Entwicklung eines 3D-Graphen-Elektroden-Dielektrophoretische Geräte

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen laminierten Graphitpapiers, einer mikroskaligen Elektrodenvorrichtung sowie experimentelle Methoden zur Manipulation von Poly-Streubeads oder biologischen Zellen mittels dielektrophoretischer Elektrophorese (DI) oder dielektrophoretischer Kraft (DEP) innerhalb der Vorrichtung. Von nun an wird die dielektrophoretische Kraft als DEP bezeichnet. Die Herstellung der Vorrichtungen erfolgt, indem zunächst abwechselnd Schichten aus 50 µm dickem Graphitpapier und N minus eine Schichten aus 100 µm dickem druckempfindlichem Polymere tape gestapelt werden, wodurch halb Signalelektroden und halb Gegenelektroden entstehen.

Die Schichten werden zusammengepresst, zugeschnitten und anschließend wird der Mikrokolben durch die Struktur gebohrt. Abschließend werden zwei Kupferkontakte an den beiden Enden des Geräts mit silberhaltigem Epoxidharz befestigt. Der zweite Schritt besteht darin, DEP-Medien mit der gewünschten Leitfähigkeit herzustellen.

Poly-Beads werden anschließend in dieser Mediumlösung in einem bestimmten Volumenverhältnis suspendiert. Der dritte und letzte Schritt besteht darin, das Gerät mit der vorbereiteten Beadsuspension zu befüllen, es auf dem Mikroskoptisch zu montieren, das Gerät mit einem Funktionsgenerator zu verbinden und schließlich die DEP einzuleiten. Abschließend wird mithilfe des Mikroskops die DEP-Antwort aufgezeichnet und die Eigenschaften der Zelle oder des Partikels durch weitere Analyse untersucht.

Graphen ist ein vielseitiges Material, das aufgrund seiner Festigkeit sowie seiner thermischen und elektrischen Eigenschaften verwendet wird. Dieses Protokoll nutzt ein kostengünstiges Graphenpapier als leitfähige Elektrodenschicht in einem dreidimensionalen dielektrophoretischen Mikrogerät, das in der Lage ist, Partikel und Zellen für Anwendungen wie die Blutgruppentypisierung oder die medizinische Diagnose von Krankheitszellen zu unterscheiden. Zu den Vorteilen dieses Mikrogeräts mit Graphenpapier-Elektrode zählen eine einfachere Herstellung, eine höhere Probentherapie und die geometrische Vielseitigkeit.

Das dreidimensionale inhomogene elektrische Feld kann große Probenvolumina mit DEP-Kräften manipulieren, die sich einzigartig dadurch auszeichnen, polarisierbare Partikel und Zellen anhand ihrer intrinsischen chemischen und morphologischen Eigenschaften zu unterscheiden. Bauen Sie das laminierte Gerät aus Graphitpapier und Klebeband zusammen. Hier verwenden wir 75 µm dickes hydrophobes Graphitpapier von einem kommerziellen Hersteller und 100 µm dickes druckempfindliches doppelseitiges Klebeband.

Schneiden Sie das Graphenpapier zunächst mit einem Skalpell und einem Lineal in Rechtecke von 6,7 cm × 1,5 cm und schneiden Sie mit einer Schere doppelseitiges druckempfindliches Klebeband in fünf Streifen von 1,3 cm × etwa fünf cm. Legen Sie eine erste Schicht Graphenpapier auf einen sauberen Objektträger. Bedecken Sie langsam ein Ende des Graphenpapiers mit einem Streifen Klebeband, wobei ein Abstand von etwa zwei Millimetern verbleibt, um eine Isolation zwischen zwei benachbarten Schichten Graphenpapier sicherzustellen.

Platzieren Sie die zweite Schicht des Graphenpapiers auf das Klebeband. Versetzen Sie sie gegenüber der ersten Schicht des Graphenpapiers. Üben Sie mäßigen Druck von oben aus, um eine gute Haftung zwischen den Schichten sicherzustellen.

Wiederholen Sie die beiden obigen Schritte für die verbleibenden Schichten, wobei sichergestellt werden muss, dass die oberste und unterste Schicht jeweils aus Graphenpapier bestehen. Entfernen Sie mit einer Schere das überschüssige Klebeband an den Geräterändern, wobei ein kleiner, etwa ein Millimeter breiter Rand verbleibt, um eine dichte Isolation zwischen den Graphenpapierschichten zu gewährleisten. Führen Sie einen schnellen Isolationstest mit einem Multimeter durch, indem Sie die positiven und negativen Prüfspitzen an den elektrischen Anschlüssen auf gegenüberliegenden Seiten des Geräts positionieren.

