Name: Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Strukturanalyse viraler Glykoprotein-Komplexe mittels Elektronen-Kryotomographie und Jsubtomo. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung mit 35 Å Auflösung.

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<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
<li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li>
<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
<li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
<li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li>
<li>Pietilä, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li>
<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li>
<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li>
<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Wissen von viralen Glykoprotein Spike-Struktur auf der Membran Virus ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis der Virus-Replikation und die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung und Prävention der Infektion. Kryoelektronenmikroskopische kombiniert mit Einzelpartikellung wurde als die am häufigsten verwendete Methode, um die Strukturen der umhüllten Viruspartikel, einschließlich der Spitzen-Glykoprotein lösen entstanden. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die symmetrische Viren ikosaedrisch. Hier durch die Anwendung der Elektronen Kryo-Tomographie und subtomogram Mittelung in Jsubtomo, haben wir ein allgemeines Protokoll zur Bestimmung Glykoprotein-Spikes auf pleomorphen umhüllte Viren, die nicht zugänglich für andere aktuelle Methoden der Strukturbiologie werden skizziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die Auflösung dieser Methode ist ausreichend, um Einblicke in die Domänenarchitektur, Oligomerisierung und höherer Ordnung Organisation des Glykoprotein-Spikes auf intakte Virionen offenbaren. jove_content &quot;&gt; Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll baut zwei zuverlässige Ausgangsmodelle, die statistisch unabhängig voneinander. erfolgreiche Ausführung dieser Schritt setzt voraus, dass Glykoprotein Spikes sind ausreichend groß und nicht gegeneinander zu fest gepackt, so dass einzelne Spikes visuell erkannt werden, und manuell in der Schichtbilder aufgenommen und zwei unabhängige Modelle gemittelt. Wenn dies nicht möglich ist, zwei Änderungen an dem Protokoll versucht werden kann. Zuerst werden zwei unabhängige Zufalls Modelle können durch erste, die zwei Untergruppen von Zufalls subtomograms und dann konstruiert werden Mittelung der subtomograms innerhalb dieser Untergruppen 30. Zweitens, wenn eine Struktur des isolierten Spitze durch andere Mittel, durch Röntgenkristallographie abgeleitet, beispielsweise können sie als Ausgangsmodell verwendet werden. Allerdings muss darauf geachtet werden, werden im niedrigen Pass-Filter dieses Modell mit einem Low-Cut-off-Auflösung (50-70 Å), wie die beiden resultierenden Modelle in der nächsten Runde der Verfeinerung wirdstatistisch unabhängigen erst jenseits dieser Auflösung. Aufgrund dieser Einschränkung ist der erste Ansatz empfohlen. Die erzielbare Auflösung von diesem Protokoll hängt von vier Hauptfaktoren: i. Datensammlungsstrategie und die Qualität der Eingabedaten, ii. Anzahl der subtomograms, iii. Ausrichtungsgenauigkeit der subtomograms und iv. Heterogenität der Strukturen. Während die ersten und zweiten Begrenzungs weitgehend durch hoch Signal-Rausch direkten Elektronendetektoren kombiniert mit CTF korrigiert Tomographie und automatisierte Datenerfassung zu überwinden, wird die Ausrichtungsgenauigkeit weiter durch die Größe und Form der Struktur von Interesse selbst beeinflusst. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf kleine Spitzen ohne hervorstechende Merkmale, kann es vorteilhaft sein, um Fab-Fragmente zu binden, um den Dorn, um die Ausrichtungsgenauigkeit und damit Auflösung 31 zu verbessern. Schließlich, wenn die Strukturen, die gemittelt werden, weisen mehrere Konformationen Unter tomogrUhr Klassifikationsmethoden verwendet werden, um im Durchschnitt unterschiedlichen Konformationen getrennt werden. Zu diesem Zweck integriert Jsubtomo mit dem Dynamo-Paket und bietet leistungsstarke subtomogram Klassifizierung 9. Das obige Protokoll komplementär zu Röntgenkristallographie von isolierten viralen Glycoproteine. Kristallographischen Strukturen in Teilschnittbild Schnittswerte eingesetzt, um die genaue Ausrichtung des Glykoproteins bezüglich des Virions Membran zu erhalten. Anwendung dieser Methode wird zweifellos auch Licht auf umhüllte Virus Struktur und Pathobiologie vergießen.

