Name: A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung Mycobacterium tuberculosis Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Mesodissektion zur RNA-Extraktion aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die Genexpressionsanalyse von Mycobacterium tuberculosis in Granulomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten die folgenden Auszeichnungen NIH / subawards für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08 und P51OD011104.

1. Kalibrieren Mesodissection Instrument mit 2id Imaging Software Die 2id Imaging-Software wird entweder als Software oder des Programms für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden. Dieser Schritt ist notwendig, um das Bild korrekt zu verfolgen sowie mehrere Dia-Rahmen auszurichten. <ol><li> Schalten Sie Gerät und Computer. </li><li> Offene Software und wählen Sie &quot;Kalibrierungsinstrument&quot;. </li><li> Kalibrieren Stufe Reise mit dem Joystick. Bewegen Bühne obere linke Position. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 1 in Programm. </li><li> Bewegen Bühne, um richtige Position zu senken. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 2 in Programm. </li><li> Kalibrieren Aspiration, indem Sie zuerst &quot;Z-Taste&quot;, um Kopfeinheit zu erhöhen. Drücken Sie auf &quot;absaugen Puls&quot; und &quot;Dissektion&quot;-Taste auf dem Joystick, bis Kolbensteuerstange erreicht Spitzenposition. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 3 des Programms. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Reset absaugen &amp;# 8221; -Taste. Sobald der Kolben hält an der unteren Position drücken Sie die &quot;Set&quot; in Schritt 4. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;scale Register&quot;. </li><li> Zeigen Kalibrierung Lineal auf leere Seite. </li><li> Fokus Mikroskop, wenn nötig. </li><li> Zeichnet eine Linie zwischen den zwei Maßstäbe mit der Maus. </li><li> Geben Sie Abstand in Feld Schritt 2 Drücken Sie die &quot;Compute&quot;-Taste. Gekennzeichnet. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Fadenkreuz&quot;. Drehen Sie die Motordrehzahl auf 1. </li><li> Setzen Sie in den Kopf xScisor Montage. Niederkopf-Anordnung in z-Achse Bereitschaftsstellung mit der Taste &quot;z-Achse&quot;-Taste. HINWEIS: Die Kopfanordnung ist die große Struktur auf der Oberseite der Dissektionsinstrument. Die xScisor wird als Verbrauchs Mühle Bit für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Dissektion engagieren&quot;-Taste am Joystick. HINWEIS: Diese Taste ist auf der Oberseite des Joysticks befinden. </li><li> Drehzentrum visuell definieren. Um dies zu tun, bewegen Zentrum von Fadenkreuz über Drehzentrum mit definierend-Parameter in Schritt 1 des Programms. Verwenden Sie die Pfeile nach oben und unten in der &quot;x&quot; und &quot;y-Achse&quot; Bars, um die Pixel einstellen, um Fadenkreuz auszurichten. Klicken Sie auf &quot;Fertig&quot;-Registerkarte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Home&quot;-Symbol. HINWEIS: Dies wird durch eine Haus-Bild in der rechten oberen Ecke vertreten. </li></ol> 2. Neues Referenzbild <ol><li> Zeigen H &amp; E-Rutsche auf der Bühne. Zeigen lichtundurchlässige Abdeckung oben auf der Folie. Fahren Sie das Gerät mit dem Joystick auf den gewünschten Bereich der H &amp; E-Rutsche. Speichern Sie die generierte Bild. HINWEIS: Entweder die Registerkarte &quot;capture Referenz&quot; oder Registerkarte &quot;sezieren&quot; kann verwendet werden, um diesen Schritt abzuschließen. </li></ol> 3. Richten Tissue für Dissection <ol><li> Klicken Sie auf die &quot;sezieren Gewebe&quot; Option auf dem Home-Bildschirm. </li><li> Füllen Sie die &quot;Betreiber&quot;, &quot;Dissektion Zugangsnummer&quot;, &quot;Referenz-Zugangsnummer&quot;, &quot;xScisor Barcode-Nummer,&quot; &amp; #8220; Dissektion Flüssigkeit Los-Nummer &quot;,&quot; xScisor Größe &quot;und&quot; Beschreibung &quot;in der Registerkarte&quot; Einstellungen &quot;. