Name: Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Lernen Sie die Gefrierbruch-Technik zur Präparation biologischer Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung von Membranultrastrukturen.

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Diese Präsentation wurde durch einen Clinical Innovator Award an JLC vom Flight Attendant Medical Research Institute und von der United States Environmental Protection Agency unterstützt. Obwohl die in diesem Artikel beschriebene Forschung ganz oder teilweise von der United States Environmental Protection Agency durch ein Kooperationsabkommen CR83346301 mit dem Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology an der University of North Carolina in Chapel Hill finanziert wurde, wurde sie nicht der von der Agentur geforderten Peer- und Policy-Review unterzogen. und spiegelt daher nicht unbedingt die Ansichten der Agentur wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung zur Verwendung dar.

1. Herstellung von biologischen Proben für Gefrierbruch-/ Gefrier Etch <ol><li> Verwenden eines herkömmlichen EM Fixiermittelformulierung wie 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. Primär Fixierung von biologischen Geweben durchzuführen. HINWEIS: Während es wünschenswert, einige Arten von Proben ohne vorherige Fixierung einzufrieren, Universal Blut übertragene Krankheitserreger Vorsichtsmaßnahmen Mandat entsprechende Fixierung, wo die Probe aus menschlichem Gewebe. </li><li> Folgenden primären Fixierung, Spülung der Probe in dem gleichen Puffer mit 0,2 M Saccharose nicht mehr als 1 h ergänzt. </li><li> Die Probe wird auf eine Kälteschutzmittellösung, bestehend aus 25% Glycerin in 0,1 M Phosphatpuffer für nicht mehr als 1 Stunde. </li></ol> 2. Einfrieren und Lagerung der Proben im Vorfeld der Gefrierbruch <ol><li> Wählen Sie Gold oder Kupfer Probe Stubs von geeigneter Größe und Form für die Probe verarbeitet werden (Abbildung 4 </strong&gt;). </li><li> Mit feinen Pinzette Klasse und / oder kleine Gauge-Spritze Nadeln kleine Fragmente Position der Probe auf der Spitze einer Metallprobe Stummel. <ol><li> Reduzieren Sie den Flüssigkeitsgehalt der Probe zu einer klebrigen, Konsistenz leicht kleben durch Abziehen von Flüssigkeit aus dem Rand der Stub mit Filterpapier. </li><li> Für einzelne Repliken, verwenden kleine Gauge-Spritze Nadeln auf einen Hügel von Gewebe auf der Stub erstellen. Für Doppel Repliken, kehren andere Stummel und die Position genau über dem Stub und legen leicht auf die Probenoberfläche zu schaffen ein Sandwich (5A). Die Probe aus zwischen den beiden Stichleitungen Drücken Sie nicht. </li></ol></li><li> Füllen Sie zwei isolierten Dewargefäßen mit flüssigem Stickstoff. Hinweis: Der erste Behälter nimmt einen Metallpfosten, die einen kleinen Brunnen, der verwendet wird, um ein kleines Volumen von Propangas aus einem handelsüblichen Zylinder (5B) verflüssigt. Der zweite Behälter ist ein partitionierten Speicher / Haltebehälter für kurzely Aufrechterhaltung gefrorenen Proben unter flüssigem Stickstoff. <ol><li> Verwendung der Zylinder Düse in der Propan gut positioniert, öffnen Sie das Flaschenventil und damit das Gas in den Brunnen des ersten Schiffes, wo es verflüssigt fließen. HINWEIS: ACHTUNG !! PROPANE ist explosiv, kann eiskalt Verletzung auf KONTAKT, und ist ein erstickend. Verwenden Propan Nur in einem Chemieabzug für einen solchen Einsatz die Betreuung auch für Fremd Zündquellen zu vermeiden, mit Kleidungsstücken Schutz gegen die niedrigen Temperaturen und die Aufrechterhaltung ausreichende Lüftung zertifiziert. </li><li> So schnell wie möglich, nehmen Sie den Probenhalter mit feinen Pinzette Grade und tauchen sie in das verflüssigte Gas in dem ersten Behälter für einige Sekunden dann schnell in den zweiten Aufnahmebehälter mit flüssigem Stickstoff (5B) zu übertragen. </li><li> Sobald die Proben werden eingefroren, speichern unter flüssigem Stickstoff bis bereit, auf die Gefrierbruch-Anlage zu übertragen. Übertragen Sie die Stichleitungen zu einem größeren Speicher flüssigem Stickstoff Dewar Behälter für längereSpeicher wenn gewünscht, jedoch sollte darauf geachtet werden, nicht zuzulassen, die Stubs zu tauen. </li></ol></li></ol> 3. Betrieb des Gefrierbruch-Gerät und Probenverarbeitung <ol><li> Laden Proben auf dem Messinghalter und in die Kammer <ol><li> Laden die Goldprobe Stubs in einer Broschüre