In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende 3D-Stacks mit hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu erhalten und diese über die Zeit durch Mehrpunkt-Zeitraffer-Bildgebung zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs) mit einem lipophilen Farbstoff markiert werden. Die HSCs werden dann in eine Empfängermaus injiziert.

Die Maus wird mit einem maßgeschneiderten Kopfstück und Probenhalter für die Mikroskopie vorbereitet, um eine stabile Tierpositionierung zu gewährleisten. Als nächstes werden die hochauflösenden Stapel von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellnischen erhalten und eine Zeitrafferbildgebung mehrerer Knochenmarkstellen, die HS-PCs enthalten, durchgeführt, schließlich wird eine intravitale konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um die Lokalisation und Bewegung von HSCs im Knochenmarkraum zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunfluoreszenz an Knochenmarkschnitten besteht darin, dass wir in der Lage sind, Informationen auf einer vierdimensionalen Skala zu erfassen, drei Dimensionen plus Zeit.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie hämatologischer Erkrankungen, da sie hilft zu verstehen, wohin wir hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark leiten müssen, um ihre korrekte Funktion zu gewährleisten. Wir hatten die Idee für diese Methode, als wir erkannten, wie wichtig es ist, HS PC's im Laufe der Zeit verfolgen zu können. Diese Methode hilft uns, alle Fragen zu beantworten, die wir im Bereich der Stammzellnische haben, wo wir wissen möchten, wo sich die Stammzellen befinden und wie sie sich im Laufe der Zeit verhalten.

Um mit der Ernte der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu beginnen, wie von diesem Labor in einem früheren Geovideo demonstriert und im Textprotokoll referenziert. Als nächstes fügen Sie der Zellsuspension den lipophilen Farbstoff DID in einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren hinzu. Reiben Sie die Suspension sofort vortexen, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht aus der Lösung ausfällt und die Zellen nicht markiert.

Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu waschen. Zuerst bei 500 mal G für fünf Minuten schleudern und die Flüssigkeit dekantieren. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS und sammeln sie in einer Insulinspritze.

Eine Insulinspritze wird gegenüber einer herkömmlichen Spritze empfohlen, da sie keinen Totraum der Nadel aufweist. Die Verabreichung der gesamten Zellsuspension an die Maus ermöglicht die Injektion von Zellen in eine letal-bestrahlte Maus mittels Schwanzveneninjektion. Stellen Sie die Maus zunächst in eine warme Kammer.

Sobald die Schwanzvene vasoerweitert erscheint, bewegen Sie die Maus in den Rückhaltebehälter. Schiebe die Nadel vorsichtig in die Schwanzvene. Injizieren Sie die Zellen in die Vene.

Es sollte kein Injektionswiderstand auftreten. Lassen Sie die Maus über Nacht stehen. Um den Zellen die Wanderung in die Knochenmarkräume zu ermöglichen, betäuben Sie die Maus und überwachen Sie den Beginn der Tiefennarkose über den Blütenreflex.

Tupfen Sie die Oberseite der Kopfhaut mit 70% Ethanol auf ein Taschentuch. Achten Sie darauf, dass kein Ethanol in die Augen der Maus gelangt. Um den abzubildenden Schädelbereich freizulegen, machen Sie einen kleinen Schnitt am Hinterkopf zwischen den Ohren, indem Sie die Haut mit der Pinzette anheben, während Sie die Haut nach oben halten.

Schieben Sie die Schere unter die Haut und schneiden Sie vorsichtig an der Außenseite des gewünschten Bildgebungsbereichs entlang. Wischen Sie den freiliegenden Knochen mit einem sterilen Wattestäbchen ab, das mit sterilem PBS angefeuchtet ist, um den Knochen feucht zu halten. Dadurch werden übermäßiges Austrocknen und Narbenbildung vermieden, die die Bildqualität beeinträchtigen können.

Mischen Sie als Nächstes eine ausreichende Menge Zahnzement in einem Molkeschiffchen, bis es zu einer Paste wird. Tragen Sie es schnell auf die Unterseite des Autoklaven-Kopfstücks auf, das am Schädel befestigt wird. Bevor der Zement aushärtet, setzen Sie das Kopfstück auf den Schädel der Maus, achten Sie darauf, dass kein Zahnzement auf den Bildgebungsbereich gelangt, und warten Sie, bis er ausgehärtet ist.