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;finden Gewebe&quot;. </li><li> Import Referenzbild zuvor gespeichert. </li><li> Legen Sie eine ungefärbte FFPE Rutsche von 5 Mikrometer Dicke auf der Bühne. Bewegen Stufe auf den gleichen Bereich wie der in dem Referenzbild dargestellt. Klicken Sie auf &quot;Bild einfügen&quot;-Registerkarte. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;align&quot;. Benutzen Sie die Maus und die zugehörigen Pfeile, um das Referenzbild auf die ungefärbten Bild auszurichten. </li></ol> 4. Kommentieren Slide <ol><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;kommentieren&quot;. </li><li> Benutzen Sie die Maus, um einen Kreis um den gewünschten Bereich der Folie, die mikrodissektiert werden ziehen. </li></ol> 5. Legen Verbrauchs Mühle Bit <ol><li> Füllen Verbrauchs Mühle bisschen mit gewünschten Puffer, hier PKD-Puffer, indem Sie den Kolben nach oben und unten in einer flüssigen Bewegung mehrere Male. Stellen Sie sicher, um Luft auszuschließenBlasen. </li><li> Heben Z-Achse mit der Taste &quot;Z-Achsen-Button&quot;. </li><li> Legen Verbrauchs Mühle in Bit Maschine. Tun Sie dies, indem Sie den Verbrauchs Mühle Bit in den oberen Teil der Maschine, so dass die weiße Linie auf der Gerätelinien mit der schwarzen Linie auf der Verbrauchs Mühle wenig. Drücken Sie auf &quot;Aspiration-Reset&quot;-Taste, damit Kolben, um in die richtige Position abgesenkt werden. HINWEIS: Es sollte einfach sein, die Verbrauchs Mühle bisschen gleiten. Wenn es nicht sicher, dass die Kerben korrekt ausgerichtet sind. </li><li> Nieder Z-Achse durch erneutes Drücken &quot;Z-Achse&quot;-Taste. </li></ol> 6. Dissect Tissue (Abbildung 4) <ol><li> Öffnen Sie Registerkarte &quot;sezieren&quot;. </li><li> Schalten Motor und Aspiration Geschwindigkeiten bis 1. </li><li> Aktivieren Sie &quot;Show-Tracking&quot;-Box. Anmerkung: Dies ermöglicht es dem Benutzer, den sezierten Bereich während der Dissektion Prozess zu visualisieren. </li><li> Einmal fertig zu sezieren, weiterhin halten Sie die Taste &quot;engagieren&quot; sowie &quot;absaugen &amp; #8221; Joystick-Taste während der Bewegung in einer Richtung gegen den Uhrzeigersinn, um Gewebe zu sezieren. </li><li> Fahren Sie gegen den Uhrzeigersinn, bis die sezieren absaugen &quot;voll&quot; Registerkarte wird rot. </li></ol> 7. Leeren und entfernen Verbrauchs Mühle Bit <ol><li> Legen Sie eine 0,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen unter der Spitze des Verbrauchs Mühle wenig. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Aspiration&quot; Steuerstange schnell auf Probe in Mikrozentrifugenröhrchen auszuwerfen. </li><li> Drücken Sie mit erhöhter Kraft zu gebrauchten Verbrauchs Mühle Bit auszuwerfen. </li><li> Spülen Gewebefragment durch Ziehen Kolben zurück. Drücken Sie den Kolben nach vorne, um verbleibende Probe in Verbrauchs Mühle etwas auszudrücken. Das Gewebefragment wird nun im Mikrozentrifugenröhrchen enthalten sein. </li></ol> 8. Lyse Probe mit Proteinase K Verdauung durch Wärmebehandlung Gefolgt <ol><li> In 70 ul TE pH 8,5, 5 ug Proteinase K, um Gewebeprobe gewonnen. </li><li> Zeigen Probe in programmierbare Heizkörper-Schüttler. </li><li> Vollständige Verdauung mit programmierbaren Heizkörper-Schüttler bei der folgenden Einstellung: 60 ˚ C für 30 min bei 1.500 min; 82 ˚ C für 15 min bei 1.500 min; und 25 ˚ C für 1 min bei 450 UpM. Die Probe ist nun bereit für Downstream-Anwendungen. </li></ol>

