Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Strukturen von Glykoproteinkomplexen zu untersuchen, die auf den Oberflächen umhüllter Viren vorhanden sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die Viruspartikel in den tomographischen Volumina lokalisiert werden, die zuvor aus Kryoelektronenmikroskopiedaten berechnet wurden. Der zweite Schritt besteht darin, zwei statistisch voneinander unabhängige Anfangsmodelle der Glykoproteinkomplexe mithilfe eines manuell definierten Datenteilsatzes zu erstellen.

Anschließend werden diese Modelle verfeinert und anschließend verwendet, um automatisch alle Glykoprotein-Komplexe auf den Viruspartikeln nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, die Struktur des Glykoprotein-Komplexes unter Verwendung des vollständigen Datensatzes zu verfeinern. Letztendlich kommen molekulare Visualisierungswerkzeuge zum Einsatz, um die endgültige Struktur zu interpretieren.

Die dreidimensionale strukturelle Analyse dieser Glykoprotein-Spitzen ist von unschätzbarem Wert für das Verständnis der viralen Pathogenese sowie für den Wirkstoffdesign. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Röntgenkristallographie liegt darin, dass sie die Aufklärung der Strukturen von Membranproteinen in ihrer natürlichen Membranumgebung ermöglicht. Diese Technik kann dazu beitragen, zentrale Fragestellungen der Strukturbiologie zu bearbeiten.

Beispielsweise die Struktur vieler membranhaltiger Viren. Obwohl diese Technik Einblicke in Glykoproteinkomplexe dieser Viren ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise Membranproteine, die in Liposomen eingebaut sind. Das Verfahren wird von zwei Mitgliedern meiner Gruppe, Slee und David Bittel, demonstriert.

Öffnen Sie zunächst eine Autogramm-Datei in B show. Markieren Sie Viruspartikel manuell in den Aufnahmen, indem Sie die Mittelkoordinate eines Viruspartikels mit dem Partikelmarkierungswerkzeug definieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Varianten verarbeitet wurden.

Speichern Sie die Viruskoordinaten in einer Star-Datei. Fahren Sie fort, indem Sie diesen Prozess für alle Tomos wiederholen. Führen Sie anschließend J sub tomo py im Extraktionsmodus aus, um Vari-Subvolumina in einzelne Volumendateien zu extrahieren. Verwenden Sie die gespeicherten Star-Dateien als Eingabedateien, um zwei unabhängige Anfangsmodelle zu generieren.

Öffnen Sie zunächst die Untervolumen-Karten-Datei des Ovars. Zeigen Sie in B. Wählen Sie eine Teilmenge von Peaks in den Varianz-Untervolumina aus, indem Sie die Mittelkoordinate eines Peaks mit dem Partikel-Auswahlwerkzeug definieren, das über das Werkzeugfenster zugänglich ist.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle deutlich unterscheidbaren Spikes verarbeitet wurden. Speichern Sie die Spike-Koordinaten in einer Star-Datei. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis ungefähr 200 Glykoprotein-Spikes verarbeitet wurden.

Nachdem die Ansichten den Varianten wie im Textprotokoll beschrieben zugeordnet wurden, erstellen Sie eine Maskierung des Realraums mithilfe von J sub tomo. Erstellen Sie mask py. Generieren Sie anschließend eine Maskierung des reziproken Raums mit J sub tomo create wedge mask py.

Die Reziprokraummaske wird verwendet, um Bereiche aus der fehlenden Keilregion auszuschließen, die sich aus der tomographischen Datensammlung entlang einer einzigen Achse ergeben. Erstellen Sie anschließend zwei Anfangsdurchschnitte mithilfe von J.Sub tomo, um Durchschnitte zu erzeugen. PY unter Verwendung einer gespeicherten Auswahldatei als Eingabedatei.