Tragen Sie eine kleine Menge Intra-Hydrogel auf, das den Schädel feucht hält, und achten Sie darauf, den Zement beim Trocknen nicht zu stören. Befestigen Sie dann das Kopfstück an der Halterung und befestigen Sie es. Mit der Schraube wird sichergestellt, dass die Rillen in die Kerben des Halters passen.

Entfernen Sie das Hydrogel mit sterilen Wattestäbchen, bevor Sie es in das Mikroskop übertragen. Setzen Sie anschließend die Halterung in den Mikroskoptisch ein und positionieren Sie die Heizmatte unter der Maus. Setzen Sie die Rektumthermometer-Sonde ein und befestigen Sie alles mit Klebeband auf dem Tisch.

Geben Sie einen kleinen Tropfen Augensalbe auf die Augen der Maus, um sicherzustellen, dass sie unter Narkose nicht austrocknen. Die Maus darf während der Bildgebung während der Narkose zu keinem Zeitpunkt unbeaufsichtigt gelassen werden. Zur Fokussierung auf den Schädel über die Okulare.

Füllen Sie zunächst das Schädeldach-Bildgebungsfenster mit gereinigtem sterilem Wasser mit einer Wassertauchlinse. Senken Sie es so ab, dass es den Wassertropfen berührt. Fokussieren Sie mit den Mikroskop-Okularen auf die Oberseite des Schädels.

Positionieren Sie den Bildgebungsbereich auf der zentralen Naht und bewegen Sie sich in Richtung Hinterkopf, um die koronale Naht zu finden. Platzieren Sie die Software als Ausgangsposition in einem Modus für die Aufnahme von XY-Bildern sowie einem Stack mit drei DZ. Stellen Sie die Bildgeschwindigkeit auf 400 Hertz und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel ein.

Stellen Sie die Software so ein, dass mehrere Kanäle erfasst werden, und stellen Sie die Erfassungsmethode so ein, dass die Einstellungen zwischen Stapeln oder zwischen Frames geändert werden. Richten Sie drei unabhängige Aufnahmeeinstellungen ein. Ausschalten der Laserbeleuchtung am Ende der Erfassung jedes Stacks.

Richten Sie dann den ersten sequenziellen Scan für das Knochensignal der zweiten Harmonischen mit zwei Photonen ein. Öffnen Sie den Verschluss für den Multiphotonenlaser und stellen Sie sicher, dass die Verstärkung und der Offset des Multiphotonenlasers korrekt eingestellt sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Laserleistung 12,5 bis 25 % beträgt und der Laser eingeschaltet ist.

Wählen Sie einen geeigneten PMT als einzigen Melder aus und ändern Sie die Farbe in Weiß. Wiederholen Sie den Kanaleinrichtungsvorgang für kombinierte Autofluoreszenz und DID in der zweiten Einstellung. Scannen Sie mit zwei geeigneten Adaptern.

Ändern Sie die Kanalfarbe in Grün für die Autofluoreszenz und Rot für die DID. Richten Sie abschließend den dritten und letzten Scan für die GFP-Erkennung ein. Stellen Sie die Laserleistung der 488-Nanometer-Laserlinie auf etwa 15 % ein. Wählen Sie eine geeignete Photomultiplier-Röhre oder PMT als einzigen aktiven Detektor aus und ändern Sie deren Pseudofarbe in Grün.

Aktivieren Sie einen Live-Imaging-Modus, um einen Vorschau-Scan des ausgewählten Kanals zu starten und die Detektorverstärkung und den Offset für eine optimale Belichtung anzupassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Scan im sequenziellen Fenster und speichern Sie die Einstellungen dieser Mehrkanal-Scans zur einfachen Wiederverwendung. Aktivieren Sie dann die Mehrfachpositionserfassung, die in dieser Software als Mark and Find bezeichnet wird, und setzen Sie die Koordinatenpunkte zurück.

