Name: Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie die Elektroporation adhärenter Zellen auf Indium-Zinn-Oxid-Schichten zur Untersuchung von Gap-Junction-Kommunikation. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse interzellulärer Verbindungen.

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Wir danken Lowell Cochran für die fachkundige Unterstützung bei der Videografie. Die finanzielle Unterstützung durch die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), die Canadian Breast Cancer Research Alliance, die Ontario Centers of Excellence, die Breast Cancer Action Kingston und den Clare Nelson Belegacy Fund durch Zuschüsse an LR wird dankbar gewürdigt. SG erhielt ein NSERC-Stipendium. MG wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des US Army Breast Cancer Program, des Ministeriums für Forschung und Innovation der Provinz Ontario und des Advisory Research Committee der Queen's University unterstützt.

1. Ausplattieren der Zellen in der Elektroporation Chambers <ol><li> In einer Laminar-Flow-Haube, trypsinieren die Zellen unter Verwendung von sterilen Technik wie gewohnt. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um durch Zentrifugation beseitigt alle Spuren von Trypsin, weil sie verhindern Ausbreitung der Zellen auf dem Glas, damit die Bildung von adherens und Gap Junctions. </li><li> Pipette 1 ml der Zellsuspension in sterilen Kammern Elektroporation mit dem in-situ-Elektroporator (Figur 1), und in ein 37 ° C, CO 2-Inkubator gestellt. HINWEIS: Die Zelladhäsion durch Plattieren auf Fibronektin, Kollagen, Poly-Lysin oder Zell-und Gewebekleber (siehe Materialien Table) verbessert werden. </li><li> Wenn die Zellen eine konfluente Schicht gebildet sie sind bereit für GJIC Prüfung. </li></ol> 2. Verfahren der Elektroporation Elektroporation für GJIC Prüfung kann außerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden,da es dauert nur ein paar Minuten. Wenn längere Inkubationszeiten für ein bestimmtes Experiment erforderlich ist, dann kann es vollständig in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden. In allen Fällen müssen die Kammern, in denen die Zellen gezüchtet steril sein. <ol><li> Bereiten Sie eine 5 mg / ml Lucifer gelb Lösung: 10 mg LY-Pulver (mit dem Elektroporator vorgesehen) in 2 ml calciumfreien Wachstumsmedium. Für Experimente, die längere Inkubationszeiten erfordert, Filter-Lösung sterilisieren und bei 4 o C </li><li> Saugen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit Calcium-freiem Medium, man aufpassen, nicht auf die Monoschicht zerkratzen oder trocknen die Zellen. Wenn die Zellen getrocknet haben sie meist dunkler Kerne und abholen LY ohne Elektroporation. Die Wirkung ist stärker ausgeprägt in der Mitte des Schiebers das mehr Luftzug (4F) ausgesetzt ist. </li><li> Mit einer Eppendorf-Pipette pipettiert die Farbstofflösung auf die Zellen (400 ul für die ganze Kammer), am Rand der Kammer, being darauf, nicht die Zellschicht zu berühren. </li><li> Legen Sie die Kammer, in der mit dem mitgelieferten Halter Elektroporator und wenden Sie einen Impuls von der entsprechenden Stärke (siehe Diskussion). </li><li> Sorgfältig absaugen einige der LY-Lösung. Es kann ein zweites