vom Typ Doppel Replik Probenhalter oder Klemmvorrichtung unter flüssigem Stickstoff und es zu halten, bis Sie sie in der Probenkammer (Abbildung 6) zu positionieren. </li><li> Wenn die Kammer hat Hochvakuum (ca. 2 x 10 -6 mbar) erreicht und die Bühne wurde auf Temperatur von flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, schalten Sie die Pumpe zu entlüften die Kammer, und positionieren Sie die Probe montiert Stubs auf dem Probentisch so schnell wie möglich . </li><li> Schalten Sie die Pumpe wieder her, Hochvakuum und elektronische Bühne und Arm der Temperaturregler auf dem Probentisch Temperatur bis -100 ° C und direkte flüssigem Stickstoff auf dem Mikrotom Arm und bri einstellenng es um Temperatur von flüssigem Stickstoff. </li></ol></li><li> Die Bruchprozess <ol><li> Nach Erreichen Hochvakuum, eine Bühne Temperatur von -100 ° C und Mikrotom Arm Temperatur von flüssigem Stickstoff, fern die doppelte Replik Probenhalter dabei zu brechen die Proben auf die Probe Halterungen öffnen (gefrier fracture_movie1.mov). </li><li> Im Fall der Proben für das Ätzen folgende Bruch soll, verwenden Sie eine Rasierklinge in einer Klammer gehalten am Mikrotom Arm zu rasieren (dh Bruch) die Oberfläche der Proben anstelle von Schritt 3.2.1 (gefrier etch_movie2.mov). </li><li> Wenn die zugegefrier Ätzschritt durchgeführt werden soll, positioniert der gekühlten Mikrotoms Arm über die Bruchflächen für eine bis mehrere Minuten. HINWEIS: Dieses Manöver wird sublimiert (dh Etch) Wasser aus der Bruchfläche. Die Wirkung dieser Manöver ist wahr Zelloberflächen, extrazellulären Matrix und / oder molekulare Aggregate durch Sublimation von Wasser zeigen, zusätzlich zu frald Flächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen vorbei. </li></ol></li><li> Metall-Shadowing und Replika Unterstützung Verdunstung mit Elektronenkanonen <ol><li> Aktivieren Sie die Platin / Kohlenstoff-Elektronenkanone oder Widerstand und lassen Sie ihn eine dünne Schicht (ca. 2 nm) aus Platin / Kohlenstoff über der Bruchfläche von einem Winkel von 30 ° zu verdampfen - 45 °. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden. </li><li> Aktivieren Sie die C-Elektronenkanone oder Widerstand, wie in Schritt 3.3.1 und verdampfen eine dünne Schicht von Kohlenstoff zu der gebrochenen Probenoberfläche direkt von oben (90 °), um Unterstützung für die Replik zu geben. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden. </li></ol></li><li> Abruf von Repliken <ol><li> Nach Abschluss der Replikation Abschattung und Kohlenstoff-Stabilisierung, schalten Sie die Vakuumpumpe, Entlüftungs die Kammer, und entfernen Sie die Probenhalterung vom Instrument. </li><li> Mit einem Paar feine Note Zange nehmen Sie jede Gold Probe Stummel aus der DoppelReplik Broschüre / Klemme und lassen Sie es einige Sekunden, bevor sanft Senkung der Stummel auf eine Wasseroberfläche an einer Stelle, Platte (Abbildung 7) auftauen. HINWEIS: Der Kohlenstoff / Platin Reproduktion mit anhaftenden Probenmaterial wird auf die Wasseroberfläche schwimmen. </li><li> Manövrieren Sie die Replikate entweder mit einem feinen Drahtschlinge oder eine herkömmliche Kupfer Elektronenmikroskop Gitter durch feine Note Pinzette und Übertragung auf eine andere Stelle Platte mit 5% Natriumdichromatlösung in 50% iger Schwefelsäure für ein bis mehrere Stunden gehalten. HINWEIS: Dieses Bad verdaut die tatsächlichen biologischen Probenmaterial von der Replik. Voller Stärke Haushaltsbleiche kann für die Dichromat / Schwefelsäure-Lösung ersetzt werden. </li><li> Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Replik auf eine saubere Wasseroberfläche und auf eine Standard-Kupfer-Elektronenmikroskopie Raster abzurufen. (HINWEIS: Replicas können in kleinere Stücke während der Verdauung zu fragmentieren, aber auch sehr kleine Nachbildungen können wesentliche Informationen enthalten und sollte ret seinieved und untersucht.) Store Replik Unterstützung Netze in handelsüblichen Gitterboxen, wo sie seit Jahren stabil mit leichter Handhabung zu bleiben. </li></ol></li></ol> 4. Ultrastrukturelle Untersuchung der Gefrierbruch-/ Etch Replicas <ol><li> Ansicht Replikate in einem Transmissionselektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung typischerweise 50 bis 80 kV. </li><li> Nehmen Sie relevante Bilder auf Standard-TEM-Film oder mit einer hochauflösenden digitalen Kamera. </li></ol>

