Name: Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie Samenflüssigkeitsproteine das Eiablageverhalten des Zwitter-Schneckenmodells Lymnaea stagnalis beeinflussen. Diese Methode nutzt künstliche Besamung und Bioassays zur Untersuchung sexueller Selektion.

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Wir danken Herrn Helmus für die Voice-over, CM Popelier, S. und C. Ypenburg Levesque für technische Unterstützung. Diese Forschung wird finanziell von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und der Japan Student Services Organization (JASSO) unterstützt. Diese Veröffentlichung wurde von einer Open-Access-Zuschuss von NWO zu JMK unterstützt.

1. Zuchtanlage <ol><li> Erhalten adulte Tiere Lymnaea stagnalis (L.) aus einer Laborkultur wie der an der VU University. </li><li> Pflegen Sie die kupferarme Wasser bei 20 ° C sowohl in der Zuchtanlage (molluscarium) und experimentelle Tanks, die kontinuierlichen Wasseraustausch. </li><li> Stellen Sie den Hell / Dunkel-Zyklus bei 12 Std.: 12 Std. </li><li> Für Zucht, füttern die erwachsenen Schnecken Pestizid-freie Salat ad libitum, füttern die jungen Jugendlichen mit TetraPhyll (Fischfutter) Flocken. Pflegen Schnecken in separaten Tanks nach ihrem Alter, ab Eiermassen, die innerhalb eines 24-Stunden-Zeitrahmen festgelegt sind. </li><li> Sobald Schnecken werden von den Zuchtbecken sie nicht zurückgegeben werden, um Effekte zu vermeiden entfernt mit der unter leicht veränderten Bedingungen sowie pseudoreplication verhindern gehalten worden. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Isolieren Sie die Schnecken für 1 Woche, und füttern sie ad libitum, um sicherzustellen, that sie haben die volle Spermien und Samenflüssigkeit speichert. </li><li> Bereiten Sie ein Stereo-Mikroskop, eine Dissektion Platte mit Stiften, kleine chirurgische Scheren, groben und feinen Pinzette, eine 10 ml Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung, Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm) und einige Papierhandtücher gefüllt. </li><li> Euthanize eine Schnecke durch die Injektion von MgCl 2-Lösung (in der Regel 3 ml oder mehr für erwachsene Schnecken mit einer Schalenlänge von 31,6 ± 2,1 mm und Nassgewicht von 2,89 ± 0,55 g). Dringen Sie den Fuß mit der Injektionsnadel in einem 45 °-Winkel und injizieren durch leichtes Anlegen von Druck kontinuierlich, bis die Schnecke bleibt entspannt und erweitert (in Sekunden). Entfernen Sie die Injektionsnadel und prüfen, ob die Schnecke wird eingeschläfert (zB durch Überprüfung, ob die Tentakel Rückzugsreflex fehlt). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Schale nach ihrer Krümmung durch die Verwendung groben Pinzette. Auf halbem Weg, sanft lösen Sie den Spindelmuskel aus der Schale durch Kratzen mit der Zange. Sanft drehen ter Schnecke aus der Schale, nach der Wickelrichtung der Schale. </li><li> Legen Sie die Schnecke auf dem Dissektion Platte und fassen Sie das hintere Ende des Fußes. Legen Sie dann einen Stift durch den Kopf und etwas Spannung auf die Schnecke Dissektion erleichtern. </li><li> Lokalisieren der weiblichen Gonoporus, das wird ein Bezugspunkt für die Präparation später. </li><li> Mit den OP-Schere und feinen Pinzette, machen den ersten Schnitt, nur unter dem Rand des Mantels geschnitten und in Richtung der weiblichen Gonoporus. Wenn einer der Schere Klingen unter der Körperwand gedrückt wird, heben ihn leicht, um sicherzustellen, dass nur der Körperwand, und keiner der inneren Organe, geschnitten wird. Weiter Schnitt über dem Gonoporus Richtung Kopf und schneiden in einer geraden Linie. </li><li> Lokalisieren der Prostata (posterior) und Samenbläschen (anterior). Präparieren Sie diese sorgfältig und bewahren Sie sie auf Eis. Verwenden Sie diese, um die Testlösungen, die Samenflüssigkeit und / oder Spermien zu machen. Verwenden physiologischen Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6 H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) als Trägermedium. </li><li> Sammeln der Samenflüssigkeit, die in das Lumen der Prostata sowie der Spermien aus den Samenbläschen vorliegt. Anschließend auszusetzen sowohl in Kochsalzlösung in separaten Fläschchen vorsichtig geben, ihre Inhalte und das Entfernen des Organgewebe mit einer Pinzette. Halten Sie sich auf Eis und nutzen am selben Tag. Später mischen diese Suspensionen, die verschiedenen Behandlungslösungen zu schaffen. </li></ol> 3. Intravaginale Injection <ol><li> Vor dem Start der intravaginale Injektionsverfahren, bereiten eine Silizium-Shell-Form (gemacht, um die Spitze der Schale passen), 1 mm Spritzen, 10-12 cm Silikonschlauch mit einem Durchmesser von 1 mm, abgestumpft Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm ), Grob Zange und der gleichen 10-ml-Spritze mit einer 50 mM MgCl 2-Lösung mit einer scharfen Injektionsnadel angebracht gefüllt. </li><li> Sammeln Sie die Spermien, musste mit der Samenflüssigkeit (oder einzelne Samenflüssigkeit Proteine) in einigen Behandlungen hinzuzufügen; eine biologisch relevante Dosis entspricht 1/3 einer Prostata und Samenbläschen pro Injektion. HINWEIS: In der repräsentativen Ergebnisse Schnitt (Fig. 1) die Ergebnisse eines Experiments mit drei verschiedenen Behandlungen sind gezeigt: Kontrolle (Trägermedium, dh, Kochsalzlösung), Ovipostatin (eines der identifizierten Samenflüssigkeit Proteine) allein und Ovipostatin begleitet von Spermien. Darüber hinaus, um die biologisch relevanten Dosis in anderen Spezies zu schätzen, bestimmen die Gewichtsdifferenz der Prostata von Personen, die vor kurzem gepaart und Individuen, die