Ein hoher Widerstand von etwa mehreren hundert Kiloohm weist auf eine gute Isolation zwischen den Schichten hin. Nun ist die laminierte Struktur bereit für das Bohren von Mikrovertiefungen. Wir verwenden ein Mikrofräswerkzeug, um eine Mikrovertiefung in der laminierten Struktur zu bohren.

Hier verwenden wir einen Mikrofräser mit einem Durchmesser von 700 Mikron und einer Nutlänge von etwa 2,1 Millimeter. Die Wahl des Mikrofräsers richtet sich nach dem Durchmesser des Mikrobrunnens und der Dicke des Geräts. Befestigen Sie die laminierte Struktur mit Spannbacken auf der Mikrobohrbühne, positionieren Sie den Fräskopf mithilfe computergestützter Steuerung dicht über der Struktur und leiten Sie Druckluft über das Gerät. Starten Sie die Drehung des Fräsers und senken Sie ihn dann langsam in die Mitte der laminierten Struktur hinein und hindurch.

Halten Sie in einem Abstand, der geringfügig größer ist als die Tiefe der laminierten Struktur, an, um eine gründliche Entfernung von Rückständen aus dem neuen Bohrloch sicherzustellen. Bewegen Sie den Schaftfräser mehrmals auf und ab durch das Mikrobohrloch, um die Innenwand zu glätten.

Die innere Oberfläche des Mikrobrunnens sollte für optimale elektrische Feldgradienten und Lichtdurchlässigkeit so vertikal und sauber wie möglich sein. Schneiden Sie normale Kupferdrähte der Stärke 32 in zwei drei Zentimeter lange Stücke und biegen Sie zwei rechte Winkel in zwei Zentimetern. Mischen Sie manuell etwa 0,75 mm Teil A und etwa 0,75 mm Teil B leitfähigen silberhaltigen Epoxidharzes.

In einem kleinen Behälter befestigen Sie die Drähte, indem Sie vorsichtig Silber-Epoxidharz auf die Spitzen und zwischen alle drei Graphitpapier-Schichten auftragen, um einen guten Kontakt zwischen den Schichten sicherzustellen. Bringen Sie danach den ein Zentimeter langen Draht zwischen zwei beliebige Schichten an, drücken Sie die Schichten leicht zusammen, um überschüssiges Epoxidharz zu entfernen und einen guten elektrischen Kontakt zu gewährleisten. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite der laminierten Struktur.

Stellen Sie das gesamte Gerät auf ein Gestell und trocknen Sie es über Nacht bei 70 Grad Celsius und einem atmosphärischen Druck im Ofen. Entnehmen Sie das Gerät aus dem Ofen und überprüfen Sie die elektrische Isolation zwischen den Elektrodenleitungen. Hier stellen wir Lösungsmedien mit einer Bandbreite von Leitfähigkeiten her, indem wir unterschiedliche Verhältnisse einer vorgefertigten 290 Milliosmol pro Liter Minol-Lösung und PBS mischen.

Dies sind einfache Lösungen, die gewählt wurden, um grob einen Zellkulturpuffer nachzuahmen. Es besteht eine lineare Korrelation zwischen dem Volumenverhältnis dieser beiden Lösungen und der Leitfähigkeit der resultierenden Lösung. Gemischte Polystyrol-Perlen oder biologische Zellen werden mit der vorbereiteten Leitfähigkeitslösung im Verhältnis 1 zu 100 (Volumen pro Volumen) mit einer Pipette versetzt. 10 Mikroliter Polystyrol-Perlen und ein Milliliter einer Medienlösung werden in ein Probenfläschchen gegeben.

Mischen Sie die Probe gründlich durch Vortexen. Befestigen Sie das Gerät mit mäßigem Druck mithilfe modifizierter Papierklammern oder einem gleichwertigen Hilfsmittel an einem Glasobjektträger. Der Halt sollte nahe genug an der Mikrovertiefung sein, um die laminierte Struktur an den Glasobjektträger abzudichten und so ein Austreten der Probe zu verhindern.

