In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochauflösende 3D-Stapel zu erhalten, die hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen enthalten, und diese mithilfe von Mehrpunkt-Zeitraffer-Aufnahmen über die Zeit zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen oder HSCs mit einem lipophilen Farbstoff markiert werden. Anschließend werden die HSCs in eine empfängliche Maus injiziert.

Die Maus wird mithilfe eines speziell angefertigten Kopfstücks und einer Probenträgerhalterung für eine stabile Positionierung des Tieres auf die Mikroskopie vorbereitet. Anschließend werden hochauflösende Aufnahmen der Nischen hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen gewonnen, und eine Zeitrafferaufnahme mehrerer Knochenmarkstellen, die HS-PCs enthalten, wird durchgeführt. Letztendlich kommt die intravitale konfokale Mikroskopie und Zweiphotonenmikroskopie zum Einsatz, um die Lokalisation und Bewegung von HSCs im Knochenmarkraum darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunfluoreszenz an Knochenmarkpräparaten besteht darin, dass wir Informationen in einem vierdimensionalen Maßstab erfassen können, also drei Dimensionen plus Zeit.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie hämatologischer Erkrankungen, da sie hilft zu verstehen, wohin hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark gezielt werden müssen, um ihre korrekte Funktion sicherzustellen. Wir hatten erstmals diese Idee für die Methode, als uns bewusst wurde, wie entscheidend es zunächst ist, HS PC über die Zeit verfolgen zu können. Diese Methode hilft uns, alle offenen Fragen im Bereich der Stammzellnische zu beantworten, insbesondere, wo sich die Stammzellen befinden und wie sie sich über die Zeit verhalten.

Beginnen Sie mit der Gewinnung der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, wie es von diesem Labor in einem früheren JoVE-Video gezeigt und im Textprotokoll zitiert wurde. Fügen Sie als Nächstes den lipophilen Farbstoff DID der Zellsuspension in einer Endkonzentration von fünf Mikromolar hinzu. Wirbeln Sie die Suspension unmittelbar an, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht aus der Lösung ausfällt und die Zellen nicht markiert werden.

Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu waschen. Zuerst 5 Minuten bei 500 ×g zentrifugieren und die Flüssigkeit abgießen. Anschließend die Zellen in 200 µL PBS resuspendieren und in eine Insulinspritze überführen.

Es wird eine Insulinspritze gegenüber einer herkömmlichen Spritze empfohlen, da sie keinen toten Raum an der Nadel aufweist, wodurch die Verabreichung der gesamten Zellsuspension ermöglicht wird, um Zellen mittels Schwanzveneninjektion in eine letal bestrahlte Maus zu injizieren. Stellen Sie die Maus zunächst in eine warme Kammer.

Sobald die Schwanzvene sichtbar wird und sich erweitert hat, bewegen Sie die Maus in den Fixierapparat. Schliden Sie die Nadel vorsichtig in die Schwanzvene und injizieren Sie die Zellen in die Vene.

Beim Injizieren darf kein Widerstand spürbar sein. Lassen Sie die Maus über Nacht. Um den Zellen Zeit zu geben, in die Knochenmarksräume zu wandern, betäuben Sie die Maus und überwachen Sie das Einsetzen einer tiefen Narkose mittels des Pfotenreflexes.

Bepinseln Sie die Kopfspitze mit 70 %igem Ethanol auf einem Tuch. Achten Sie darauf, dass kein Ethanol in die Augen der Maus gelangt. Um den zu bildgebenden Calvarialbereich freizulegen, führen Sie einen kleinen Schnitt hinter dem Kopf zwischen den Ohren durch, indem Sie die Haut mit der Pinzette anheben und hochhalten.

Schieben Sie die Schere unter die Haut und schneiden Sie vorsichtig entlang der Außenseite des gewünschten Bildgebungsgebiets. Wischen Sie den freigelegten Knochen mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit steriler PBS-Lösung angefeuchtet wurde, ab, um den Knochen feucht zu halten. Dies verhindert übermäßiges Austrocknen und Narbenbildung, die die Bildqualität beeinträchtigen könnten.

Mischen Sie als Nächstes eine ausreichende Menge Zahnzement in einem Wattestäbchen, bis eine pastöse Masse entsteht. Tragen Sie diese anschließend schnell auf die Unterseite der Autoklav-Kopfplatte auf, die am Schädel befestigt wird. Bevor der Zement aushärtet, setzen Sie die Kopfplatte auf den Schädel der Maus, achten Sie darauf, dass kein Zahnzement im Bildgebungsareal gelangt, und warten Sie, bis der Zement ausgehärtet ist.