Scannen Sie als Nächstes den Bereich der Knochenbildgebung, beginnend mit dem Schnittpunkt zwischen der zentralen und der koronalen Naht. Scannen Sie die Tiefe des Knochenmarkbereichs sowohl mit Autofluoreszenz als auch mit DID in einer Kompositansicht. Wenn eine Zelle erkannt wird, markieren Sie diese als neue Koordinatenposition, indem Sie auf das Symbol Neue Position hinzufügen auf der linken Seite der Markierung und des Fensters klicken.

Wenn das aktuelle Sichtfeld untersucht wurde, verschieben Sie die Bühne um den Abstand um einen Sichtfeld. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Sichtfeld. Arbeiten Sie sich allmählich um das gesamte Bildgebungsfenster links von der zentralen Naht herum in Richtung der Mausnase.

Sobald die zentrale Nahtgabelung in Sicht ist, begeben Sie sich auf die rechte Seite der Naht und wiederholen Sie den Vorgang. Scannen der linken Seite in umgekehrter Richtung. Markieren Sie die Koordinaten aller neuen Zellen von Interesse mit dem Werkzeug Markieren und Suchen.

Um die Punkte zu überprüfen, legen Sie den oberen und unteren Rand eines Zs-Stapels um jede Zelle für jede Position fest. Fokussieren Sie für jeden Punkt nach oben und unten, und legen Sie die obere und untere Z-Position für die Aufnahme von drei DZ-Stapeln fest. Aktualisieren Sie den einzelnen Punkt in der Markierung und Suche, stellen Sie das Zack-Intervall auf fünf Mikrometer und die Mittelwertbildung für jeden sequenziellen Scankanal auf eine geeignete Qualität ein.

Erwerben Sie einen qualitativ hochwertigen Referenz-Stack für jeden Point of Interest, indem Sie den gesamten Scanvorgang starten. Sobald Sie mit dem qualitativ hochwertigen Scan fertig sind, aktivieren Sie eine Zeitraffereinstellung für die Aufnahme und die Zeitraffereinstellungen. Stellen Sie das Zeitintervall auf fünf Minuten und die Gesamtlaufzeit auf die gewünschte Länge ein.

Wenden Sie diese Einstellungen auf den gesamten Scan an. Dieses Beispiel zeigt, wie die Erfassung von mehr als drei Punkten durchgeführt werden kann. Durch Ändern dieser Einstellungen kann die Scanzeit reduziert werden, um ein Zeitrafferintervall von fünf Minuten zu ermöglichen, indem die Anzahl der Scans reduziert wird, die für die Mittelwertbildung verwendet werden, wodurch die Auflösung auf 512 x 512 Pixel begrenzt wird. Wenn Sie den Scanvorgang in bidirektional umwandeln und/oder die Scangeschwindigkeit auf 600 Hertz oder mehr erhöhen, starten Sie die Bildgebung wie zuvor, indem Sie auf die Startschaltfläche und die demonstrierte Software klicken.

Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, führen Sie die Maus-Euthanasie durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Der speziell angefertigte hochpräzise Maushalter, einschließlich eines Kalvarium-Bildgebungsfensters, ermöglicht eine verlängerte Bildgebung von markierten HS-PCs, die in letal bestrahlte Empfängermäuse injiziert wurden. Hier gezeigt sind 2D-Schichten von 3D-Stapeln von HSPC mit Einzelzellauflösung mit Knochenmarkbereichen von etwa 90 bis 120 Mikrometer Dicke Signal von Kollagen. Der Knochen ist in Weiß dargestellt, DID-markierte Zellen sind rot dargestellt.

Autofluoreszierende Zellen sind gelb und osteoblastische Zellen grün dargestellt. Hier ist ein 40-Zeitraffer-Film der identifizierten HS-PCs zu sehen, der eine DID mit der roten Markierung HSC zeigt, die in der Nähe von osteoblastischen Zellen in grün wandert, sobald sie gemeistert ist. Diese Technik sollte in etwa einer Stunde für die Operation und die erste Bildgebung durchgeführt werden können, gefolgt von der ausreichenden Zeit für die Zeitrafferbildgebung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ziemlich sicher sein, dass Sie in der Lage sind, die Bildgebung des Mauskalbens einzurichten und mehrere HS-PCs im Laufe der Zeit zu betrachten.