<ol><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques%3A+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li>
<li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li>
<li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li>
<li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+what+we+don%27t+know+can%2C+and+does%2C+hurt+us%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+fibrous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22AvanSciBio%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li>
<li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penitentiary+or+penthouse+condo%3A+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li>
<li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li>
<li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor%2C+SigH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li>
<li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li>
<li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li>
<li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro%2C+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li>
<li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
</ol>

Die Autoren beschreiben, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Mesodissection ist eine Technik, die RNA-Extraktion aus pathologischen Läsion gleitet durch eine Vielzahl von Krankheitserregern verursacht angewendet werden können. Es ist eine Notwendigkeit, dass der Benutzer verfolgt das Bild und das Bild richtig ausgerichtet ist. Um dies zu erreichen, muss das Gerät nach den Anweisungen auf dem Imaging-Software kalibriert werden. Bei der Analyse, wenn die Dia-und Interessengebiet seziert nicht passen, muss der Benutzer das Gerät neu kalibriert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Die Proben wurden traditionell von Hand aus entweder ganze Gewebe oder Folien mit einer Nadel und Skalpell mikrodissektiert. Dies erfordert eine klare Trennung zwischen dem Gewebeschnitt des Interesses und der umgebenden Gewebe Abschnitten 2. Mit den Fortschritten in der aktuellen Molekularprofilierungstechnologie hat es einen zunehmenden Bedarf an Gewebe auf zellulärer Ebene zu bewerten. Aufgrund der Einschränkungen der manuellen Mikrodissektion wurden Techniken wie LCM gegründet, um größere Isolation Präzision ermöglichen. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, bestimmte Zellpopulationen aus verschiedenen Zelltypen und Objektträger, die dann für nachfolgende Assays wie Genexpressionsprofile verwendet werden können, zu isolieren. Obwohl sehr effektiv für die nachgeschalteten Tests ist LCM nicht ohne Einschränkungen. Erstens ist LCM ein teurer und zeitaufwendiger Prozess. Darüber hinaus aufgrund der instabilen Natur der RNA, ist es oft eine Herausforderung, qualitativ hochwertige RNA aus Proben LCM 2 zu erhalten. Aufgrund der disadvantages von LCM, werden neue Fortschritte in der Technologie-Mikrodissektion noch benötigt es leichter zugänglich für eine größere Anzahl von Forschern in einem erschwinglichen und zeitkritische Art und Weise zu machen. Ein solcher Fortschritt in der Technologie-Mikrodissektion jetzt ist eine Technik, die als mesodissection bekannt. Bei dieser Technik wird eine Maschine zum Fräsen die kommentierte Gewebeschnitt von Interesse verwendet und saugt sie in eine Mühle Verbrauchs Bit 3. Weiter kann diese Probe in einem Sammelrohr angesaugt und für Downstream-Anwendungen verwendet werden. Die Vorteile dieses Systems sind, dass es wesentlich kostengünstiger und zeitempfindlich. Nach unseren Erfahrungen kann das System die Präparation eines Lungen Granulomgewebe Abschnitt in zehn Minuten. Auf der anderen Seite würde wahrscheinlich erfordern traditionelle LCM Stunden, um den Vorgang abzuschließen. Das System erlaubt es dem Bediener, eine Referenz Schlitten zu laden, um als Vergleichs sowie Werkzeug für Anmerkungen verwendet. Zusätzlich wird ein Bericht generiert umreißt the-Bereich der Folie, die seziert wurde. Es gibt zwei Hauptnachteile auf mesodissection. Obwohl wirksame Extraktion bei mehreren Zellen, ist es schwierig, eine einzelne Zelle zu isolieren. Darüber hinaus ist die Genauigkeit des erzeugten Bildes nicht so klar wie bei Verwendung anderer Abbildungs ​​Mikroskopen. Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die großen Killer der Menschheit weltweit und Ergebnisse aus einer Infektion mit Mtb. In einer Mehrzahl von Individuen, Aerosole Mtb ausgesetzt wird, wird die Infektion latent beschränkt. In mindestens 10 Millionen Menschen jährlich, kommt es zu aktiven TB-Erkrankung 4. Während der latenten Infektion wird Mtb innerhalb pathologische Lungenläsionen als Granulome bekannte enthalten. So wurde argumentiert, dass das Ergebnis der Mtb-Infektion ist auf der Ebene des Granuloms 5 entschieden. Hier zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um Granulome von Mtb microdissect verursacht werden. Die verwendeten Foliensind von FFPE Lungengewebe von infizierten Rhesusaffen. Für den Zweck dieser Demonstration werden wir Granulomen in ihrer Gesamtheit zu sezieren. Wir zeigen auch, dass RNA aus dem wiederhergestellten Gewebe extrahiert werden. Diese Technik kann auf Gewebeproben von verschiedenen anderen Proben aufgetragen und dann für eine Vielzahl von Downstream-Assays verwendet.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Weitere Größen</td></tr><tr><td>verfügbar THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programmierbarer Heiz-Schüttler</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE Extraktionskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE-System&nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel microdissection ansatz zur wiederherstellung<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; spezifische transkripte aus formalin fixierten und in paraffin eingebetteten lung granulome