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Der Autor hat nichts offenzulegen.

In den Jahren nach seiner Einführung und kommerzielle Verfügbarkeit, Gefrierbruch / Etch Verfahren wurden häufig für Untersuchungen der biologischen Membran-Struktur genutzt. In der Tat haben die besten Perspektiven der einige der strukturellen Spezialisierungen von Membranen in der Gefrierbruch / Etch Präparate erhalten. Diese Studien nicht nur dazu beigetragen, das Verständnis der strukturellen Organisation der Membranen, sondern auch Einblicke in Struktur und Funktion bezogen sind. Das Au...

Das Konzept und die praktische Anwendung der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben wurde von Steere 1 mehr als die Hälfte vor einem Jahrhundert eingeführt. Die frühe Gerät angeeignet unterschiedlichen Komponenten in einem Arbeits geschlossene Einheit 1. Die ursprüngliche Vorrichtung wurde modifiziert, und um die kritische Notwendigkeit für die Fernmanipulation, Wartung von Hochvakuum aufzunehmen in handelsübliche Instrumente raffiniert, und die Verdampfung von Kohlenstoff und Metallen, um eine geeignete Prüfungs durch Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung Replik zu erzeugen 2). Das typische Instrument besteht aus einer Hochvakuumkammer mit Probentisch und Mikrotom Arm mit regelbaren flüssigem Stickstoff Durch (Abbildung 1). Die Kammer beinhaltet auch zwei Elektronenkanonen, einer zum Stabilisieren Kohlenstoffverdampfung bei 90 ° Winkel zu dem Objekttisch und der andere für plati positioniertnum / Kohlenstoff-Shadowing in einem einstellbaren Winkel, in der Regel 15 ° - 45 ° (Abbildung 2). Stromversorgung des Gerätes wird angewendet, um die Vakuumpumpe zu betreiben und elektronische Tafeln regeln Temperatureinstellung und Elektronenkanone Kontrolle. Ursprünglich als Mittel gedacht, um eine verbesserte Abbildung von Viren zu erreichen, Gefrierbruch als eine Technik für die Untersuchung und Analyse von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen 2, 3 gewonnen noch mehr Popularität. In der Tat hat dieses Verfahren schon fester Bestandteil der Aufklärung Struktur / Funktions-Beziehungen in Zellen und Geweben, und viele dieser Studien stehen als klassische Beiträge zur Zell-und Molekularbiologie 4-9. Das Hauptziel und Gründe für die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik war Artefakte beobachtbar elektronenmikroskopischen Auflösung, die sich aus chemischen Fixierung und Verarbeitung in herkömmlichen biologischen Elektronenmikroskopie begrenzen. Hier ist das Ziel, chemisch zu begrenzenFixierung und die Probe mit ausreichender Geschwindigkeit und häufig in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, um die Bildung von Eiskristallen und andere Einfrieren Artefakte begrenzen einzufrieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik ein Wiederaufleben des Interesses von Molekularbiologen und Materialwissenschaften Ermittler zur Untersuchung von Nanopartikeln und Nanomaterialien gefunden. Gefrierbruch-und gefrier Etch Bilder zeigen einen dreidimensionalen Charakter und manchmal irren für rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen. Jedoch sind Gefrierbruch-Zubereitungen durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht und ihre wichtigen Beitrag zur Hochauflösung morphologische Studien ist ihre eindeutige Darstellung der Struktur / Funktionselemente der Zellmembranen. Gefrierbruch-Verarbeitung wird durch Einfrieren von Zellen und Geweben mit ausreichender Geschwindigkeit, um Eis Kristallisation und / oder mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin begrenzen eingeleitet. Die Proben werden anschließend unter Vakuum und einem Vertreter gebrochenLICA durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin auf der Bruchfläche erzeugt. Die ursprüngliche Probe wird von der Replik, die auf einem Standard-EM Objektgitter abgerufen wird verdaut. Ein weiterer häufiger Fehlinterpretation der Gefrierbruch-Bilder ist, dass sie den Zelloberflächen darzustellen. Jedoch ist die Grundprämisse der Gefrierbruch ist, dass biologische Membranen durch die Lipiddoppelschicht durch die Bruchverfahren (3) aufgeteilt. Dieser Prozess in biologischen Membranen ergibt zwei Bruchflächen, eine, die die Organisation der Hälfte der Membran benachbart zu dem Zytoplasma, der PF-Fläche zeigt, und eine, die die Hälfte der bimolekularen Membranschicht, die angrenzend an die extrazelluläre ist enthüllt Milieu, das EF-Gesicht. Wahre Zelloberflächen sind nicht Gefrierbruch Bilder dargestellt, sondern nur angezeigt werden, wenn der nachfolgende Schritt hinzugefügt gefrier Radierung nach der Bruchverfahren verwendet wird. Um effektiv zu ätzen zuvor gebrochen Proben Oberfläche detai zeigenl, müssen Proben mit einer schnellen Rate und ohne unetchablecryoprotectant eingefroren werden. Ätzen von Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe enthüllt zugrunde liegenden Funktionen wird durch Positionieren des Kühl Mikrotom Arm über dem Probentisch Erzeugen einer Temperaturdifferenz zwischen der Phase hält die Probe und die Kühl Mikrotom Arm, der bewirkt, daß Wasser von der Oberfläche sublimieren erreicht. Wird Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe während des Gefriert Ätzen Manöver sublimiert, kann Aspekte der aktuellen Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix, Cytoskelett-Strukturen und Molekularanordnungen mit hoher Auflösung offenbart. So Gefrierbruch und gefrier Etch sind nicht austauschbare Begriffe, sondern spiegeln eine schrittweise Prozess von denen die letztere kann nicht je nach den Bedürfnissen der jeweiligen Studie notwendig oder wünschenswert sein. Nach dem Gefrierbruch-/ Gefrier Ätzverfahren, die Bruchflächen sind zu richten Verdampzogentive Mäntel aus Kohlenstoff und Platin, um die Unterstützung und Imaging Gegensatz zu der Replik bieten. Das Platin / Kohlenstoff Abbildungsverdampfung kann unidirektional oder Dreh und wird entweder durch Widerstand oder Elektronenkanonen erfolgt. Unidirektionale Abschattung von einem bekannten Winkel, typischerweise 30 ° - 45 °, ist nützlich bei der Durchführung bestimmter morphometrische Berechnungen. Exemplare, die zu tief Ätzen unterzogen worden sind, in der Regel sind Dreh beschattet und die resultierenden Bilder dieser Proben sind fotografisch für die Bewertung umgekehrt. Die historische sowie ein Ziel der vorliegenden Gefrierbruch-/ Gefrier Ätztechnik ist die chemische Fixierung und Verarbeitung Probe Artefakte, die mit mehr konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie Verfahren verbunden sind, begrenzen. Allerdings bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil in der Fähigkeit, dreidimensionale Detail verleihen und damit Erwerb von morphometrischen Daten in biologischen, Materialwissenschaften zu erleichtern, und nanotechnology Proben. Gefrierbruch-und gefrier Etch Verfahren sind komplex und vielschichtig und einige Aspekte ihrer Anwendung zugeschnitten sind. Diese Präsentation gibt einen Überblick Ansicht der wichtigsten Funktionen des Prozesses und der Leser wird auf umfassende veröffentlichten Protokollen 10, 11, um die Details anzugehen und gestalten den Prozess für bestimmte Forschungsbedarf bezeichnet.