sexuell-16 isoliert geblieben. </li><li> Herstellung von 1-ml-Spritzen für jede der Testlösungen. Füllen Sie jede Spritze mit einer Lösung, und sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Inneren. </li><li> Setzen Sie einen abgestumpften Injektionsnadel auf jeder Spritze. </li><li> Für die Injektion verwenden A 1mm Silikonschlauch mit einer Länge von mindestens 10 cm. </li><li> Der Silikonschlauch Schieben über die Injektionsnadel, was sicher nicht, um das Rohr zu durchbohren, und entfernen Sie die Luft aus der Röhre durch leichtes Anlegen der Druck auf die Spritze. </li><li> Betäuben eine Schnecke nach dem gleichen Protokoll wie in Punkt 2.3. Dieses Mal stellen Sie sicher nicht mehr als 2-3 ml 50 mM MgCl 2 zu injizieren. </li><li> Legen Sie die Schnecke in der Shell-Form, um es in einer stabilen Lage zu halten. </li><li> Suchen Sie den weiblichen Gonoporus, was eindeutig als weißer Fleck auf der rechten Seite des Tieres, anterior der rechten Tentakel und männlichen Gonoporus sichtbar (diese Position gilt auch für andere Arten von Süßwasserschnecken). Achten Sie auf ungehinderten Zugang haben. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, um das Ende des Silizium-Rohr zu halten und schieben Sie ca. 2-4 mm der Silikonschlauch in die weibliche Gonoporus. </li><li> Druck auf die Spritze vorsichtig anwenden und injizieren 0,03 ml der Testlösung. Warten Sie eine halbe minute, um den Druck in der Röhre, in die weiblichen Trakt, bevor Sie das Rohr ausbreiten können. </li><li> Bringen Sie die behandelt Schnecke seiner Isolation Behälter, wo sie überwacht werden können, und lassen Sie es von Sedierung in der Versuchstank erholen. </li></ol> 4. Bioassay <ol><li> Beschriften Sie jede Schnecke für die Identifikation und Messung der Schale der Länge. Letzteres ist ein guter Indikator für die Größe, die relevant ist, wenn die Quantifizierung Reproduktionsleistung. </li><li> Halten Sie jede Schnecke isoliert in einem 460-ml-Behälter, die perforiert ist, um für den Wasseraustausch im Rahmen der experimentellen Tank zu ermöglichen. Es ist wichtig, dass alle Behälter in der richtigen Orientierung, legen mit den Perforationen in der Richtung des Wasserstroms, um eine effiziente Wasseraustausch zu ermöglichen. </li><li> Während der Bioassay, Schnecken ernähren sich regelmäßig mit einer standardisierten Menge an Salat. Verwenden Sie eine Runde, Metall Puncher zu Kopfsalat geschnitten. In diesem Protokoll Salat Scheiben von 19,6 cm 2 verwendet werden, die die eine angenähertmontieren sie maximal an einem Tag essen. </li><li> Sammeln Sie ein Ei Masse mit der flachen Seite eines Spachtels und kratzen die Eimasse von der Behälterwand. Verwenden Sie den Löffel Seite, um die Eimasse zu sammeln. HINWEIS: Opaque Eiermassen, die gerade verlegt wurden, können nicht zum Scannen verwendet werden (sie transparent innerhalb weniger Stunden nach der Verlegung zu werden). Für die Modellarten in diesem Protokoll, Lymnaea stagnalis, überprüfen Eiermassen jeden Tag, da sie 2-3 Eigelege pro Woche zu produzieren. Dies kann in anderen Arten unterscheiden. </li><li> Scannen Sie die gesammelten Eiermassen digital mit Hilfe eines (Laptop) Computer den Scanner-Treiber enthält, einen Flachbett-Scanner, ein Standard-Millimeter-Skala, eine Spachtel, Übertragungsplatten und Glasfliesen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse auf den Übertragungsplatten und wiederholen, bis die Platten voll sind. Anschließend tupfen Sie die Eiermassen trocken auf Küchenpapier und übertragen Sie sie auf die Glasplatten in der gleichen Reihenfolge wie auf den Übertragungsplatten. </li><li> Drehen Sie jede Fliese auf den Kopf (dieEiermassen werden dem Glasfliese Stick) und sorgfältig legen Sie es auf den Flachbettscanner, nur unter der Millimeterskala. Tragen Sie eine wenig Druck, um die Eigelege zu glätten, die die Eier gleichmäßig verteilen, so dass sie alle in der gleichen Fokusebene sichtbar. Setzen Sie die Fliesen mit einer standardisierten Menge Klebeband um zwei Kanten, um sicherzustellen, dass alle Eier gleichmäßig abgeflacht. </li><li> Stellen Sie die Scanner-Einstellungen. Es ist wichtig, um die Auflösung auf die maximale einzustellen, machen Sie einen Vorschau-Scan, schneiden Sie den Arbeitsbereich und die Helligkeit und den Kontrast. Scannen Sie die Eiermassen. </li><li> Legen Sie jedes Ei Masse im eigenen markierten 20 ml Glasröhrchen für die weitere Entwicklung und Brut. </li><li> Aktualisieren Sie die Wasser in Brut Fläschchen jeden zweiten Tag, um es richtig mit Sauerstoff angereicherten halten. Tun Sie dies nach Jungtier Zahlen und Größe in der folgenden Reihenfolge: Dekantieren / Gießen an (keine Jungtiere), überfüllt (Beginn der Brut) und Extrahieren Sie das Wasser mit einer Pipette (viele Jungtiere). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Messen und Zählen Eier <ol><li> Installieren Sie den frei verfügbaren Bildanalyse-Software ImageJ (NIH, USA) und die Zellzähler Plugin. </li><li> Offene ImageJ sowie ein Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten zu übertragen. Dann öffnen Sie ein gescanntes Bild von Eiermassen in ImageJ. </li><li> Stellen Sie die Skala mit Hilfe der Zoom-Werkzeug, um die Millimeter-Skala zu navigieren. Zoom hinein und stellen Sie das Fenster für 1 mm zu füllen den Bildschirm. Ziehen Sie eine Linie mit der Linienfunktion zwischen den beiden Linien, die 1 mm anzuzeigen. Navigieren Sie zum Analysieren und Set-Skala. In dem Pop-Up-Menü die Option gemessene Länge wird sichtbar, stellen bekannte Strecke zu 1 und Längeneinheit auf mm. Aktivieren Sie das Feld Global, und schließen Sie das Fenster. </li><li> Stellen Sie die bevorzugte Maße (Länge, Breite, Umfang), indem Sie zum Analysieren und Set Maße durch Auswahl Area und Feret-Durchmesser (Länge und Breite). Klicken Sie auf OK, um zu bestätigen und fahren Sie mit der Bildanalyse. </li><li> Um die Eier zu messen, zoom auf einem Ei in der ersten Ei-Masse, die gemessen werden muss. Ein Zoom von 800% empfohlen. Dann, mit der Ellipsenwerkzeug zeichnen Sie ein Oval genau um das Ei, drücken Sie Strg + D, um den Umfang auf das Bild ziehen (zum Messen der gleichen Ei zweimal zu verhindern). Dann drücken Sie Strg + M, um das Maß der Eigenschaften des oval (Länge, Breite, Umfang) aufnehmen; ein Popup-Fenster öffnet sich und zeigt die Messungen. HINWEIS: Die Verwendung der elliptischen Werkzeug, um Eier zu messen gilt nicht für alle Arten. Bei Arten mit ungleichmäßig geformten Eier, verwenden Sie stattdessen die Freihand-Auswahl. </li><li> Messen Sie so viele Eier wie erforderlich, und speichern Sie dann die Maßnahmen. Xls Arbeitsblatt. Optional, kopieren Sie die Daten direkt in einem Arbeitsblatt. </li><li> Anschließend zählen Sie die Eier in einem Eiermasse, mit Hilfe des Zählerfenster und legte die Hand zählt in das Arbeitsblatt. </li><li> Alternativ zählen die einzelnen Eier pro Ei Masse mit Hilfe der Zellzähler-Plug-in. Dazu navigieren Sie zu Plug-Ins,dann, Analysieren und wählen Handy-Zähler. Die Zellzähler Fenster erscheint, prüfen Sie den &#39;halten ursprüngliche &quot;-Feld und drücken Sie&quot; initialisieren &quot;. Eine neue Zählerfenster erscheint, wählen Sie den Fadenkreuz-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und wählen einen Zähler Typ in der Zellzähler-Menü. Zählen Sie die einzelnen Eier durch Klicken auf die einzelnen Eier in den Zellzähler-Fenster. Beachten Sie die Gesamtzahl neben dem Zählertyp im Zellzähler-Menü. Kopieren Sie diese Nummer manuell in eine Tabellenkalkulation oder die Ergebnisse zu erhalten, indem Sie Ergebnisse. </li><li> Graf mehrere Eiermassen innerhalb einer Zählereignis indem Zählertypen, falls erforderlich. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie Samenflüssigkeit und wie dies in einem biologisch sinnvoll testen zu sammeln. Obwohl dieses Verfahren wird hier unter Verwendung des Prostata-Extrakt gezeigt, kann die Wirkung einer einzelnen Samenflüssigkeit gereinigte Protein auch nach dem gleichen Verfahren getestet werden. Offensichtlich in solchen Tests ist es immer wichtig, angemessene Kontrollen (Schein-Behandlungen) enthalten, um sicherzustellen, dass die Verfahren und / oder das Trägermedium nicht beeinflussen die Parameter in Fragen 14,16. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde bereits gezeigt, dass es einen einzigen Samenflüssigkeit Protein, nämlich Ovipostatin, die eine Verringerung der Eiablage 14,16 vermittelt. Dieses Protein, in der Prostata produziert und während der Paarung zusammen mit Spermien übertragen, stellt die erste vollständig charakterisierte Samenflüssigkeit Komponente in einem gleichzeitiger Zwitter und hat, so weit, keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen zeigen. Der Befund, dass OvipostaZinn reduziert Ei Massenproduktion in den Empfänger bestätigt frühere Arbeit angibt, dass Substanzen in der Samenflüssigkeit kann über 13-15 Ei beeinflussen. Durch die Übertragung von biologisch relevanten Mengen (siehe 3.2 16), kann man überzeugend nachweisen, dass es ein Samenflüssigkeit Protein und nicht die Anwesenheit von Spermien selbst, dass die beobachtete Reduktion der Eiablage (Abbildung 1) vermittelt ist. Da wiederholt Erhalt der Samenflüssigkeit durch natürliche Paarung erhöht die Investition pro Ei 15, wird es nun von großer Bedeutung, um andere Parameter der Eiablage zu quantifizieren. Die dargestellte Protokoll bietet nun die notwendigen Verfahren, dies zu tun. Obwohl kein Effekt von Ovipostatin auf Schlupferfolg der Eier durch den Empfänger 16 festgestellt, kann es andere Samenflüssigkeit Proteine, die im Konzert mit diesem Protein handeln. Daher Parameter, die in diesem Zusammenhang quantifiziert werden müssen - neben über Frequenz-und Eiernummern - gehören Eier Größe, hatcHing Zeit, Jungtier Entwicklung und Jungtier groß. Darüber hinaus ist es möglich, Auswirkungen auf andere Prozesse als die weiblichen Eierlegen, wie Spermien Speicherung und Nutzung, sowie die Zuweisung von Ressourcen auf die reproduktiven weiblichen und männlichen Funktion 14,17 aussehen. Offensichtlich ist die vorgestellte Methode instrumental bei der Bewältigung dieser Folgefragen, die beide in Lymnaea stagnalis und anderen Süßwasserschnecken. In der Summe Experimente mit diesem Protokoll zeigen, dass die Samenflüssigkeit übertragen Proteine ​​beeinflussen die weiblichen Fortpflanzungsleistung der Empfänger in diesen gleichzeitige Hermaphroditen. Da nur wenige Studien haben diese gerichtet ist, ist wahrscheinlich sehr viel häufiger bei intern Dünge Hermaphroditen als derzeit in der wissenschaftlichen Literatur reflektiert werden. Vor allem, wenn man bedenkt, dass vor der Paarungspartnerwahl und Spermienkonkurrenz haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in diesen Hermaphroditen 14, spielen die zentrats das Potenzial solcher männlichen Accessoire Drüsenproteine ​​zu sexuell in diesem System gewählt werden. Schließlich hilft diese Forschung, um die Entwicklung von Vorstellung, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​sind von gleicher Bedeutung für die gleichzeitige Hermaphroditen, wie sie für die getrennte sexed-Arten sind zu unterstützen.