Die Klemmspannung sollte so kontrolliert werden, dass die Vorrichtung nicht verformt wird, wodurch die Geometrie der Vertiefung und die Lichtweglänge negativ beeinflusst würden. Verwenden Sie eine 0,5 Millimeter dicke Deckglasplatte und schneiden Sie sie mit einem Diamantschneider so zurecht, dass sie gerade die Mikrovertiefung abdeckt. Zerkleinern Sie das Deckglas auf die benötigte Größe und stellen Sie es beiseite. Injizieren Sie mithilfe dieser Mikrospritze langsam etwa ein Mikroliter der Polystyrol-Perlen-Suspension in die Mikrovertiefung. Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, wiederholen Sie die Injektion bei Auftreten von Blasen und achten Sie darauf, die Wände der Mikrovertiefung mit der scharfen Nadel nicht zu beschädigen. Füllen Sie die Mikrovertiefung leicht über und schieben Sie unmittelbar danach das vorbereitete Deckglas über die Vertiefung, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, Verdunstung vorzubeugen und reproduzierbare Volumina sicherzustellen.

Befestigen Sie für jedes Experiment das vollständige laminierte Mikrogerät am Mikroskoptisch und schließen Sie einen Funktionsgenerator an. Verbinden Sie Krokodilklemmen mit den Kupferleitungen des Geräts, und stellen Sie die Fokuseinstellung der Mikroskopsoftware so ein, dass die Mikrovertiefung deutlich sichtbar ist. In der Bildschirmmitte hier: 100 Hertz bis 10 Megahertz und 15 Volt.

Spitzen-Top-Signale wurden an das Gerät angelegt. Die Perlen wurden in der Mikrovertiefung bei 10-facher Vergrößerung in einem Abstand von einem bis 200 Mikrometern über der Glasobjektträgeroberfläche beobachtet. Klicken Sie auf die Schaltfläche, um die Kameraaufzeichnung und -aufnahme zu starten.

Starten Sie das Signal des Funktionsgenerators zwei Sekunden nach Beginn der Kameraaufnahme. Die Bilder werden mit einer Geschwindigkeit von ein bis fünf Bildern pro Sekunde für etwa fünf Minuten digital gespeichert, um später eine Intensitätsanalyse durchzuführen. Nach Beendigung des Experiments entfernen Sie das Gerät und lösen die Klemmen.

Reinigen Sie sowohl den Objektträger als auch das Gerät mit Seifenwasser. Anschließend gründlich spülen. In Abwesenheit eines elektrischen Feldes sedimentieren Partikel allein aufgrund der Schwerkraft auf den Geräteboden. Ein elektrisches Feld im Bereich von einem Kilohertz zeigt positives DEP-Verhalten an, das durch eine Bewegung entlang des Feldgradienten in Richtung des Graphenpapiers gekennzeichnet ist.

An den Kanten der Mikrovertiefungen werden Elektroden bei elektrischen Feldern über 100 Kilohertz bis in den Megahertz-Bereich hinein beobachtet. Negative DEP, gekennzeichnet durch die Bewegung der Kügelchen entlang des elektrischen Feldgradienten in Richtung Zentrum der Mikrovertiefung, wird festgestellt. Diese mikrofluidische Vorrichtung mit 3D-Graphenpapier-Elektroden lieferte experimentelle Ergebnisse, die gut mit sowohl theoretisch vorhergesagtem Verhalten als auch mit zuvor veröffentlichten experimentellen Ergebnissen übereinstimmen.

Die Geräteherstellung ist äußerst vielseitig. Die bereitgestellten Protokolle können problemlos für Geräte mit mehreren Schichten oder anderen Materialien angepasst werden. Dieses Video beschreibt ein 3D-DEP-Mikrogerät im Batch-Betrieb.

Doch bei zukünftigen Anwendungen könnten Partikel- oder Zellsuspensionen kontinuierlich durch die Mikrovertiefung des Geräts geleitet werden, um eine höhere Durchsatzleistung zu erzielen. Eine Beispiel für die Vielseitigkeit ist die DEP-Sortierung, bei der wasserabsorbierendes Graphenpapier gleichzeitig als Elektrode und Filter für Partikel- oder Zellkonzentratoren fungieren könnte oder sogar als elektrokinetischer biochemischer Sensor. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten die Zuschauer ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mehrlagiges Graphenpapier und ein mikroskaliges Elektrodenbauteil herstellt sowie wie man das Gerät zur Durchführung von Experimenten mit Partikeln oder Zellen bedient.