Tragen Sie eine kleine Menge Intra-Hydrogel auf, das den Schädel feucht hält, und achten Sie darauf, den Zement beim Trocknen nicht zu stören. Befestigen Sie dann das Kopfstück am Halter und sichern Sie es an Ort und Stelle. Verwenden Sie die Schraube, wobei sichergestellt werden muss, dass die Rillen in die Kerben des Halters eingreifen.

Entfernen Sie das Hydrogel mit sterilen Wattestäbchen, bevor Sie es zum Mikroskop übertragen. Danach setzen Sie den Halter in die Mikroskoptischplatte ein und platzieren die Heizmatte unter der Maus. Führen Sie die rektale Temperatursonde ein und befestigen Sie alles mit Klebeband auf dem Tisch.

Tragen Sie einen kleinen Tropfen Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um sicherzustellen, dass diese nicht austrocknen, während die Maus unter Anästhesie steht. Die Maus darf während des Bildgebungsverfahrens unter Narkose keinesfalls unbeaufsichtigt gelassen werden. Um über die Okulare auf den Schädel zu fokussieren.

Füllen Sie das Bildgebungs-Fenster des Schädeldaches zunächst mit gereinigtem, sterilen Wasser unter Verwendung einer Wassereintauchlinse. Senken Sie die Linse so ab, dass sie den Wassertropfen berührt. Fokussieren Sie die Oberseite des Schädels mithilfe der Mikroskop-Okulare.

Positionieren Sie den Bildgebungs­bereich auf der zentralen Naht und bewegen Sie sich in Richtung Hinterkopf, um die Kronennaht zu finden. Wählen Sie als Startposition einen Modus in der Software, mit dem XY-Bilder sowie ein dreidimensionales DZ-Stapel erfasst werden können. Stellen Sie die Bildgebungs­geschwindigkeit auf 400 Hertz und die Auflösung auf 512 mal 512 Pixel ein.

Stellen Sie die Software so ein, dass mehrere Kanäle erfasst werden, und wählen Sie die Sammelmethode so, dass die Einstellungen zwischen den Stapeln oder zwischen den Einzelbildern geändert werden. Richten Sie drei unabhängige Erfassungseinstellungen ein. Schalten Sie die Laserbeleuchtung am Ende der Aufnahme jedes Stapels aus.

Danach den ersten sequenziellen Scan für das Zwei-Photonen-Signal der zweiten harmonischen Generation am Knochen einrichten. Den Verschluss für den Mehrphotonen-Laser öffnen und sicherstellen, dass Verstärkung und Offset des Mehrphotonen-Lasers korrekt eingestellt sind. Außerdem sicherstellen, dass die Laserleistung zwischen 12,5 und 25 % liegt und der Laser eingeschaltet ist.

Wählen Sie ein geeignetes PMT als einzigen Detektor aus und ändern Sie die Farbe in Weiß. Wiederholen Sie den Kanal-Einrichtungsprozess für die kombinierte Autofluoreszenz und DID unter der zweiten Einstellung. Scannen Sie mit zwei geeigneten PMTs.

Ändern Sie die Kanalfarbe für die Autofluoreszenz auf Grün und für das DID auf Rot. Richten Sie schließlich den dritten und letzten Scan zur GFP-Detektion ein. Stellen Sie die Laserleistung der 488 Nanometer Laserlinie auf etwa 15 % ein, wählen Sie einen geeigneten Photomultiplier (PMT) als einzigen aktiven Detektor aus und ändern Sie dessen Pseudofarbe auf Grün.

Aktivieren Sie einen Live-Bildgebungsmodus, um eine Vorschaufunktion des ausgewählten Kanals zu starten, und stellen Sie den Detektorverstärkungsfaktor und den Offset für eine optimale Belichtung ein. Wiederholen Sie dies für jeden Scan im sequenziellen Fenster und speichern Sie die Einstellungen dieser Mehrkanal-Scans für eine einfache erneute Verwendung. Aktivieren Sie anschließend die als Markieren und Finden bezeichnete Mehrpositionsaufnahme in dieser Software und setzen Sie die Koordinatenpunkte zurück.