Nach der Übertragung werden in der Regel von Spermien von männlichen akzessorischen Drüsen produziert Samenflüssigkeit begleitet. Während einige Ejakulat Komponenten spielen eine Rolle bei der Ernährung und Aktivierung Spermien ein, andere beeinflussen weiblichen Physiologie, um die Befruchtung Erfolg der Samenspender 04.02 zu erhöhen. Solche Effekte werden vor allem für ausgewählte, über sexuelle Selektion, wenn eine Spezies ist sehr promiskuitiv und verfügt über effiziente Speicher Spermien und Samen Verdauung. Unter solchen Bedingungen konkurrieren Samenspender stark für die Befruchtung der Eier 5. Zwar gibt es reichlich Korrelations Beweis für die Bedeutung der Samenflüssigkeit Stoffe für männliche Befruchtungserfolg ist der direkte Nachweis seltener und nur wenige Studien haben in den Details der physiologische Veränderung und / oder Substanzen beteiligt 6 befasst. Bei Arten mit getrennten Geschlechtern (dh Männer und Frauen; Gonochoristen, dh) gibt es ein paar gut untersuchten Modell Spezies, wenn es um Samenflüssigkeit Zusammensetzung und deren Auswirkungen geht. Beispiele hierfür sind die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster 6, die Malaria-Mücke Anopheles gambiae 7, und die rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum 8. Solche Samenflüssigkeit Studien sind viel seltener, wenn es um Arten, die gleichzeitig sind Zwitter (dh Individuen sind funktional männlich und weiblich zugleich), auch wenn diese Art der Fortpflanzung ist im gesamten Tierreich 9 gemeinsamen geht. Die bemerkenswerteste Zwitter Beispiel für die Übertragung eines Zubehördrüsensubstanz ist wahrscheinlich die Erschießung von sogenannten Liebes Darts in Landschnecken 2,10, wo der Stoff von der Samenspender über subkutane Injektion 11,12, also nicht übertragen zusammen mit der Spermatozoen. Aber es gibt viele gleichzeitiger Zwitter, die männliche Accessoire Drüse Produkte zusammen mit ihren Spermien zu übertragen,wie den hier verwendeten Modellarten, der große Teich Schnecke Lymnaea stagnalis. Zurück Forschung hat bereits gezeigt, dass der Erhalt der Samenflüssigkeit beeinflusst die weibliche Reproduktionsleistung dieser Art 13-15, und mehrere der beteiligten Samenflüssigkeit Proteine ​​identifiziert wurden 16,17. Das Gesamtziel dieses Protokoll, das eine Erweiterung der in Koene et al 16 beschriebenen Verfahren ist, ist die Wirkung von Samenflüssigkeit Proteine ​​auf verschiedene Parameter der Eiablage in Schnecken testen. Dies wird durch Zergliederung der Prostata (dh der akzessorischen Drüse Herstellung der Samenflüssigkeit) von sexuell isoliert Donor Schnecken aus einem standardisierten Laborkultur erreicht. Zweitens wird das Spendersamenzellen aus den Samenbläschen gesammelt und verschiedenen Behandlungslösungen hergestellt werden. Anschließend werden die Test Schnecken betäubt und intravaginal mit einer Testlösung (zum Beispiel eingespritzt wird,Prostata-Extrakt allein, Prostata-Extrakt mit Sperma, Sperma allein, allein Trägermedium). Diese Test Schnecken werden dann für die folgenden Tage unter Standardbedingungen überwacht, um Wochen, um die Eiablage zu erfassen. Egg Massen werden gesammelt, digital zum Zählen und Messen verschiedener Parameter gescannt und dann in einzelnen Fläschchen setzen Brut. Nach etwa zwei Wochen werden die Jungtiere gezählt und digital gescannt. Alle Scans, beider Eiermassen und Jungtiere, werden dann mit Hilfe eines frei verfügbaren Bildanalyse-Software analysiert. Aus diesem Protokoll der Laborstamm des großen Schlammschnecke, Lymnaea stagnalis, verwendet, der an der VU Universität in Amsterdam gezüchtet wird. Diese Art dient als Modellsystem für die Untersuchung von Fragen über die sexuelle Selektion und Vermehrung in Hermaphroditen. Relativ großen Größe des Tieres macht es experimentell sehr zugänglich. Darüber hinaus, weil sie als Modell in vielen Arten b verwendet wird,iologische Disziplinen wissen wir bereits viel über die Grundlagen der Biologie dieser Tiere. Dieses Verfahren wird helfen, Fragen zu Prozessen der sexuellen Selektion, die über Samenflüssigkeit Proteinen im allgemeinen vermittelt werden, zu studieren. Darüber hinaus, weil diese gleichzeitige Hermaphroditen, ist es möglich, anzusprechen, ob solche Proteine ​​wirken in ähnlicher und / oder unterschiedlicher Weise, wie sie in der Art, wo die Geschlechter getrennt 16,17 tun.

