Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Kohlenstoff-Platin-Präparat-Replik von biologischem oder anderen Materialien zur Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie herzustellen. Zu diesem Zweck werden Proben, die als Doppel- und Einzelreplikate präpariert sind, extrem schnellen Einfrierraten ausgesetzt, um die Bildung von Eiskristallen zu begrenzen. Anschließend wird die gefrorene Probe durch ferngesteuerte Manipulation bei flüssigem Stickstoff genannten Temperaturen unter Hochvakuum gebrochen, wodurch die Membran entlang der Lipiddoppelschicht geteilt wird und eine extrazelluläre Fläche sowie eine der zytoplasmatischen Seite benachbarte Fläche entstehen.

Als optionaler zusätzlicher Schritt können unterliegende Strukturen sichtbar gemacht werden, indem Wasser durch Positionieren des Kühlmikrotomarms über dem Probenteller von der Oberfläche der gebrochenen Probe abgetragen wird, wodurch ein Temperaturgradient entsteht, der die Sublimation von Wasser von der Oberfläche bewirkt. Anschließend wird eine Replikat durch Aufdampfen von Kohlenstoff und Platin auf die Bruchfläche erzeugt.

Das ursprüngliche Präparat wird aus der Reproduktion aufgelöst, die auf einem Objektträger für die Durchstrahlungselektronenmikroskopie gewonnen wird. Letztendlich dient die Tiefenätzung nach Kryofraktur dazu, dreidimensionale strukturelle Details von Zellmembranen, molekularen Anordnungen und Nanomaterialien bei der Untersuchung mittels Durchstrahlungselektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Untersuchung ultradünner Schnitte besteht darin, dass Objekte von Interesse in drei Dimensionen mit elektronenmikroskopischer Auflösung betrachtet werden können.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den Bereichen Zell- und Molekularbiologie sowie Nanotechnologie beantworten, beispielsweise bezüglich der dimensionalen und strukturellen Eigenschaften von Zellmembranen und der Organisation molekularer und nanomaterialbasierter Anordnungen. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich erkannte, dass ähnliche Studien bereits an eukaryotischen Protisten durchgeführt worden waren und dabei wichtige Entdeckungen gemacht wurden, während verwandte Themen im Zusammenhang mit der menschlichen Gesundheit bisher wenig Beachtung gefunden hatten. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der biologischen Proben für die Gefrierbruch-Gefrierrand-Technik, wie im textlichen Protokoll beschrieben.

Wählen Sie mit feinen Pinzetten und/oder dünnen Spritzenkanülen Gold- oder Kupferprobenträger passender Größe und Form für die zu verarbeitende Probe aus. Positionieren Sie kleine Fragmente der Probe auf der Oberseite eines metallischen Probenträgers. Verringern Sie den Flüssigkeitsgehalt der Probe, indem Sie mit Filterpapier Flüssigkeit vom Rand des Trägers abziehen, bis eine klebrige, leicht leimartige Konsistenz erreicht ist, und zwar für Einzelreplikate.

Verwenden Sie dünne Spritzennadeln, um auf dem Probenträger einen Gewebepfropfen für Doppelreplikate zu erzeugen. Ein weiterer Probenträger wird umgedreht, exakt über den ersten positioniert und vorsichtig auf die Oberfläche der Probe gesetzt. Es entsteht ein Sandwich.

Drücken Sie die Probe nicht zwischen den beiden Stäben heraus. Füllen Sie als Nächstes zwei isolierte Doppelgefäße mit flüssigem Stickstoff. Das erste Gefäß enthält eine Metallspindel mit einer kleinen Vertiefung, die dazu dient, ein kleines Volumen Propan-Gas aus einer handelsüblichen Gasflasche zu verflüssigen.