<table><tbody><tr><td>Balzers Gefrierbruch-/Gefrierätzanlage</td><td>Balzers</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>Standardpuffer</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Aldehyd Fixiermittel</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdichromat</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegartikel für Platin/Kohlenstoff-Verdampfung</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan</td><td>diverse Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegartikel für die Elektronenmikroskopie</td><td>Elektronenmikroskopie Elektronenmikroskopie Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technische grundlagen elemente der gefrierbruch-/ gefrier etch in biological elektronenmikroskopie

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Gefrierbruch-/ Gefrier Etch beschreibt einen Prozess, bei dem Proben, in der Regel biologische oder Nanomaterialien in der Natur, werden eingefroren, zerbrochen, und repliziert werden, um ein Kohlenstoff / Platin für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie &quot;cast&quot; beabsichtigt. Proben werden ultraschnellen Gefriergeschwindigkeiten unterworfen, oft in Gegenwart von Kryoschutzmitteln Eiskristallbildung zu begrenzen, mit anschließendem Brechen der Probe in flüssigem Stickstoff gekühlten Temperaturen im Hochvakuum. Die resultierenden gebrochenen Oberfläche repliziert und durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin aus einem Winkel, der Oberfläche verleiht dreidimensionalen Detail auf die Guss stabilisiert. Diese Technik hat sich als besonders aufschlussreich für die Untersuchung von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen bewährt und hat sich für das Verständnis der Zellform zu verwandten Zellfunktion bei. In diesem Bericht, die Geräteanforderungen und technisches Protokoll für die Durchführung überblicken wirGefrierbruch, der zugehörige Nomenklatur und Eigenschaften der Bruchflächen, Variationen über das herkömmliche Verfahren und Kriterien für die Interpretation der Gefrierbruch-Bilder. Diese Technik wurde häufig für ultrastrukturelle Untersuchung in vielen Bereichen der Zellbiologie und hält Versprechen als eine aufstrebende bildgebendes Verfahren für die molekulare, Nanotechnologie und Materialwissenschaften Studien.