<table><tbody><tr><td>Fischfutterflocken</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grob- und Feinzange</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,83 mmol/L CaCl2&#183; 2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,76 mmol/L MgCl2&#183; 6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42,69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37,53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zweikomponenten-Silikonspritzen</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm Silikonschlauch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Durchmesser 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abstumpfte Injektionsnadeln (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforierte Behälter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blattlocher aus Metall (19,6 cm2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatel/Löffel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flachbettscanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeterskala</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferplatten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasfliesen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Glasfläschchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male zubehör gland produkte auf die eiablage in schnecken

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In intern Dünge Tiere, Samenflüssigkeit wird in der Regel auf die Spermien hinzugefügt, zusammen die Samen oder Ejakulat. Neben der nährenden und aktivierenden Spermien können die Komponenten in der Samenflüssigkeit beeinflussen auch weiblichen Physiologie der Befruchtung Erfolg des Samenspenders zu erweitern. Während viele Studien solche Effekte bei Arten mit getrennten Geschlechtern berichtet, haben nur wenige Studien dies gleichzeitig Zwitter Tiere gerichtet. Das Video-Protokoll stellt eine Methode, um Auswirkungen von Samenflüssigkeit in Schnecken zu studieren, mit einer gleichzeitig Zwittersüßwasserschnecke, die große Schlammschnecke Lymnaea stagnalis, als Modellorganismus. Während das Verfahren mit vollständiger Prostata Extrakte dargestellt, können die einzelnen Komponenten (dh Proteine, Peptide und andere Verbindungen) der Samenflüssigkeit auf die gleiche Weise getestet werden. Auswirkungen der Erhalt des Ejakulats Komponenten auf die Eiablage kann in Bezug auf die Häufigkeit der Eiablage quantifiziert undsubtiler Schätzungen der weiblichen Reproduktionsleistung wie Ei-Zahlen innerhalb der einzelnen Ei Massen. Die Ergebnisse zeigen, dass Samenflüssigkeit Proteine ​​beeinflussen weibliche Reproduktionsleistung in diesem gleichzeitiger Zwitter, Hervorhebung ihrer Bedeutung für die sexuelle Selektion.