Mal für weniger wichtige Experimente verwendet werden. </li><li> Zusatz von Calcium-freiem DMEM mit 10% dialysierten Serum. </li><li> Die Zellen für 3-5 min im Brutschrank inkubieren, um die Farbstoffübertragung durch Gap Junctions ermöglichen. HINWEIS: Die Einbeziehung der dialysierten Serum an dieser Stelle hilft Porenverschluss. </li><li> Mit Calcium-freiem DMEM für Live Cell Beobachtung waschen Sie die nicht rechtsfähige Farbstoff. Alternativ können die Zellen in diesem Stadium durch Zugabe von 4% Formaldehyd zu der gut fixiert werden kann, und dann mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) gewaschen. In allen Fällen muss die Wasch alle Hintergrund zu entfernen. HINWEIS: In Vorversuchen die optimalen Bedingungen zu bestimmen, wenn die Spannung zu niedrig ist, dann ist es möglich, die Zellen zu gewinnen in der incubato zu lassenr für ein paar Minuten und elektroporieren derselben Folie ein zweites Mal, um in den Kosten der Folien zu speichern. </li></ol> 3. Die mikroskopische Untersuchung <ol><li> Beachten Sie die Zellen unter Fluoreszenzbeleuchtung mit einem inversen Mikroskop mit dem geeigneten Filter für die verwendeten Farbstoffs ausgestattet. Lucifer gelb, Anregung 423nm, 555nm Emissions, WBV Filter für eine Nikon IX70 Mikroskop. </li><li> Beseitigen Meniskus Effekte, indem Sie ein Glas Deckglas auf der Oberseite des Kunststoff Nun, nach an die Spitze mit Flüssigkeit zu füllen, um die Zellmorphologie unter dem Phasenkontrast zu untersuchen. Für bessere Bilder kann das auch von der Folie abgenommen werden, und das Deckglas auf dem Rahmen angeordnet. Für feste Zellen, die gut mit Glycerin zur mikroskopischen Beobachtung gefüllt werden, während für lebende Zellen ist es mit Wachstumsmedium gefüllt werden. HINWEIS: Waschen und Fotografieren ist einfacher, wenn die Zellen mit Formaldehyd nach der Übertragung des Farbstoffes (Schritt 2.7 oben) festgelegt. Wenn die Zellen nichtt festgelegt ist, die Fluoreszenz von den Zellen innerhalb von etwa 60 min, je nach Zelltyp, die Spannung und den LY eingeführt, während in fixierten Zellen Fluoreszenz wird für mehrere Stunden beibehalten eliminiert. Allerdings verblasst oder Fluoreszenz verliert sich nach O / N Inkubation, auch in fixierten Zellen. Aus diesem Grund muss Fotografien bald nach der Elektroporation (Figur 2) entnommen werden. </li></ol> 4. Quantifizierung der interzellulären Kommunikation <ol><li> Fotografieren Sie die Zellen mit einem 20x-Objektiv unter Fluoreszenz-und Phasenkontrast (Abbildung 3). </li><li> Identifizieren und markieren mit einem Sternchen die elektroporiert Zellen an der Grenze zu den nicht-elektroporiert Bereich (Abbildung 2, Pfeil, Elektroporation Flanke). </li><li> Identifizieren und Markieren mit einem Punkt auf der fluoreszierenden Zellen nicht elektroporiert Seite, wo der Farbstoff durch Gap Junctions übertragen (3A und 3B). </li><li> Teilen Sie die Gesamtzahl derfluoreszierenden Zellen auf der nicht elektroporiert Bereich durch die Anzahl der elektroporierten Zellen entlang der Kante (3A und 3B). HINWEIS: Der Transfer von mindestens 200 zusammenhängenden elektroporiert Grenzzellen für jedes Experiment berechnet. Die erhaltene Zahl ist der Wert GJIC. </li></ol>