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Mikrodissektion wurde zur Untersuchung von Gewebe an DNA-, RNA-und Protein-Ebene für über ein Jahrzehnt verwendet. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die häufigste Mikrodissektion Technik heute verwendet. Bei dieser Technik wird ein Laser verwendet, um fokal Schmelze eines thermoplastischen Membran, die einen dehydrierten Gewebeschnitt 1 überlagert. Der Gewebeschnitt Verbund wird dann angehoben und von der Membran getrennt. Obwohl diese Technik erfolgreich zur Gewebeuntersuchung verwendet werden, ist es zeitaufwendig und teuer. Weiterhin ist die erfolgreiche Abwicklung der Verfahren unter Verwendung dieser Technik erfordert die Verwendung eines Lasers, wodurch ihre Verwendung eingeschränkt wird. Eine neue erschwingliche und praktische Mikrodissektion Ansatz namens mesodissection ist eine mögliche Lösung, um die Fallstricke der LCM. Diese Technik nutzt die MESO-1/MeSectr System zu fräsen das gewünschte Gewebe von einem Schlitten montiert Gewebeprobe während gleichzeitig Aufnahme und Abgabe Flüssigkeit, um die gewünschte Gewebeprobe in erholenein Verbrauchs Mühle wenig. Bevor die Dissektion Prozess beginnt, richtet der Anwender die Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) gleitet mit einer Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Referenzrutsche. Danach annotiert der Bediener die gewünschte Dissektion Bereich und weiter zu den entsprechenden Segments zu sezieren. Das Programm erzeugt eine archivierte Bild der Dissektion. Der Hauptvorteil der mesodissection ist die kurze Dauer benötigt wird, um eine Folie zu zerlegen, wobei ein Durchschnitt von zehn Minuten von eingerichtet zu Generation in diesem Versuch probieren. Zusätzlich ist das System deutlich kostengünstiger und bedienerfreundlich. Ein kleiner Nachteil ist, dass es nicht so präzise wie Laser-Capture-Mikroskopie. In diesem Artikel zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um RNA aus Folien aus FFPE Granulome durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht zu extrahieren.