Abbildung 1 zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al 16 für Details und Statistiken (Quelle: Bild 3 von Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Effekt der Ovipostatin auf Ei Massenproduktion von Lymnaea stagnalis. Die Grafik zeigt den Anteil der Tiere, Eier zu legen, nachdem intravaginale Injektion von entweder der Kontrollsubstanz (Kochsalzlösung), Ovipostatin oder Ovipostatin begleitet mit Sperma. N = 15 für jede Behandlung; siehe Koene et al. 2.010 Details und Statistiken. Nachdruck mit Genehmigung von Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Dieses Videoprotokoll demonstriert eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von Samenflüssigkeit in Gastropoden unter Verwendung der hermaphroditischen Süßwasserschnecke Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Wirkungen von Samenflüssigkeitsproteinen auf das Eiablageverhalten einer simultanen Hermaphrodit-Art zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Individuen aus einer standardisierten Laborkultur isoliert und anschließend die Zielorgane disseziert werden. Danach werden die Spermien gesammelt und eine Behandlungslösung hergestellt.Danach werden die Schnecken künstlich besamt. Anschließend werden sie in einen Bio-Test gegeben. Unter Standardbedingungen werden die Gelege gesammelt, gescannt und zur Schlupfphase einzeln in BS gegeben.Nach einigen Wochen werden die geschlüpften Jungtiere gezählt und gescannt, woraufhin alle Bilder mit kostenloser Software analysiert werden können. Dieses Protokoll kann helfen, Fragen zu beantworten, die sich auf Prozesse der sexuellen Selektion beziehen, die über Samenflüssigkeitsproteine vermittelt werden. Da wir hier simultane Hermaphroditen untersuchen, können wir außerdem klären, ob diese Prozesse in ähnlicher oder unterschiedlicher Weise ablaufen wie bei Arten mit getrennten Geschlechtern.Für dieses Protokoll verwendeten wir die große IL in les, die wir an der VU University in Amsterdam züchten. Wir nutzen diese Art, um Fragen zur sexuellen Selektion und Fortpflanzung zu untersuchen. Bei Hermaphroditen ist die Art aufgrund ihrer relativ großen Körperlänge experimentell sehr gut zugänglich.Außerdem wissen wir aufgrund der Verwendung dieser Art als Modellorganismus in vielen verschiedenen biologischen Disziplinen bereits viel über ihre Grundlagenbiologie. Ich heiße Yumi und bin Doktorandin an der Abteilung für Ökologische Wissenschaften.Im vollständigen Universitätskurs werde ich die folgenden Protokolle demonstrieren. Beginnen wir. Um eine zuverlässige Biosa durchzuführen, wird am häufigsten eine Laborkultur verwendet, um störende Variablen auszuschließen.Wasser mit niedrigem Kupfergehalt wird bei 20 Grad Celsius gehalten, und der Licht-Dunkel-Wechsel beträgt 12 zu 12 Stunden. An der VU-Universität wird die Labor-Kultur in Zuchtanlagenbehältern mit kontinuierlichem Wasserwechsel gepflegt. Unter Standardbedingungen werden erwachsene Schnecken bei Libido mit Salat gefüttert und entsprechend ihrer Altersklasse getrennt.Nachdem die Schnecken aus der Zuchtanlage entfernt wurden, gelten sie als in Verwendung und können nicht mehr in die Brutbecken zurückgebracht werden. Vor Beginn des Verfahrens benötigen Sie ein Stereomikroskop, eine Präparationsunterlage mit Nadeln, kleine chirurgische Scheren, Pinzetten, eine Spritze gefüllt mit Magnesiumchloridlösung und einige Papiertücher, um die Schnecke zu töten. Führen Sie die Injektionsnadel im 45-Grad-Winkel in den Fuß ein und üben Sie kontinuierlich sanften Druck aus, bis sich die Schnecke entspannt und ausgestreckt bleibt. Entfernen Sie die Injektionsnadel und vergewissern Sie sich, dass die Schnecke euthanasiert ist.Nehmen Sie anschließend die Pinzette und entfernen Sie vorsichtig die Schale. Folgen Sie der Krümmung und kratzen Sie sanft den Muskel halbwegs von der Schale ab. Drehen Sie die Schnecke dann vorsichtig unter Beachtung der Windungsrichtung der Schale aus dieser heraus.Jetzt wurde die Schnecke aus ihrem Gehäuse entfernt, und das Gehäuse kann entsorgt werden. Anschließend wird die Schnecke auf die Präparationsplatte gelegt und eine Nadel durch das hintere Ende des Fußes gesteckt. Danach wird eine Nadel durch den Kopf gesteckt.Üben Sie etwas Zug auf die Schnecke aus und stecken Sie die Nadel in die Platte. Nun ist die Schnecke bereit zur Dissektion. Schalten Sie das Licht für das Stereomikroskop ein und stellen Sie das Mikroskop ein.Bevor der erste Schnitt durchgeführt wird, ist es wichtig, das weibliche Porus zu lokalisieren. Dies wird später als Referenzpunkt dienen. Führen Sie einen ersten Schnitt direkt unterhalb der Mantelkante durch und schneiden Sie in Richtung des weiblichen Porus.Drehen Sie sich um das Bonno-Pore in Richtung Kopf herum. Achten Sie darauf, nur die Haut zu schneiden und keine Organe zu verletzen, und schneiden Sie in einer geraden Linie. Für diese Studie werden wir die Prostata und die Samenbläschen zur Gewinnung von Samenflüssigkeit bzw. Spermien herauspräparieren.Beachten Sie, dass die Schnecken für volle Spermien- und Samenflüssigkeitsreserven eine Woche lang isoliert und ad libitum gefüttert werden sollten. Die Dissektion erfolgt wie zuvor beschrieben. Die Samenbläschen befinden sich im hinteren Bereich des Tieres.Anschließend wird die Prostata in Kochsalzlösung suspendiert und auf Eis gelegt. Später werden diese mit den Behandlungslösungen gemischt.Vor der intravaginalen Injektion wird das gesammelte Sperma in einer entsprechenden Dosis dem Samenflüssigkeit oder einzelnen Proteinen zugesetzt. Für diese künstliche Befruchtungstechnik benötigen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die die Testlösung enthält, und einen Injektionsnadeln an der Spritze befestigen, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen in der Spritze für die Injektion befinden. Verwenden Sie das Silikonrohr vorsichtig. Schieben Sie das Silikonrohr über die Injektionsnadel.Stellen Sie sicher, dass der Schlauch durchstochen ist, und entfernen Sie die Luft aus dem Schlauch. Vor der Injektion muss die Schnecke sediert werden. Dies erfolgt nach dem gleichen Protokoll wie in Kapitel zwei.Die Schnecke erh&auml;lt eine Dosis von zwei bis drei Milliliter 50 Mikromolar Magnesiumchlorid. Wenn die Schnecke ausreichend sediert und entspannt ist, legen Sie sie zur Stabilisierung in die Form. Nehmen Sie anschlie&szlig;end das Ende des Silikonschlauchs mit einer feinen Pinzette und schieben Sie ihn vorsichtig in die weibliche &Ouml;ffnung.