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Der korrespondierende Autor ist der Erfinder eines Patents der Queen's University, das an Cell Projects Inc. lizenziert wurde. Das Unternehmen oder die Universität hatten keinen Einfluss auf den Inhalt der Arbeit.

Kritische Schritte in dem Protokoll Elektroporiert Material Die Reinheit des Materials, elektroporiert werden, ist sehr wichtig. Wenn die Zellen sehr flach sind, müssen dann höhere Konzentrationen des Tracking-Farbstoff verwendet werden (bis zu 20 mg / ml für LY) und in solchen Fällen ist die Reinheit noch wichtiger als in Zellen, die mit einer kugelförmigen Form 1. Neben LY eine große Vielzahl von anderen Farbstoffen oder nonpermeant Moleküle eingesetzt wurd...

Das Anlegen von elektrischem Strom an eine Zelle die Bildung von Poren in der Zellmembran durch ein Verfahren, genannt Elektroporation. Die Poren ermöglichen den Durchgang von einer Vielzahl von nonpermeant Moleküle durch die Membran. Das elektrische Feld kann präzise gesteuert werden, so daß die gebildeten Poren sind sehr klein und schnell wieder zu schließen, mit minimaler Störung der Zellphysiologie. Interessanterweise können anhaftende Zellen auf einem Objektträger mit einer leitfähigen und transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichtet und in situ elektroporiert, die auf der Oberfläche, wo sie wachsen angebaut werden, ohne abgelöst zu Suspension elektroporiert werden. Zellen können sehr gut auf dieser Fläche wachsen und wie sie gebunden sind, und erweiterte detaillierte mikroskopische Beobachtung möglich ist. Mit dieser Technik können kleine Moleküle nonpermeant sofort und eingeführt werden, in im wesentlichen 100% der Zellen, die diese Technik besonders für Studien über die Aktivierung comp machtonents eines Weges folgenden Liganden Stimulation eines Rezeptors (Übersicht in 1). Elektroporation wurde hauptsächlich für die Einführung von DNA (auch Elektrotransfektion) verwendet. Jedoch kann die Elektroporation in situ wertvoll für die Einführung einer großen Vielfalt von Molekülen, wie Peptiden 2-4, Oligonukleotide, wie Antisense-RNA, Doppelstrang-DNA-Decoy-Oligonukleotide zur Hemmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren oder siRNA 3,5, 6, radioaktive Nukleotide 7-10, Proteine ​​11 12 oder 13 Pro-Drugs. Nach der Elektroporation können Zellen für biochemische Analysen lysiert oder fixiert und mit Antikörpern gefärbt. Die leitfähige ITO-Beschichtung ist sehr dünn, 800-1,000Å, so dass das Zellwachstum wird durch die Höhendifferenz der beiden Oberflächen gestört, da die Zellen wachsen über die Kante der leitenden Beschichtung. Dies bietet den Vorteil, dass nicht-electroporated Zellen elektroporiert mit denen gezüchtet werden Seite an Seite, um als Kontrollen dienen. Der gleiche Ansatz kann für die Prüfung von Gap Junction, interzelluläre Kommunikation (GJIC) verwendet werden, wie im Video beschrieben. Gap junctions sind Kanäle, welche die Innenräume von benachbarten Zellen 14. Gap Junction, spielt der interzellulären Kommunikation eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Metastasierung, während Onkogene wie Src unterdrücken GJIC 15,16. Zu prüfen GJIC einen fluoreszierenden Farbstoff, wie Lucifer Gelb (Ly) wird oft in kultivierte Zellen durch Mikroinjektion eingeführt oder kratzen Lade 17 und der Diffusion des Farbstoffs in die benachbarte Zellen mikroskopisch unter Fluoreszenzbeleuchtung beobachtet. Diese Techniken führen jedoch unweigerlich Zellschäden. Wir beschreiben nun ein Verfahren, bei dem Zellen auf einem Objektträger, der teilweise mit ITO beschichtet 18 gewachsen. Ein elektrischer Impuls wurde in Gegenwart von LY (oder anderen Farbstoffen) eingesetzt camit ihr Eindringen in die Zellen wachsen auf dem leitfähigen Teil des Schlittens, während die Farbstoffwanderung zu den benachbarten, nicht-elektroporierten Zellen wurde mikroskopisch durch Fluoreszenz-Beleuchtung beobachtet. Um störende empfindlichen Zellen, die dazu neigen, von der Monoschicht trennen zu vermeiden, um eine Anordnung entworfen, die nicht eine Elektrode erforderlich war oben auf die Zellen, um den elektrischen Strom 19 gelten platziert werden. Dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, GJIC in einer großen Anzahl von Zellen zu quantifizieren, ohne nachweisbare Störungen der Zellstoffwechsel, da durch das Fehlen einer Wirkung auf die Länge der G1-Phase nach der Serumstimulation 12 angedeutet, Erhöhung des Niveaus der fos Protoonkogen Protein (Raptis, unveröffentlicht) oder zwei Kinasen mit zellulären Stress, der p38-Schwein oder JNK / SAPK-Kinase-1 verbunden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen den Ebenen der Onkogenexpression, Transformation und GJIC 18, sowie die Wirkung von Src und STAT3 auf GJIC in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Zellen aus Lungentumorproben 20-23 frisch kultiviert. Zusätzlich wird in situ Elektroporation mit dem beschriebenen Aufbau, der eine obere Elektrode wurde erfolgreich für den Nachweis der Gap-junction-Verschluss auf Adipozyten Differentiation eingesetzt fehlt, wobei die Zellanhaftung an das Substrat ist in diesem Stadium 19,24 verringert.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ohne</td><td>Calcium-Hyklon (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Spender-Kälberserum&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Kat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Kat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsapparat</td><td>Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-Wells</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-Wells</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow Cell</td><td>Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>Hochreines</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Zell- und Gewebeklebstoff</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

ein funktionstest für gap junction-prüfung; elektroporation von adhärenten zellen auf indium-zinn-oxid