Der Schlüssel Prämisse der Gefrierbruch-Bild Interpretation ist, dass Bruchflächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen verleihen beiden Bruchflächen, durch das Übereinkommen der PF-Fläche (Plasma-Fraktur-face) und EF-Gesicht (extrazelluläre Fraktur-face) (Abbildung genannt geben 3). Der PF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das Zytoplasma der Zelle und der EF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das extrazelluläre Milieu. Die G...

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Kohlenstoff-Platin-Präparat-Replik von biologischem oder anderen Materialien zur Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie herzustellen. Zu diesem Zweck werden Proben, die als Doppel- und Einzelreplikate präpariert sind, extrem schnellen Einfrierraten ausgesetzt, um die Bildung von Eiskristallen zu begrenzen. Anschließend wird die gefrorene Probe durch ferngesteuerte Manipulation bei flüssigem Stickstoff genannten Temperaturen unter Hochvakuum gebrochen, wodurch die Membran entlang der Lipiddoppelschicht geteilt wird und eine extrazelluläre Fläche sowie eine der zytoplasmatischen Seite benachbarte Fläche entstehen.Als optionaler zusätzlicher Schritt können unterliegende Strukturen sichtbar gemacht werden, indem Wasser durch Positionieren des Kühlmikrotomarms über dem Probenteller von der Oberfläche der gebrochenen Probe abgetragen wird, wodurch ein Temperaturgradient entsteht, der die Sublimation von Wasser von der Oberfläche bewirkt. Anschließend wird eine Replikat durch Aufdampfen von Kohlenstoff und Platin auf die Bruchfläche erzeugt.Das ursprüngliche Präparat wird aus der Reproduktion aufgelöst, die auf einem

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Schönherr, S., et. al. Kombinierte optogenetische und Gefrierfraktur-Replikat-Immunmarkierung zur Untersuchung der inputspezifischen Anordnung von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von gefrierfrakturierten Nachbildungen von Hirngewebe von Mäusen für die Elektronenmikroskopie. Die gebrochenen und beschichteten Repliken werden verdaut, um Rezeptoren freizulegen. Primäre und goldmarkierte Sekundärantikörper werden...

Immunmarkierung von neuronalen Membranproteinen in einer gefriergebrochenen Probe von Hirngewebe der Maus

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Cryo Elektronenmikroskope, entweder Scanning (SEM) oder Transmission (TEM), werden häufig für die Charakterisierung von biologischen Proben oder anderen Materialien mit einem hohen Wassergehalt 1 verwendet wird. Eine SEM / Focused Ion Beam (FIB) wird verwendet, um Merkmale von Interesse in Proben zu identifizieren und extrahieren eine dünne, elektronentransparenten Lamellen für die Übertragung auf eine Kryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Wir entwickeln eine neue Technik in der Elektronenmikroskopie, „flash-and-freeze“, die die Visualisierung von Membrandynamik mit ms zeitlicher Auflösung ermöglicht. Diese Technik kombiniert die optogenetische Stimulation von Neuronen, die mit Hochdruck-Einfrieren. Hier haben wir die Verfahren zeigen, und die Protokolle im Detail beschreiben.

Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Hier zeigen wir, wie man das Sandwich-Gefriergerät zum schnellen Einfrieren von biologischen Proben verwendet, einschließlich Bakterien, Hefen, kultivierten Zellen, isolierten Zellen, tierischem und menschlichem Gewebe und Viren. Wir zeigen auch, wie man Proben für ultradünne Schnitte nach schnellem Einfrieren vorbereitet.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfraktur von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die aus krebsartigen Urothelzellen stammen. Die Gefrierbruchtechnik enthüllte den Durchmesser und die Form der EVs und - als einzigartiges Merkmal - die innere Organisation der EV-Membranen. Diese sind von immenser Bedeutung, um zu verstehen, wie Elektrofahrzeuge mit den Empfängermembranen interagieren.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse

Lernen Sie die Gefrierbruch-Technik zur Präparation biologischer Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung von Membranultrastrukturen.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

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