Üben Sie dann vorsichtig Druck auf die Spritze aus und injizieren Sie sorgfältig das vorgeschriebene Volumen der Testlösung. Warten Sie eine halbe Minute, bis sich der Druck im Schlauch im weiblichen Organ ausgebreitet hat. Danach entfernen Sie den Schlauch vorsichtig und stellen die Schnecke in ihren spezifischen Behälter zurück.Schließlich wurden Schnecken künstlich besamt. Sie können in ihre Versuchstanks transportiert werden und der Bios-Bioassay kann beginnen. Die Schnecken erholen sich nach einigen Stunden von der Sedierung. Bioassays.Für die sexuelle Selektion dauern Experimente normalerweise zwei Wochen, bevor die Biosa gestartet werden kann. Es ist wichtig, alle Individuen in getrennten Behältern unterzubringen und sie zu beschriften. Anschließend messen Sie die Länge des Gehäuses jeder Schnecke.Dies ist ein guter Indikator für ihre Größe, die Auswirkungen auf das sexuelle Verhalten haben kann. Danach werden die Schnecken in einen Versuchstank gegeben. Dieser Tank weist die gleichen Standardbedingungen wie die Zuchtanlage auf.Wie im ersten Kapitel erläutert, ist es wichtig, die Behälter in der richtigen Ausrichtung anzubringen, sodass die Öffnungen der Wasserströmung im Tank folgen. Während der Bioassays müssen die Schnecken regelmäßig gefüttert werden. Eine Standardmenge an Lattichscheiben wird mit einem metallenen Lochstecher ausgeschnitten.Eine ausreichende Dosis besteht aus zwei Scheiben alle zwei Tage. Bei der Modellart, lumia stauss, sollten die Schnecken alle zwei Tage auf Eimassen überprüft werden. Diese Eimassen werden zur Durchführung von Messungen gesammelt.Für das Scannen der Eier benötigen Sie einen Laptop mit dem Scanner-Treiber, einen Flachbettscanner, ein standardmäßiges Millimetermaß, einen Eierlöffel zum Übertragen der Platten sowie Glasplatten, die auf die Eiermassen gelegt werden. Nehmen Sie zunächst den Löffel und kratzen Sie die Eiermassen von den Behälterwänden ab. Eiermassen, die undurchsichtig sind, wurden gerade erst abgelegt und können nicht verwendet werden.Platzieren Sie bei diesem Messvorgang die Eimassen auf die Transferplatten und wiederholen Sie diese Schritte, bis die Platten voll sind. Danach bringen Sie die Eimassen in derselben Reihenfolge wie auf den Transferplatten auf die Glasscheiben an. Die Eimassen haften an der Glasscheibe; drehen Sie diese um und platzieren Sie sie vorsichtig direkt unterhalb der Skala auf dem Flachbettscanner.Üben Sie dann Druck auf die Platten aus, um die Eimassen zu zerdrücken. Dadurch werden nun alle Eier gleichmäßig verteilt, sodass sie gleich gut gescannt werden können. Vor dem Scannen wird empfohlen, die Einstellungen für das beste Ergebnis anzupassen.Beim Scannen ist es wichtig, die Auflösung auf das Maximum einzustellen, um einen Vorschauscann durchzuführen, anschließend den Arbeitsbereich zuzuschneiden und schließlich Helligkeit und Kontrast anzupassen, bevor der endgültige Scan erfolgt. Nach dem Scannen werden die Eimassen in eigene beschriftete Gefäße gegeben, um dort zu reifen und zu schlüpfen. In diesen Gefäßen wird das Wasser jeden zweiten Tag erneuert, um den Sauerstoffgehalt auf einem angemessenen Niveau zu halten.Wenn mehrere Schnecken schlüpfen, sollten unterschiedliche Techniken zur Wassererneuerung angewendet werden. Die beste Reihenfolge ist zunächst das Gießen oder Überlaufen und später das Absaugen des Wassers mit einer Pipette. Öffnen Sie ein Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten und ein Foto aus ImageJ zu erfassen. Verwenden Sie zunächst das Zoom-Werkzeug, um zur Millimeterskala zu navigieren.Vergrößern Sie die Ansicht und passen Sie das Fenster so an, dass ein Millimeter den gesamten Bildschirm ausfüllt. Zeichnen Sie mithilfe des Linienwerkzeugs eine Linie zwischen den beiden Markierungslinien. Gehen Sie anschließend zu Analysieren und dann zu Maßstab festlegen.Im Popup-Menü sehen Sie die gemessene Länge, die den bekannten Abstand auf eins und die Einheit auf Millimeter anpasst. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen „global“ und schließen Sie das Fenster. Nachdem nun der Maßstab festgelegt wurde, können wir auf die ersten Eiermassen heranzoomen, bis zu 800 %. Verwenden Sie das elliptische Werkzeug, um den Umfang der Eier zu zeichnen.Drücken Sie D, um den Umfang zu zeichnen. Dies verhindert, dass dasselbe Ei zweimal gemessen wird. Drücken Sie M, um den Umfang zu messen.Es öffnet sich ein Fenster, sobald genügend Daten gesammelt wurden. Das Datenfenster kann als Excel-Datei gespeichert werden. Die Daten können auch direkt in ein Arbeitsblatt kopiert werden.Wenn die bevorzugten Messungen im Popup-Fenster nicht angezeigt werden, können diese angepasst und analysiert werden. Die Einstellung der Messungen sowie die Zählung der einzelnen Eier pro Eiermasse können auch mithilfe des Cell-Counter-Plugins durchgeführt werden. Navigieren Sie zu Plugins.Danach den Zellzähler analysieren und auswählen. Das Fenster des Zellzählgeräts wird angezeigt. Überprüfen Sie das Kontrollkästchen „Original beibehalten“ und drücken Sie auf Initialisieren.Ein neues Zählfenster ist erschienen. Wählen Sie das Kreuz-hier-Werkzeug aus der Symbolleiste aus. Danach wählen Sie einen Zählertyp im Zellzählermenü aus.Durch Anklicken im Zellzähler-Fenster werden die Eier gezählt. Die Gesamtanzahl befindet sich neben dem Zählertyp im Zellzähler-Menü. Mit dem Zellzähler können mehrere Eiermassen gezählt werden.Zählerarten können nach Bedarf hinzugefügt und entfernt werden. Diese Zahl muss manuell in eine Tabellenkalkulation übertragen oder die Ergebnisse gedruckt werden, woraufhin ein Fenster erscheint, das alle Ergebnisse anzeigt. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, wie man Proteine aus Samenflüssigkeit sammelt und wie man diese auf sinnvolle Weise testet.Wir haben dies mithilfe des kompletten Prostatadrüsen-Extrakts gezeigt, aber natürlich können auch die einzelnen Samenflüssigkeitsproteine auf die gleiche Weise untersucht werden. Außerdem ist es möglich, andere Prozesse und die Eiablage zu betrachten. Die Ergebnisse unserer Experimente haben gezeigt, dass es ein einzelnes Samenflüssigkeitsprotein namens avios statin gibt, das eine Verringerung der Eiablage vermittelt.Außerdem stellen wir fest, dass die Übertragung von Samenflüssigkeit die Größe oder Anzahl von Nachkommen erhöht. Statin ist das erste vollständig charakterisierte Samenflüssigkeitsprotein bei einem simultanen Hermaphroditen. Während die Wirkungen von Samenflüssigkeit häufig bei Arten mit getrennten Geschlechtern berichtet wurden, zeigen unsere Ergebnisse, dass Samenflüssigkeiten auch bei Hermaphroditen von gleicher Bedeutung sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Eier von Xenopus laevis intakt, lysiert und / oder fraktionierte sind nützlich für eine Vielzahl von Experimenten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Eiablage zu veranlassen, zu sammeln und dejelly die Eier, und sortieren Sie die Eier, um beschädigte Eier zu entfernen.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