Die oben genannte Protokoll zeigt, wie eine neue mesodissection Technik verwenden, um RNA aus FFPE-Gewebeschnitten zu extrahieren. Dieses Protokoll Wirksamkeit durch FFPE Folien Lunge Granulome von NHP mit MTB verschiedene infektiöse Stadien infiziert gezeigt. Fig. 1-3 sind Bilder des Instruments. Fig. 4 zeigt, wie die Dissektion Prozesses auftritt und das resultierende Bild durch die Software. Tabelle 1 erzeugten zeigt die Ergebnisse der RNA-Extraktion mit ein...

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gewebe aus formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Schnitten mikrodissektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Referenzbild von einem repräsentativen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Schnitt erstellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen entsprechenden ungefärbten, formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Schnitt auf die Instrumentenbühne zu legen und den gewünschten Dissektionsbereich mit dem Referenzbild auszurichten.Anschließend wird der Dissektionsbereich markiert und ein verbrauchbares männliches Bauteil mit Puffer befüllt und in das Gerät eingesetzt. Der letzte Schritt besteht darin, das markierte Gewebe zu dissezieren. Abschließend wird eine Kombination aus RNA-Extraktion, Amplifikation und RT-PCR verwendet, um zu zeigen, wie das dissezierte Gewebe für die Analyse der globalen Genexpression von Mycobacterium tuberculosis in Lungengranulomen infizierter Reeses Maca genutzt werden kann.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tuberkuloseforschung zu beantworten, beispielsweise welche Gene Mycobacterium tuberculosis in menschenähnlichen in-vivo-Nischen während unterschiedlicher infektiöser Zustände der Tuberkulose exprimiert. Darüber hinaus wird diese Daten helfen, die Regulation der Pathogene sowie metabolische und physiologische Unterschiede innerhalb dieser verschiedenen Krankheitszustände zu erklären. Dadurch entstehen spezifische Ansatzpunkte für Wirkstoffe.Das Instrument für die Meso-Dissektion ist mit einem digitalen Mikroskop ausgestattet, das in die beiden ID-Bildgebungssoftware-Systeme integriert ist, sowie mit einem Joystick zur Steuerung der XY-Positionen des Objekttisches. Vor Beginn dieses Verfahrens kalibrieren Sie das Instrument mithilfe der Bildgebungssoftware gemäß der dazugehörigen Publikation, um ein Referenzbild zu erstellen. Platzieren Sie zunächst einen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten oder einen H&E-Schliff auf dem Objekttisch und legen Sie eine undurchsichtige Abdeckung auf den Schliff.Steueren Sie dann das Instrument, indem Sie den Joystick in den gewünschten Bereich des H- und D-Präparats bewegen. Speichern Sie das erzeugte Bild mithilfe der Registerkarte „Capture Reference“, um das zu dissezierende Gewebe auszurichten. Klicken Sie auf der Startseite auf die Option „Dissect Tissue“.Im Register „Setup“ die Operator-Dissektions-Zugangsnummer, die Referenz-Zugangsnummer, die Exc.- oder Barcode-Nummer, die Dissektionsflüssigkeit, die Charge, die Größe und die Beschreibung ausfüllen. Auf den Register „Gewebe suchen“ klicken. Das zuvor gespeicherte Referenzbild importieren.Platzieren Sie einen ungefärbten, formalinfixierten und paraffin-eingebetteten oder FFPE-Schnitt mit einer Dicke von fünf Mikrometern auf dem Objekttisch. Bewegen Sie den Objekttisch in denselben Bereich wie in dem Referenzbild dargestellt.Klicken Sie auf den Reiter „Ausrichten“. Verwenden Sie die Maus und die zugehörigen Pfeile, um das Referenzbild mit dem ungefärbten Bild auszurichten. Abschließend kommentieren Sie die Folie, indem Sie auf den Reiter „Kommentieren“ klicken.Verwenden Sie die Maus, um einen Kreis um den gewünschten Bereich des Objektträgers zu zeichnen, der mikrodisseziert werden soll. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die verbrauchbare Mail-Bit mit dem gewünschten Puffer – in diesem Beispiel PKD-Puffer – füllen, indem Sie den Kolben mehrmals flüssig auf und ab bewegen. Achten Sie darauf, Luftblasen auszuschließen.Bewegen Sie die Z-Achse nach oben, indem Sie die Z-Achsen-Taste drücken. Laden Sie das austauschbare männliche Werkzeug in das Instrument ein. Führen Sie das austauschbare männliche Werkzeug in die Oberseite der Maschine ein, sodass die weiße Markierung am Instrument mit der schwarzen Markierung am austauschbaren männlichen Werkzeug übereinstimmt.Drücken Sie die Aspirations-Reset-Taste, um den Kolben in die korrekte Position abzusenken. Senken Sie die Z-Achse durch erneutes Betätigen der Z-Achsen-Taste ab, um die Gewebe-Dissektion zu beginnen. Öffnen Sie zunächst die Registerkarte „Dissektion“. Danach stellen Sie die Motordrehzahl und Aspirationsgeschwindigkeit auf eins ein.Wählen Sie das Kontrollkästchen „Tracking anzeigen“. Dadurch kann der Benutzer den präparierten Bereich während des Präpariervorgangs visuell verfolgen. Halten Sie die Taste „Engage“ sowie die Absaugtaste gedrückt, während Sie den Joystick gegen den Uhrzeigersinn bewegen.Fahren Sie im Gegenuhrzeigersinn fort, bis die Aspirationsflüssigkeit vollständig aufgesammelt ist und die Anzeigelamelle rot wird. Um die präparierte Probe zunächst zu sammeln, drücken Sie die Z-Achsen-Taste, um die Achse anzuheben, platzieren Sie dann ein 0,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen unter der Spitze des verbrauchbaren männlichen Aufsatzes und drücken Sie schnell den Aspirationssteuerhebel, um die Probe in das Mikrozentrifugenröhrchen auszustoßen. Das Gewebefragment befindet sich nun im Mikrozentrifugenröhrchen.Drücken Sie die Aspirationskontrollstange mit erhöhter Kraft, um das verwendete konsumierbare Mal-Teil auszuwerfen. Das in diesem Video dargestellte Protokoll wurde verwendet, um Lungengranulome aus Resus Maca, die mit Mycobacterium tuberculosis oder MTB in verschiedenen infektiösen Stadien infiziert waren, mikrodisseziert darzustellen. Das Referenzbild zeigt ein H-und-D-gefärbtes Granulom aus einer aktuell infizierten Reus-Maca, wobei der zu dissezierende Bereich grün umrissen ist.Das mittlere Bild zeigt den entsprechenden ungefärbten FFPE-Schnitt mit einer Dicke von fünf Mikrometern vor der Dissektion. Die Bereiche wurden mithilfe der Software ausgerichtet, und der korrelierende Bereich von Interesse ist grün umrandet. Das rechte Bild zeigt denselben ungefärbten FFPE-Schnitt nach der Dissektion, wobei der dissezierte Bereich in Blau dargestellt ist.RNA wurde anschließend aus den mikrodissezierten Granulomen in jedem infektiösen Zustand isoliert, und diese Tabelle zeigt die Ergebnisse. Die RNA-Konzentration wurde mittels eines NanoDrop bestimmt. Anschließend wurde die RNA amplifiziert, gereinigt und revers transkribiert. Die CD N-A-R-T-P-C-R-Ergebnisse bezüglich der 16S-ribosomalen Untereinheit bestätigen das Vorhandensein der MTB-ribosomalen Untereinheit 16S und somit von MTB.Bei den mikrodissezierten Proben wurde genomische DNA aus dem Stamm CDC 1551 von MTB als Standard verwendet, und zwar gemäß diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Gewinnung von DNA-RNA und Proteinen können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen im Bereich Genomik, Transkriptomik und Proteomik zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man FFPE-Proben aus Lungengranulomen mikrodisseziert.Dieses Verfahren ist nicht ausschließlich auf MTB-infizierte Lungengranulome beschränkt, sondern kann auch auf Läsionen durch andere Pathogene angewendet werden.