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Bei dieser Technik werden Zellen auf einem Objektträger kultiviert, der teilweise mit Indium-Zinnoxid (ITO), einem transparenten, elektrisch leitfähigen Material, beschichtet ist. Eine Vielzahl von Molekülen, wie z.B. Peptide oder Oligonukleotide, können auf im Wesentlichen 100% der Zellen auf nicht-traumatische Weise eingeführt werden. Hier beschreiben wir, wie es zur Untersuchung der interzellulären, gap junctionalen Kommunikation verwendet werden kann. Luzifergelb dringt in die Zellen ein, wenn ein elektrischer Impuls, der auf die leitfähige Oberfläche angelegt wird, auf der sie wachsen, dazu führt, dass sich Poren durch die Zellmembran bilden. Das ist die Elektroporation. Zellen, die auf der nichtleitenden Glasoberfläche unmittelbar neben dem elektroporierten Bereich wachsen, nehmen Luzifergelb nicht durch Elektroporation auf, sondern erhalten den Fluoreszenzfarbstoff, da er über Gap Junctions, die sie mit den elektroporierten Zellen verbinden, zu ihnen geleitet wird. Die Ergebnisse des Transfers von Farbstoff von Zelle zu Zelle können mikroskopisch unter Fluoreszenzbeleuchtung beobachtet werden. Diese Technik ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Gap-Junctional-Kommunikation. Darüber hinaus kann es für die Einführung von Peptiden oder anderen nicht permeierten Molekülen verwendet werden, und die Übertragung von kleinen elektroporierten Peptiden über Gap Junctions zur Hemmung des Signals in den benachbarten, nicht elektroporierten Zellen ist eine kraftvolle Demonstration der Signalhemmung.

Abbildung 2 zeigt Rattenleberzellen epithelialen T51B 22, mit LY elektroporiert und unter Fluoreszenz (Panel A und B) fotografiert oder Phasenkontrast-(C) Beleuchtung, nach Fixierung und Waschen. In Abbildung A ist die Kante des elektroporiert Bereich rot markiert. Die Steigung der Fluoreszenz rechts von der roten Linie zeigt Übertragung über Gap Junctions. In 3A und 3B ist die Quantifizierung von Gap Junction-Kommunikation gezeigt: Die Zellen auf den Rand de...

