Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Die Elektroporation ist eine Technik, bei der lebende Zellen mit elektrischem Strom versorgt werden, um vorübergehende Poren auf der Zellmembran zu öffnen. Durch diese Poren können Farbstoffe und andere Moleküle, die normalerweise die Zellmembran nicht passieren, in die Zelle eindringen und die Poren schließen sich schnell wieder, ohne dass die Zelle beschädigt wird. Wir werden beschreiben, wie eine Adhäsionszelle elektroporiert werden kann, während sie auf einem Objektträger wächst, der teilweise mit elektrisch leitfähigem und transparentem Material beschichtet ist.

Das Material ist Indiumzinnoxid, und da es elektrischen Strom leitet, öffnet es Poren, durch die ein Farbstoff in die Zelle eindringen kann. Dann ist es möglich zu untersuchen, ob die Zellen Gap Junctions haben oder nicht und wie viele Gap Junctions kleine Kanäle sind, die das Innere benachbarter Zellen verbinden und den Durchgang kleiner Moleküle ermöglichen. Es ist seit langem bekannt, dass die Gap-Junctional-Kommunikation eine Vielzahl wichtiger Funktionen in der Zelle hat, einschließlich der neoplastischen Transformation und Metastasierung.

Willkommen zu dieser Präsentation von Zellprojekten über die Durchführung der Elektroporation adhärenter Zellen mit dem Insitu. Dieses Bild zeigt, was wir tun können, der Fluoreszenzfarbstoff lose für Gelb wurde in Zellen eingeführt, die auf einem transparenten und leitfähigen Glas wachsen. Bis zu dieser Linie ist die Linie im Phasenkontrast besser zu erkennen.

Hier ist es. Sie können sehen, dass der Farbstoff durch Gap Junctions von den Zellen auf der linken Seite, die durch Elektroporation mit Farbstoff beladen wurden, zu den Zellen auf der rechten Seite diffundiert ist. Resultierend ist dieser Gradient von Fluoreszenzzellen mit Trypen.

Inisiert und dann in Zentrifuge in ein Röhrchen überführt. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen gut verteilt sind, während sie in der Kammer wachsen. Aus diesem Grund ist es am besten, die Zellen zu zentrifugieren, um alle Spuren von Trypsin zu entfernen.

Das Medium mit Spuren von Trypsin wird abgesaugt, die Zellen werden in etwa einem Milliliter Wachstumsmedium resuspendiert und dann in der Kammer plattiert. Die Pipette enthält die Zellsuspension, nehmen Sie den Deckel von der Kammer ab und pipettieren Sie die Zellen tropfenweise in die Kammer, um das Transportieren zu erleichtern. Die Kammer befindet sich in einer sechs Zentimeter großen Petrischale.

Die Kammer wandert zurück in den Inkubator, damit die Zellen wachsen können. Die plattierten Zellen breiten sich gut aus und wachsen, um sich zu berühren und Gap Junctions zu bilden. Wenn die Zellen bereit für die Elektroparade sind, stellen Sie den Insitu-Impulsgenerator auf die gewünschten Bedingungen ein.

Im Handbuch finden Sie eine Beschreibung des einfachen Einrichtungsprozesses. Wenn die Spannung am Insitu eingestellt ist, leuchtet das rote Licht auf der Tastatur auf. Nehmen Sie die beiden erwärmten Flaschen DMEM ohne Kalzium aus dem Wasserbad, eine ist DMEM ohne Kalzium, aber mit dialysiertem Serum, und eine ist DMEM.

Ohne Calcium haben Sie die Pipetten bereit und laden sie lockerer für gelb in die Pipette. Nehmen Sie anstelle des Seufzers die Zellen aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Medium, indem Sie es zunächst im Waschbecher umdrehen.

Tupfen Sie es dann einmal mit DMEM ohne Kalzium auf das Gewebe und versuchen Sie nicht, das gesamte DMEM zu entfernen, da die Zellen austrocknen können. Geben Sie das Luzifergelb vorsichtig auf die Barriere, um die Zellen nicht zu stören, aber schnell genug, damit die Zellen nicht austrocknen. Verwenden Sie 200 Mikroliter für jede Hälfte der Kammer.

Setzen Sie den Deckel auf die Insitu-Kammer und legen Sie ihn dann in den Schieber ein. Stellen Sie sicher, dass die Endlaschen der Kammer in die Schlitze des Schiebers passen, indem Sie den Schieber drücken. Setzen Sie die Kammer in den Kammerhalter ein.

Drücken Sie die Impulstaste auf der Tastatur des Impulsgenerators. Die LED am Impulsgeber und am Kammerhalter blinkt während des Elektroporationsprozesses rot und dann grün, um anzuzeigen, dass der Init-Zyklus abgeschlossen ist. Ziehen Sie den Schieber wieder unter den Kammerhalter und entfernen Sie die Kammer.

Saugen Sie den größten Teil des Luzifergelbs ab, um es wieder zu verwenden, aber achten Sie darauf, die Zellen nicht auszutrocknen. Fügen Sie DMEM ohne Kalzium hinzu. Bei dialysiertem Serum hilft das Serum dem Porösen, die Kammer zu schließen, geht zurück in den Inkubator, damit die Übertragung von Luzifergelb durch Gap Junctions erfolgen kann.

Die Zeitplanung muss von Experiment zu Experiment konsistent sein. Der Standard beträgt drei Minuten. Gießen Sie das Medium in das Abfallbecherglas ab.