Der zweite Behälter ist ein Trennbehälter zur kurzfristigen Lagerung gefrorener Proben unter flüssigem Stickstoff. Propan darf nur in einer chemischen Abzugshaube verwendet werden, die für diesen Zweck zugelassen ist. Achten Sie darauf, unnötige Zündquellen zu vermeiden, schützende Kleidung gegen tiefere Temperaturen zu tragen und eine ausreichende Belüftung sicherzustellen, da Propan explosiv ist.

Kann bei Berührung Erfrierungsverletzungen verursachen und wirkt erstickend. Unter Verwendung der Zylinderdüse, die in das Propan eingetaucht ist, öffnen Sie das Zylinderventil und lassen Gas in den Tiegel des ersten Behälters strömen, wo es so schnell wie möglich verflüssigt wird. Nehmen Sie die Probenträger mit feinen Pinzetten auf und tauchen Sie sie mehrere Sekunden lang in das verflüssigte Gas im ersten Behälter ein.

Überführen Sie die Probe anschließend schnell in einen zweiten Behälter mit flüssigem Stickstoff. Sobald die Proben eingefroren sind, lagern Sie sie unter flüssigem Stickstoff, bis sie zum Frakturiergerät überführt werden. Laden Sie die goldenen Probenträger unter flüssigem Stickstoff in einen buchförmigen Doppelreplikat-Halter oder eine Klemmvorrichtung ein und belassen Sie sie dort, bis sie in die Probenkammer eingebracht werden.

Wenn die Kammer ein Hochvakuum erreicht hat und die Probehalterung auf Flüssigstickstoff-Temperatur abgekühlt ist, schalten Sie die Pumpe aus, öffnen Sie die Kammer und bringen Sie die präparierten Probenhalter so schnell wie möglich auf den Probentisch. Schalten Sie dann die Pumpe wieder ein, um das Hochvakuum erneut herzustellen, und stellen Sie mithilfe der elektronischen Temperatursteuerung für die Probehalterung und den Arm die Temperatur des Probentischs auf minus 100 Grad Celsius ein. Leiten Sie außerdem Flüssigstickstoff zum Mikrotomarm, um diesen auf Flüssigstickstoff-Temperatur abzukühlen.

Nach Erreichen eines hohen Vakuums, einer Stufentemperatur von minus 100 Grad Celsius und einer auf Flüssigstickstofftemperatur abgekühlten Mikrotomarmatur öffnen Sie den Doppelreplikat-Probenhalter aus der Ferne, wodurch die Proben auf den Probenträgern gebrochen werden. Optional können die Proben nach dem Bruch geätzt werden, um darunterliegende Strukturen sichtbar zu machen. Zum Ätzen verwenden Sie ein Rasiermesser, das in einer Klammer am Mikrotomarm befestigt ist, um die Oberfläche der Proben abzuschaben. Bringen Sie den gekühlten Mikrotomarm über die gebrochenen Oberflächen und belassen Sie ihn dort für eine bis mehrere Minuten, um das Wasser sublimieren zu lassen und so echte Zelloberflächen, die extrazelluläre Matrix und/oder molekulare Assemblierungen freizulegen.

Aktivieren Sie als Nächstes die Platin-Kohlenstoff-Elektrode oder Widerstandspistole und lassen Sie sie eine dünne Schicht aus Platin-Kohlenstoff aus einem Winkel von 30 bis 45 Grad über die Bruchoberfläche verdampfen. Dies erfordert typischerweise etwa 15 bis 20 Sekunden. Aktivieren Sie anschließend die Kohlenstoff-Elektrode oder Widerstandspistole auf dieselbe Weise und verdampfen Sie eine dünne Kohlenschicht direkt von oben bei 90 Grad auf die Bruchprobe, um die Reproduktion zu stabilisieren. Auch dies erfordert typischerweise etwa 15 bis 20 Sekunden nach Abschluss der Replikation, Schattengebung und Kohlenstoffstabilisierung.