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Eine nichtinvasive Methode zur<em&gt; In situ</em&gt; Bestimmung des Gegen Erfolg im Frauen amerikanischen Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

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Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern eine Reihe von Methoden für die Hochdurchsatz-Entkapselung von Lymnaea stagnalis Embryonen und Larven zur Vorbereitung auf die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount und für nachfolgende Behandlungen vor und nach der Hybridisierung zur Verfügung zu stellen.

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

Die Erhaltung der Süßwassermuschel hängt von der Überwachung der Fortpflanzungsmuster und -prozesse von Arten ab. Diese Studie standardisiert ein nicht-tödliches Protokoll für die Probenahme von Kiemeninhalten, die Charakterisierung der Larvenentwicklung und die Bereitstellung eines digitalen Repositorys für gesammelte Daten. Dieses Protokoll-Datenbank-Paket wird ein wichtiges Werkzeug für Muschelforscher bei der Wiederherstellung gefährdeter Arten sein.

Standardisierung einer nicht-tödlichen Methode zur Charakterisierung des Fortpflanzungsstatus und der Larval-Entwicklung von Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida)

Dieser Artikel berichtet über eine einfache Methode, um die äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer von Hühnereiern zu isolieren und gleichzeitig strukturelle Veränderungen zu minimieren und die Proteinlöslichkeit jeder Subschicht für proteomische Analysen zu optimieren.

Mechanische Trennung und Proteinlöslichkeit der äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer aus Henneneiern

Wenn Transforming Growth Factor ß-Familie Vorläuferproteine in Xenopus laevis-Embryonen ektopisch exprimiert werden, dimerisieren, gespalten werden und in die Blastokoele sezerniert werden, die von der späten Blastula bis zur frühen Gastrula beginnt. Wir beschreiben eine Methode zum Absaugen von Spaltprodukten aus der Blastokoele-Höhle für die Immunoblot-Analyse.

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

Zwei Protokolle zur Ablation des Augenstiels (d. h. Kauterisations- und Operationsansätze) wurden an anästhesierten weiblichen Krabben durchgeführt. Die Augenstielablation von Schlammkrabben beschleunigte die Reifung der Eierstöcke, ohne die Überlebensrate zu verringern.

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Erfahren Sie, wie Samenflüssigkeitsproteine das Eiablageverhalten des Zwitter-Schneckenmodells Lymnaea stagnalis beeinflussen. Diese Methode nutzt künstliche Besamung und Bioassays zur Untersuchung sexueller Selektion.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

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