Fügen Sie 4%ige Formaldehyd-Fixierlösung mit einer Paste oder Pipette hinzu und warten Sie mindestens zwei Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie das Formaldehyd ab und spülen Sie es ein paar Mal aus. Bei PBS werden die Zellen mit dem Glas fixiert, so dass die Gefahr gering ist, dass sie sich beim Waschen lösen.

Um die Zellen unter Phasenkontrast sehen zu können, ist es wichtig, ein Deckglas auf die Kammer zu legen. Füllen Sie die Kammer mit PBS und bilden Sie einen stolzen Meniskus. Um Luftblasen zu vermeiden, legen Sie das Deckglas auf.

Machen Sie sich keine Sorgen, wenn das PBS überläuft Nehmen Sie einfach das überschüssige PBS auf das Gewebe. Sie benötigen ein inverses Fluoreszenzmikroskop, am besten mit Phasenkontrast und mit einem Filterblock für Luzifergelb. Suchen Sie bei phasengesteuertem Kontrast nach dem Rand des elektroporierten Bereichs.

Sie sehen zwei Linien unter Fluoreszenzzellen. Auf der Hälfte des Objektträgers fluoresziert er stark. Die Linie, die den leuchtenden Zellen am nächsten liegt, ist der Rand des elektroporierten Bereichs.

Eine darüber hinausgehende Fluoreszenz ist auf die Übertragung von Lucergelb durch Gap Junctions zurückzuführen. Zum Beispiel zeigt dieses Bild von Epithelzellen auf der linken Seite des Bildes Zellen, die elektrisch behandelt wurden und Luzifergelb auf benachbarte, nicht elektroporierte Zellen übertragen, wodurch ein Gradient von leuchtenden Zellen vom Rand der leitfähigen Beschichtung nach rechts entsteht. Dieses Bild zeigt den gleichen Ausschnitt von Zellen unter Phasenkontrast.

Beachten Sie, dass Sie die X-Linie sehr deutlich sehen können. Ein quantitatives Maß dafür, wie viel Gap Junctional Transfer stattgefunden hat, kann manuell durch die Arbeit mit den Fluoreszenz- und Phasenkontrastbildern elektroporierter Zellen erfolgen. Die Sterne am Rand des leitfähigen Bereichs gelten als Donorzellen.

Sie wurden elektroporiert und für Gelb lose aufgenommen. Sie geben luc für gelb an benachbarte Zellen auf der rechten Seite weiter, die es weiterleiten. Noch weiter in abnehmenden Mengen.

Das Verhältnis der Punkte zu den Sternen 41 zu acht kann in diesem Fall eine Zahl ergeben, mit der verglichen werden kann, wie umfangreich der Gap-Junctional-Transfer in diesem Fall ist. 5.1 ist der Gap-Junction-Index. Eine Alternative zum manuellen Markieren und Zählen von Zellen besteht darin, mit Hilfe von Bildanalysesoftware die relativen Leuchtmengen entlang der nicht gewählten Seite eines elektroporierten Zellenrands zu messen.

Diese Zellen haben keine Gap Junctions. Hier ist der rechte Rand des elektroporierten Bereichs. Beachten Sie, dass es keinen Fluoreszenzgradienten gibt, was auf das Fehlen von Gap Junctions unter dem Phasenkontrast hinweist.

Sie können alle Zellen deutlich sehen. Beachten Sie, dass die X-Linie ebenfalls deutlich sichtbar ist. In diesem Beispiel.

Alle Zellen in der Kammer wurden mit dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF stimuliert und 10 Minuten später fixiert und auf Phosphobogen untersucht. Beachten Sie, dass die gefärbten Zellen auf der rechten Seite nicht elektroporiert wurden und die Zellen auf der linken Seite bis zu dieser Linie elektroporiert wurden. Die nicht elektroporierten Zellen zeigen eine braune Färbung mit einem Phosphoirk-Antikörper und Immunperoxidase.

Die elektroporierten Zellen zeigen keine Färbung, da das elektroporierte Phosphopeptid die SSH-2-Domäne von Grab zwei blockiert und die Phosphorylierung von EGF gehemmt hat. Beachten Sie, dass der Bereich von drei bis vier Zelllängen rechts von der Linie, in dem die Zellen nicht elektrisch waren, aber keine Färbung aufweisen. Dabei handelt es sich um Zellen, die über Gap Junctions blockierende Peptide von ihren elektroporierten Nachbarn erworben haben.

Dies ist der stärkste mögliche Beweis dafür, dass die Hemmung des Signals auf das Peptid zurückzuführen sein muss und kein Artefakt der Elektroporation sein kann. Da diese Zellen nicht elektroporiert sind, handelt es sich um den gleichen Rahmen, der unter Phasenkontrast gezeigt wird. Es ist zu beachten, dass sich die Morphologie nach der Elektroporation nicht verändert hat.

Bei einigen Patienten kann die Gap-Junctional-Kommunikation quantitativ und präzise in einer Vielzahl von kultivierten Zellen erfolgen. Die Einführung von Peptiden zur Unterbrechung spezifischer Signalwege ist ein leistungsfähiger Ansatz, um die Relevanz von Proteininteraktionen in lebenden Zellen zu bewerten, die mit gereinigten Proteinen identifiziert wurden. Dies kann der erste wichtige Schritt in der Entwicklung von Peptidkuppel-Medikamenten sein.