Schalten Sie die Vakuumpumpe und die Kammer aus und nehmen Sie die Probenträgerhalterung vom Gerät ab. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette jeden Gold-Probenträger aus der Doppelreplikat-Booklet-Klammer und lassen Sie ihn mehrere Sekunden lang antauen, bevor Sie den Träger vorsichtig auf eine Wasseroberfläche in einer Muldenplatte senken. Bewegen Sie die Replikate entweder mit einer feinen Drahtschleife oder mit einem herkömmlichen Kupfer-Elektronenmikroskop-Gitter, das mit einer feinen Pinzette gehalten wird, und überführen Sie sie in eine andere Muldenplatte, die 5 % Natriumdichromat in 50 % Schwefelsäure enthält, für eine bis mehrere Stunden. Dieses Bad verdaut das eigentliche biologische Probematerial aus der Replikat.

Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, überführen Sie die Replik erneut auf eine saubere Wasseroberfläche und heben Sie sie auf ein handelsübliches Kupfer-EM-Gitter auf. Bewahren Sie die Trägergitter für die Repliken in im Handel erhältlichen Gitterboxen auf, wo sie jahrelang stabil bleiben. Bei vorsichtiger Handhabung oder zur ultrasruckturellen Untersuchung von Gefrißbruch- und Ätzrepliken betrachten Sie die Repliken im Transmissionselektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung, typischerweise zwischen 50 und 80 Kilovolt.

Nehmen Sie die relevanten Bilder auf Standard-TEM-Film oder mit einer hochauflösenden Digitalkamera auf, wobei sich die Partikel in der Zellmembran an der Basis jedes eukaryotischen Ziliums und Flagellums befinden. Cilium und Flagellum bestehen aus einem Array membranassoziiierter Partikel, die in Strängen angeordnet sind, die den Schaft des Ciliums umgeben und als Zilienhalskette bekannt sind. Spezialisierte Anordnungen von Membranpartikeln treten an der luminalen Grenze von Epithelzellen auf, die eine Clio-Genese durchlaufen.

Diese Partikelanordnungen stellen anfängliche Zilienhalsketten dar, die sich an der Basis neu entstehender und ausgereifter Celia befinden. Verschiedene gefrierbruchmikroskopische Untersuchungen epithelialer Zellen zeigen eine komplexe Organisation anastomosierender Stränge und Rillenstrukturen, die den apikalen Bereich der basolateralen Grenzen umgeben. Ein Bruch durch epitheliale Zellmembranen offenbart Plasmabruchflächen von Tight Junctions, die als Stränge erscheinen, während die extrazellulären Bruchflächen komplementäre Rillen aufweisen.

Schwannsche Zellkontakte treten in Tiefenätzpräparaten einer Vielzahl von Geweben auf und zeigen sich als dichte Ansammlungen von Partikeln auf den Plasmamembran-Bruchflächen sowie komplementäre Vertiefungen auf den extrazellulären Bruchflächen. Die hier gezeigten Flächen stellen ein Beispiel für schnelles Einfrieren mit anschließendem Tiefenätzen und rotatorischem Schatten dar. Die epitheliale Zelle wurde durch das Zytoplasma gebrochen, und eine Plasmamembran-Bruchfläche ist hinter den Pfeilspitzen deutlich sichtbar.

Eine echte Zelloberfläche, sichtbar gemacht durch nachfolgendes Ätzen, sobald die Technik beherrscht ist. Bei korrekter Durchführung kann dieses Verfahren im Zyklus innerhalb von etwa drei Stunden durchgeführt werden und liefert ein bis drei Proben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die einzelnen Schritte stark voneinander abhängen und ein Fehler in einem Schritt dazu führen kann, dass das Ergebnis nach der Entwicklung für die Untersuchung und Beurteilung unbrauchbar ist.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zell- und Molekularbiologie, um zu untersuchen, wie genetische Mutationen strukturelle Anomalien in Zellen hervorrufen, die pathologische Zustände und Krankheiten auslösen.