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Die Elektroporation ist eine Technik, bei der ein elektrischer Strom auf lebende Zellen angewendet wird, um vorübergehende Poren in der Zellmembran zu öffnen. Durch diese Poren können Farbstoffe und andere Moleküle, die normalerweise die Zellmembran nicht durchdringen, in die Zelle eindringen. Die Poren schließen sich schnell wieder, ohne die Zelle zu schädigen. Wir beschreiben, wie sich anheftende Zellen elektroporiert werden können, während sie auf einem Objektträger wachsen, der teilweise mit einem elektrisch leitfähigen und transparenten Material beschichtet ist.Das Material ist Indiumzinnoxid, und da es elektrischen Strom leitet, öffnet es Poren, die einem Farbstoff den Eintritt in die Zelle ermöglichen. Anschließend kann untersucht werden, ob die Zellen Gap-Junctions aufweisen oder nicht, und wie viele Gap-Junctions vorhanden sind. Gap-Junctions sind kleine Kanäle, die die Inneren benachbarter Zellen verbinden und den Durchtritt kleiner Moleküle ermöglichen. Seit Langem ist anerkannt, dass die über Gap-Junctions vermittelte Zellkommunikation eine Vielzahl wichtiger Funktionen in der Zelle besitzt, darunter die neoplastische Transformation und Metastasierung.Willkommen zu dieser Zellprojektpräsentation darüber, wie man eine adhärente Zellelektroporation unter Verwendung des Insitu durchführt. Dieses Bild zeigt, was wir erreichen können: Der fluoreszierende Farbstoff, der gelb erscheint, wurde in Zellen eingeführt, die auf einem transparenten und leitfähigen Glas wachsen. Bis zu dieser Linie ist die Linie unter Phasenkontrast besser sichtbar.Hier ist es. Man kann sehen, dass sich der Farbstoff über Gap-Junctions von den Zellen auf der linken Seite, die mittels Elektroporation mit Farbstoff beladen wurden, zu den Zellen auf der rechten Seite ausgebreitet hat. Dies führt zu diesem Fluoreszenzgradienten. Die Zellen sind tryps.Nach der Inkubation werden die Zellen in ein Reagenzglas für die Zentrifuge überführt. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen gut verteilt sind, da sie in der Kammer wachsen. Aus diesem Grund ist es am besten, die Zellen zu zentrifugieren, um Rückstände von Trypsin vollständig zu entfernen.Das Medium mit Spuren von Trypsin wird abgesaugt, die Zellen werden in ungefähr einem Milliliter Wachstumsmedium resuspendiert und anschließend in der Kammer ausplattiert. Die Pipette enthält die Zellsuspension; entfernen Sie den Deckel von der Kammer und pipettieren Sie die Zellen tropfenweise in die Kammer, um das Transportieren zu erleichtern. Die Kammer wird in eine sechs Zentimeter durchmessende Petrischale gestellt.Die Kammer wird zurück in den Inkubator gestellt, damit die Zellen wachsen können. Die ausplattierten Zellen werden sich gut ausbreiten und bis zum Berühren wachsen, wobei sie Nexus-Kontakte bilden. Wenn die Zellen bereit sind, elektropariert zu werden, stellen Sie den In-situ-Pulsgeber auf die gewünschten Bedingungen ein.Die Beschreibung des einfachen Einrichtungsprozesses ist im Handbuch zu finden. Wenn die Spannung am In-situ-Gerät eingestellt ist, leuchtet das rote Licht auf dem Tastenfeld auf. Nehmen Sie die beiden vorgewärmten Flaschen DMEM ohne Kalzium aus dem Wasserbad heraus – eine enthält DMEM ohne Kalzium, aber mit dialysiertem Serum, die andere ist DMEM.Ohne Kalzium die Pipetten bereithalten, um gelb lockerer in den Pipettierer aufzunehmen. Statt des Seufzers die Zellen aus dem Inkubator nehmen. Entfernen Sie das Medium, indem Sie es zunächst in das Waschbecher umgestürzt abgießen.Dann ein Mal mit DMEM ohne Calcium auf das Gewebe auftragen, jedoch nicht versuchen, das DMEM vollständig zu entfernen, da die Zellen sonst austrocknen könnten. Fügen Sie Lucifer Yellow vorsichtig auf die Barriere hinzu, um die Zellen nicht zu stören, aber schnell genug, damit die Zellen nicht austrocknen. Verwenden Sie 200 Mikroliter für jede Hälfte der Kammer.Setzen Sie den Deckel auf die In-situ-Kammer und laden Sie sie in den Schlitten ein. Stellen Sie sicher, dass die Endlaschen der Kammer durch Schieben des Schlittens in die Aussparungen des Schlittens eingefügt werden. Führen Sie die Kammer in den Kamerahalter ein.Drücken Sie die Puls-Taste auf dem Tastenfeld des Pulsgebers. Während des Elektroporationsprozesses leuchten die LED am Pulsgeber und am Kammerhalter rot auf und wechseln anschließend auf grünes Blinken, um anzuzeigen, dass der Init-Zyklus abgeschlossen ist. Ziehen Sie den Schieberegler wieder unter den Kammerhalter zurück und nehmen Sie die Kammer heraus.Aspirieren Sie den größten Teil des Lucifer Yellow, um es erneut verwenden zu können, achten Sie jedoch darauf, die Zellen nicht austrocknen zu lassen. Geben Sie DMEM ohne Calcium hinzu. Bei Verwendung von dialysiertem Serum hilft das Serum dabei, dass sich die poröse Kammer schließt; anschließend wird sie zurück in den Inkubator gestellt, damit der Transfer von Lucifer Yellow über Gap-Junctions stattfinden kann.Die Dauer muss von Experiment