagenzien des Kits auf Raumtemperatur. Bereiten Sie anschließend die HT P-Stammlösung vor und legen Sie sie auf Eis. Der nächste Schritt besteht darin, der lyophilisierten Substratlösung fünf Milliliter Substratpuffer zuzusetzen.

Mischen Sie dies vorsichtig und legen Sie es in die Dunkelheit. Geben Sie dann 100 Mikroliter Atmungspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, die undurchsichtig schwarz ist. Geben Sie 10 Mikroliter der vorbereiteten Mitochondrien in Vertiefungen unterhalb der A-TP-Standards.

Jede einzigartige mitochondriale Probe sollte als Negativkontrolle in dreifacher Platte mit drei Vertiefungen Atmungspuffer allein plattiert werden. Fahren Sie fort, indem Sie 50 Mikroliter Säugetierzelllyselösung in jede Vertiefung geben, sobald sie befüllt ist. Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 120 U/min.

Während der Inkubation sind Verdünnungen des A-TP-Standards von einem 10. Millimolar bis zu einem 10. Mikromolar vorzubereiten. Nach der Inkubation werden 10 Mikroliter jedes A TP-Standards in die entsprechenden Vertiefungen gegeben, die auf der Plattenkarte angegeben sind. Fügen Sie anschließend jeweils 50 Mikroliter der rekonstituierten Substratlösung hinzu.

Nun, dann inkubieren Sie die Platte erneut, wie zuvor für fünf Minuten. Fahren Sie fort, indem Sie die Platten am Plattenleser untersuchen. Öffnen Sie die Software unter.

Erstellen Sie einen neuen Artikel. Klicken Sie auf Experimentieren. Klicken Sie dann auf Standardprotokoll und klicken Sie auf OK.

Wählen Sie in der linken Spalte Protokoll aus. Dann Prozedur Wählen Sie als Nächstes Verzögerung aus, und legen Sie sie auf 10 Minuten fest. Dann okay, der Eintrag.

Wählen Sie nun Lumineszenz aus, lesen Sie sie und wählen Sie sie aus dem Dropdown-Menü. Passen Sie die anderen Einstellungen wie folgt an. Zeit für die Integration des Lesetyps.

Eine Sekunde. Der Filter legt die Position der Optik eines Emissionslochs fest, die obere Empfindlichkeit 100, den vertikalen Versatz der oberen Sonde um einen Millimeter. Nachdem Sie diese Einstellungen geändert haben, klicken Sie auf OK.

Klicken Sie auf Plattenlayout und richten Sie es entsprechend ein. Klicken Sie auf OK. Nachdem Sie nun alles eingestellt haben, klicken Sie auf das Leseplattensymbol in der oberen Reihe und dann auf Lesen.

Wenn sich das Spektralphotometer öffnet, legen Sie die Platte in das Fach mit Vertiefung A eins in der oberen linken Ecke. Nun öffnet sich ein Feld mit der Temperatur, klicken Sie auf OK und fahren Sie mit der Analyse der Daten fort. Skelettmuskelproben mit einem Gewicht von etwa 0,18 Gramm nass ergaben etwa 24 Milliarden Mitochondrien, basierend auf der Partikelgrößenzählung.

Leberproben der gleichen Größe ergaben einige Milliarden mehr. Die Messwerte des Mitochondrien-Hämozytometers wurden mit dem Partikelzähler unterschätzt. Es wurde eine repräsentative Nachverfolgung erhalten, die zeigt, dass isolierte Mitochondrien unter einem Peak mit einem mittleren Durchmesser von etwa vier Zehntel Mikrometern lokalisiert sind.

Dies stimmt mit früheren Berichten überein, in denen der Bi-Acid-Assay verwendet wurde. Das mitochondriale Protein wurde mit wenigen Milligramm pro Gramm Gewebe aus Skelettmuskulatur und Leber gemessen. Das Produkt war lebensfähig und atmungsaktiv.

Mitochondrien isoliert in einem Zeitrahmen, der für klinische und chirurgische therapeutische Eingriffe kompatibel ist. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass isolierte Mitochondrien alle Elektronendellen mit einer Schädigung von weniger als eins zu 10.000 aufwiesen, die Kontamination bei weniger als eins zu hunderttausend A TP-Assay. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mitochondrien lebensfähig waren und dass der TP-Gehalt bei etwa 11 oder 15 Nanomol pro Milligramm mitochondrialem Protein lag.

Die Analyse der mitochondrialen Atmung wurde mit einer Elektrode vom Typ Clark durchgeführt und ergab, dass der Sauerstoffverbrauch etwa 180 MLEs Sauerstoff pro Minute betrug. Für jedes Milligramm mitochondriales Protein lagen die RCI-Werte jeweils bei etwa 2,5 mit einem etwas höheren Leberwert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.