Als Nächstes scannen Sie den Knochenbildgebungs-Bereich beginnend am Schnittpunkt zwischen sagittaler und koronarer Naht. Scannen Sie die Tiefe des Knochenmarkbereichs unter Verwendung sowohl der Autofluoreszenz als auch von DID mit einer zusammengesetzten Ansicht. Sobald eine Zelle erkannt wird, markieren Sie dies als neue Koordinatenposition, indem Sie auf das Symbol „neue Position hinzufügen“ auf der linken Seite der Markierung und des Fensters klicken.

Wenn das aktuelle Sichtfeld untersucht wurde, bewegen Sie den Objekttisch um die Distanz eines Sichtfelds. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Sichtfeld. Arbeiten Sie dabei allmählich entlang des gesamten Bildgebungsfensters links von der zentralen Naht in Richtung Maulspitze der Maus.

Sobald die Bifurkation der mittleren Naht sichtbar ist, wechseln Sie zur rechten Seite der Naht und wiederholen Sie den Vorgang. Durchsuchen Sie die linke Seite in umgekehrter Richtung. Markieren Sie die Koordinaten aller weiteren interessierenden Zellen mithilfe des Markierungs- und Auffindwerkzeugs.

Überprüfen Sie die Punkte, indem Sie die obere und untere Grenze eines Z-Stapels um jede Zelle für jede Position festlegen. Fokussieren Sie für jeden Punkt nach oben und unten und legen Sie die Z-Positionen für oben und unten für die Aufnahme eines Drei-DZ-Stapels fest. Aktualisieren Sie den einzelnen Punkt in Mark and Find, stellen Sie das Zack-Intervall auf fünf Mikrometer ein und wählen Sie die Mittelung für jeden sequenziellen Scan-Kanal entsprechend der gewünschten Qualität.

Erfassen Sie einen hochwertigen Referenzstapel für jeden interessierenden Punkt, indem Sie den gesamten Scanvorgang starten. Nach Abschluss des hochwertigen Scans aktivieren Sie eine Zeitraffer-Einstellung für die Aufnahme und die Zeitraffer-Parameter. Stellen Sie das Zeitintervall auf fünf Minuten und die Gesamtlaufzeit auf die gewünschte Dauer ein.

Wenden Sie diese Einstellungen auf den Gesamtscan an. Dieses Beispiel zeigt, wie die Erfassung von mehr als drei Punkten durchgeführt werden kann. Durch die Anpassung dieser Einstellungen kann die Scandauer verkürzt werden, sodass ein Zeitrafferintervall von fünf Minuten möglich ist, indem die Anzahl der zur Mittelung verwendeten Scans reduziert und die Auflösung auf 512 mal 512 Pixel begrenzt wird. Schalten Sie den Scanvorgang auf bidirektional um und/oder erhöhen Sie die Scan-Geschwindigkeit auf 600 Hertz oder mehr. Beginnen Sie die Aufnahme wie zuvor, indem Sie den Startknopf in der demonstrierten Software anklicken.

Nach Abschluss der Bildgebung führen Sie die Euthanasie der Maus gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Der speziell angefertigte hochpräzise Mausehalter mit einem Schädeldach-Bildgebungsfenster ermöglicht eine langandauernde Bildgebung markierter HS-PCs, die in letal bestrahlte Empfängermäuse injiziert wurden. Dargestellt sind hier 2D-Schnitte aus 3D-Stapeln mit Einzelzellauflösung von Knochenmarkarealen mit HSPCs, die etwa 90 bis 120 Mikrometer dicke Signale vom Kollagen aufweisen. Knochen ist in Weiß dargestellt, mit DID markierte Zellen erscheinen rot.

Autofluoreszierende Zellen erscheinen gelb und osteoblastische Zellen grün. Dargestellt ist ein 40-facher Zeitrafferfilm der identifizierten HS-PCs, wobei eine mit A DID markierte HSC in Rot gezeigt wird, die in der Nähe grüner osteoblastischer Zellen migriert. Nach Beherrschung der Methode sollte diese innerhalb von etwa einer Stunde durchführbar sein, einschließlich der Operation und der initialen Bildgebung, gefolgt von der erforderlichen Zeit für die Zeitraffer-Bildgebung.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie sicher sein, die Bildgebung des Mauswadenbeins einrichten und über einen längeren Zeitraum hinweg mehrere HS-PCs untersuchen zu können.