zu Experiment konstant sein. Der Standard beträgt drei Minuten. Gießen Sie das Medium in den Abfallbecher ab.Fügen Sie eine 4 % ige Formaldehyd-Fixierungslösung mit einem Spatel oder einer Pipette hinzu, lassen Sie sie mindestens zwei Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Gießen Sie das Formaldehyd ab und spülen Sie mehrmals aus. Da die Zellen durch PBS an das Glas fixiert sind, besteht während des Waschens kaum die Gefahr, dass sie sich ablösen.Um die Zellen im Phasenkontrast sehen zu können, ist es wichtig, eine Deckglas auf die Kammer zu legen. Füllen Sie die Kammer mit PBS, sodass ein gewölbter Meniskus entsteht. Legen Sie das Deckglas unter Vermeidung von Luftblasen auf.Keine Sorge, wenn PBS überläuft. Saugen Sie einfach das überschüssige PBS mit einem Tuch auf. Sie benötigen ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop, vorzugsweise mit Phasenkontrast und mit einem Filterblock für Lucifer Yellow. Suchen Sie im Phasenkontrast nach der Grenze des elektroporierten Bereichs.Sie werden zwei Linien unter den fluoreszierenden Zellen sehen. Auf der einen Hälfte des Objektträgers leuchten die Zellen intensiv. Die Linie, die den leuchtenden Zellen am nächsten liegt, markiert den Rand des elektroporierten Bereichs.Jede zusätzliche Fluoreszenz beruht auf der Übertragung von Lucifer Yellow über Gap-Junctions. Beispielsweise zeigt dieses Bild von Epithelzellen Zellen, die auf der linken Seite des Bildes elektroporiert wurden und Lucifer Yellow an benachbarte, nicht elektroporierte Zellen weitergegeben haben, wodurch ein Gradient leuchtender Zellen vom Rand der leitfähigen Beschichtung nach rechts entsteht. Dieses Bild zeigt denselben Zellverbund im Phasenkontrast.Beachten Sie, dass die X-Linie sehr deutlich sichtbar ist. Eine quantitative Abschätzung des Ausmaßes des zellvermittelten Übergangs über Gap-Junctions kann manuell anhand der Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder der elektroporierten Zellen durchgeführt werden. Die Sterne entlang der Kante des leitfähigen Bereichs gelten als Donorzellen.Sie wurden elektroporiert und haben lose für Gelb aufgenommen. Sie geben Luc für Gelb an benachbarte Zellen rechts weiter, die es weiterleiten. Noch weiter in abnehmenden Mengen.Das Verhältnis der Punkte zu Sternen – hier 41 zu acht – kann eine Zahl liefern, mit der das Ausmaß des gap-junctionalen Transfers in diesem Fall verglichen werden kann. 5,1 ist der Gap-Junction-Index. Eine Alternative zum manuellen Markieren und Zählen von Zellen besteht darin, Bildanalyse-Software zu verwenden, um die relativen Mengen an Fluoreszenz entlang der nicht elektroporierten Seite einer elektroporierten Zellgrenze zu messen.Diese Zellen verfügen nicht über Nexusstellen (Gap Junctions). Hier befindet sich der rechte Rand des elektroporierten Bereichs. Beachten Sie, dass kein Fluoreszenzgradient vorhanden ist, was unter Phasenkontrastmikroskopie die Abwesenheit von Gap Junctions anzeigt.Sie können alle Zellen deutlich erkennen. Beachten Sie, dass auch die X-Linie deutlich sichtbar ist. In diesem Beispiel.Alle Zellen in der Kammer wurden mit dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF stimuliert und 10 Minuten später fixiert und mit einem Antikörper gegen Phospho-Arc markiert. Beachten Sie, dass die gefärbten Zellen auf der rechten Seite nicht elektroporiert wurden, während die Zellen auf der linken Seite bis zu dieser Linie elektroporiert wurden. Die nicht elektroporierten Zellen zeigen eine braune Färbung mit einem Phospho-Irk-Antikörper und Immunperoxidase.Die elektroporierten Zellen zeigen keine Färbung, da das elektroporierte Phosphopeptid die SSH-Zwei-Domäne von Grab2 blockiert und die Irk-vermittelte Phosphorylierung von EGF inhibiert hat. Beachten Sie den Bereich von drei bis vier Zelllängen rechts der Linie, in dem die Zellen noch nicht elektroporiert wurden, aber ebenfalls keine Färbung zeigen. Dies sind Zellen, die das blockierende Peptid über Gap-Junctions von ihren elektroporierten Nachbarn aufgenommen haben.Dies ist der überzeugendste mögliche Nachweis dafür, dass die Hemmung des Signals auf das Peptid zurückzuführen sein muss und kein Artefakt der Elektroporation darstellt. Da diese Zellen nicht elektroporiert wurden, handelt es sich um denselben Ausschnitt, der im Phasenkontrast gezeigt wird. Beachten Sie das Fehlen jeglicher Veränderung der Morphologie nach der Elektroporation.Bei einigen Patienten kann die Kommunikation über Gap-Junctions quantitativ genau in einer Vielzahl von Kulturen von Zellen bestimmt werden. Die Einführung von Peptiden zur Unterbrechung spezifischer Signalwege ist ein wirksamer Ansatz, um die Relevanz in lebenden Zellen von Protein-Protein-Interaktionen zu bewerten, die zuvor mit gereinigten Proteinen identifiziert wurden. Dies kann der erste wichtige Schritt bei der Entwicklung peptidbasierter Arzneimittel sein.

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Research

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