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Protokoll beschreibt den qPCR-Nachweis von Cytomegalievirus in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Biopsiegewebe, der schnell, sensitiv, spezifisch und nützlich für die Interpretation von mehrdeutigen Hämatoxylin- und Eosin- oder immunhistochemischen Färbemustern ist.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

Die Tuberkuloseinfektion beim Menschen ist ein komplexer Prozess, der in vitro schwer zu modellieren ist. Hier beschreiben wir ein neuartiges 3D-Modell des menschlichen Lungengewebes, das die Dynamik rekapituliert, die während der Infektion auftritt, einschließlich der Migration von Immunzellen und der frühen Granulombildung in einer physiologischen Umgebung.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Dieses modifizierte Extraktionsprotokoll verbessert RNA und DNA-Ausbeuten von gezieltere Regionen von Interesse in histopathologischen Gewebeblöcke.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Wir beschreiben einen Tuberkulose-Molekular-Bakterien-Belastungstest, der nach der Hitzeinaktivierung von Sputum durchgeführt wurde. Die Wärmeinaktivierung macht Sputumproben nicht infektiös und macht die Notwendigkeit von Laboratorien der Eindämmungsstufe 3 für Tuberkulosemolekulartests überflüssig.

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Wir haben eine Gewebeverarbeitungstechnik entwickelt, bei der ein Vibratom und in Agarose eingebettetes Lungengewebe verwendet werden, um Lungenschnitte zu erzeugen, wodurch hochauflösende Bilder der Lungenarchitektur aufgenommen werden können. Wir verwendeten Immunfluoreszenzfärbung, um die räumliche Proteinexpression anhand spezifischer Lungenstrukturmarker zu beobachten.

Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

Wir stellen eine Methode für ein Pilzpathogenesemodell vor, das die natürliche Positionierung von Pilzsporen in den Lungenatemwegen für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie beibehält.

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Die Implementierung einer kostengünstigen, vielseitigen Photobestrahlungstechnik mit der manuellen IBEX-Methode ermöglicht eine optimale Bildgebung von menschlichem Gewebe mit signifikanter nativer Autofluoreszenz. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Multiplex-Bilder von Ganzobjektträgern aus archivierten klinischen Proben mit einem inversen Mikroskop, weit verbreiteten Reagenzien und Open-Source-Software für die Bildausrichtung und -verarbeitung erhält.

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung, Manipulation und Analyse von murinen CAFs, einschließlich funktioneller In-vitro-/In-vivo-Assays , Transkriptomik und computergestützter Analyse. Darüber hinaus wird eine webbasierte Plattform beschrieben, die entwickelt wurde, um die öffentlich zugänglichen Transkriptome von mikropräparierten stromalen und epithelialen Komponenten aus einer Sammlung von menschlichen Brustkrebstumoren zu analysieren.

Krebsassoziierte Fibroblasten aus Mammatumoren der Maus als Werkzeuge für molekulare und computergestützte Studien

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie die Mesodissektion zur RNA-Extraktion aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die Genexpressionsanalyse von Mycobacterium tuberculosis in Granulomen.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung Mycobacterium tuberculosis Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome (Video) | JoVE Journal

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung

Weitere Videos entdecken