Verwenden Sie die Reduzierung von Rauschen in den anfänglichen Mittelwerten durch iteratives Ausrichten und Mitteln der beiden zuvor generierten Modelle mit J sub-tomo-iterate gold PY. Details zu beiden Stadien dieses Prozesses finden sich im Textprotokoll. Beurteilen Sie den Grad der Symmetrie in der Struktur, indem Sie die resultierende tiefpassgefilterte Karten-Datei in Kyira untersuchen. Wenn beispielsweise der Spike ein trimerer Komplex ist, sollte eine dreizählige Symmetrie erkennbar sein.

Setzen Sie die Verfeinerung der Struktur wie im Textprotokoll beschrieben fort. Generieren Sie anschließend gleichmäßig auf der Varian-Oberfläche verteilte Keime für das Schablonenabgleich und weisen Sie den Keimen einen initialen Blickvektor zu, indem Sie JVs py ausführen. Verwenden Sie die zuvor generierten Star-Dateien als Eingabedateien und erzeugen Sie etwa 1,5-mal mehr Keime als die erwartete Anzahl an Spikes.

Dieser Blickvektor approximiert die Richtung der Spitze, die jedem Keimpunkt am nächsten liegt. Generieren Sie anschließend zwei unabhängige Mittelwerte der Virusoberfläche wie zuvor. Anschließend verfeinern Sie die Position der Keimpunkte, wie im Textprotokoll beschrieben.

Erzeugen Sie abschließend COM-Markerdateien der verfeinerten Seed-Star-Dateien mithilfe von jvs.py. Untersuchen Sie die Seeds, indem Sie die CMM-Dateien und die zugehörigen Virion-Kartendateien in kyira öffnen.

Stellen Sie sicher, dass die verfeinerten Samen korrekt in Bezug auf die Virusmembran ausgerichtet sind. Die verfeinerten Marker können basierend auf ihren Kreuzkorrelationskoeffizienten eingefärbt werden, um mithilfe lokalen Template-Matchings um die verfeinerten Samen herum automatisch alle Spikes in den Varian-Teilvolumina zu lokalisieren, die lokalisierten Spikes auszurichten und zu mitteln und die aus einer Teilmenge manuell ausgewählter Spikes erzeugten Mittelwerte als Anfangstemplates zu verwenden. Weitere Einzelheiten zu diesem Verfahren finden sich im Textprotokoll. Um die Ergebnisse zu visualisieren, öffnen Sie die verfeinerte Struktur des Spikes in Kyira zur Visualisierung.

Fahren Sie fort, die atomaren Strukturen anzupassen. Erstellen Sie anschließend ein kombiniertes Modell des Virions mithilfe von j Subo Create model DO py. Öffnen Sie abschließend das kombinierte Modell zur Visualisierung in kyira.

Das anfängliche Modell wurde mithilfe von 205 manuell ausgewählten Spikes verfeinert. Dreifache Symmetrie des mittigsten Spikes war ohne Anwendung jeglicher Symmetrie erkennbar und wurde in den nachfolgenden Verfeinerungsrunden auferlegt, um alle Spikes manuell auf den Varian-Oberflächen zu detektieren. Für jedes Vion wurden 106 Keime in einem Radius von 43 Nanometern und mit einem Abstand von 20 Grad erzeugt, und ihre Positionen wurden iterativ relativ zur Membran verfeinert.

Die am stärksten korrelierenden Glykoprotein-Spike-Partikel wurden zur Berechnung des endgültigen Durchschnitts verwendet. Der Durchschnitt wurde bis zu einer Auflösung von 35 Ångström aufgelöst. Er zeigte eine trimere Spike-Struktur in der Mitte sowie Beiträge von sechs benachbarten Spikes.

Zusammengesetzte Modelle der Varis wurden berechnet, indem die Struktur an den bekannten Positionen platziert wurde, wodurch die Anordnung der Spikes auf der Varian-Oberfläche sichtbar wurde. Gelegentlich waren lokal geordnete Bereiche von Spikes erkennbar. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ausschließlich die besten Daten zu verwenden und alle Zwischenergebnisse sorgfältig zu überprüfen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können Röntgenkristallographie-Strukturen in den endgültigen Durchschnitt eingepasst werden, um ein genaueres Bild der Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Strukturen viraler Hüllglykoproteine mithilfe von J Omo mitteln kann.