Elektronen Kryo-Tomographie ist ein Kryoelektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren ermöglicht die Berechnung einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion von komplexen biologischen Proben. Geeignete Proben reichen von gereinigtem makromolekularen Komplexen 1, Fäden 2, Vesikel 3 und 4 pleomorphe Membran Viren, ganze prokaryotischen Zellen 5 und auch dünne Bereiche der gesamten eukaryotischen Zellen 6. Nach der Datensammlung, einer Tilt-Serie, 3D-tomographischen Volumes oder Schichtaufnahmen kann mit mehreren etablierten Software-Pakete, einschließlich bsoft 7 und 8 IMOD berechnet werden. Zwei Aspekte inhärent auf die Untersuchung von biologischen Proben durch Elektronen Kryo-Tomographie begrenzen die biologische Interpretation der entsprechenden tomographischen Volumen. Erstens, aufgrund der begrenzten Elektronendosis, die biologischen Materialien vor der Einführung signifikanten Strahlenschäden angewendet werden kann, signal-zu-Rausch-Verhältnisse in tomographischen Daten sind typischerweise sehr gering. Zweitens, als Folge der begrenzten Stichprobenneigungsgeometrie während der Datensammlung, einige Ansichten des Objekts bleiben nicht vorhanden, was zu einer so genannten &quot;fehlt Keil&quot; Artefakt in der tomographischen Lautstärke. Allerdings können diese beiden Einschränkungen zu überwinden, wenn die tomographischen Volumen sich wiederholende identische Strukturen, wie beispielsweise makromolekularen Komplexen, die erfolgreich sein können gemittelt 9-12. Vor der Mittelung Strukturen Tomogramm Rekonstruktionen müssen Objekte von Interesse zu finden und mit der gleichen Orientierung ausgerichtet werden. Anordnen Solche Strukturen können durch Kreuzkorrelation eines Schablonenstruktur in dem tomographischen Volumens mit einem Ansatz oft als Template pass 13 genannten erzielt werden. Das in diesem Vergleichsprozeß verwendete Vorlage aus Kryoelektronenmikroskopische oder Elektronen Kryo-Tomographie in Kombination mit 3D-Rekonstruktion abgeleitet werden, oder es kann ein Dichtekarte von simulierendeneine atomare Struktur. Mehrere Rechenpakete wurden entwickelt, um diese Aufgaben zu erfüllen 11. Mittelung von Glycoprotein Spikes von Membran Viren, wie HIV-1, war ein besonders erfolgreicher Ansatz für die Untersuchung ihrer Struktur 14-16. Ein Verständnis der Struktur ist integraler für enthüllt sowohl die molekularen Grundlagen der Virus-Wirt-Interaktionen und Führungsantivirale und Impfstoff-Design-Entwicklung. Während makromolekulare Kristallographie ist die Technik der Wahl für hochauflösende (in der Regel besser als 4 Å) Strukturanalyse der einzelnen viralen Glykoproteinen und ihre Komplexe, die Röntgenkristallstrukturen von dieser Methode ergeben, sind von Proteinen aus der natürlichen Umgebung isoliert membranöse auf dem Virion . Somit wichtige Details wie die höherwertigen Architektur viraler Glykoproteine ​​im Kontext des Virions, bleiben fehlen. Auf der anderen Seite, Kryoelektronenmikroskopische und Einzelpartikelrekonstruktionder gesamte umhüllte Viren zu Virionen mit Ikosaedersymmetrie 17,18 beschränkt. Elektronen cryotomography kombiniert mit Teilvolumen Ausrichtung ist damit mehr als eine Ergänzung, die die Untersuchung von Glycoprotein Spikes von unregelmäßig geformten, pleomorphen Viren in situ entstanden. Wir haben eine Software namens Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) zum Nachweis, Ausrichtung und Mittelung der tomographischen Teilmengen entwickelt. Jsubtomo in der Bestimmung der Struktur einer Reihe von zellulären und viralen Strukturen 19-26 verwendet worden. Hier skizzieren wir ein ausführliches Protokoll, das die Bestimmung des viralen Oberflächenstrukturen Spike ermöglicht. Durch Korrelation Lärm zu über-Verfeinerung der gemittelten Strukturen zu umgehen, wird der &quot;Goldstandard&quot; Verfeinerung Regelung verabschiedet 10,27. Schließlich Strategien zur Visualisierung und Interpretation der typische Ergebnisse werden diskutiert.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

mittelung der virushülle glykoprotein-spikes von electron cryotomography rekonstruktionen mit jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Umhüllte Viren nutzen Membranglykoproteine ​​auf ihrer Oberfläche, um den Eintritt in die Wirtszellen zu vermitteln. Dreidimensionale Strukturanalyse dieser Glykoprotein &#39;Spikes&#39; ist oft technisch anspruchsvoll, aber wichtig für das Verständnis der Pathogenese viraler und Wirkstoffdesign. Hier wird ein Protokoll für die virale Spike Strukturbestimmung durch rechnerische Mittelung der Kryo-Elektronentomographie-Daten dargestellt. Elektronen Kryo-Tomographie ist eine Technik, in der Elektronenmikroskopie verwendet, um dreidimensionale tomographische Rekonstruktionen Volumen oder Schichtaufnahmen, von pleomorphen biologischen Proben wie Viren-Membran in einer nahe der nativen, tiefgefrorenen Zustand abzuleiten. Diese Schnittbilder zeigen Strukturen von Interesse in drei Dimensionen, wenn auch in geringer Auflösung. Computational Mittelung der Teilvolumina, oder Unterschichtaufnahmen, ist notwendig, um eine höhere Auflösung Detail wiederholenden Strukturmotive, wie virale Glykoprotein Spikes erhalten. Eine detaillierte Berechnungsansatz für aligning und Mitteln Teilschnittbildern unter Verwendung des Softwarepakets Jsubtomo skizziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Struktur des viralen Glykoprotein Spikes mit einer Auflösung im Bereich von 20-40 Å und Studium der Studie höherer Ordnung Spitze-zu-Spitze-Interaktionen auf der Virion Membran. Typische Ergebnisse sind für Bunyamwera-Virus, ein umhülltes Virus aus der Familie Bunyaviridae vorgestellt. Diese Familie ist eine strukturell heterogene Gruppe von Krankheitserregern, die eine Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier.

Wir demonstrieren die Anwendung des Teillung Tomogramm Workflow oben für die Hüllglycoprotein Komplex von Bunyamwera Virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) mit einem zuvor veröffentlichten Daten skizzierten 24. Datensammlung und Verfeinerungsparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Vertreter Tomogramm wird in 2 gezeigt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parameter (Einheit) </td><td> Wert </td></tr><tr><td> Datensammlung </td><td></td></tr><tr><td> Spannung (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kalibriert Vergrößerung (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Pixelgröße (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Geschätzte Dosis (E - / A 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Unterfokus (um) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Erste CTF Null (A) ein </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Neigebereich (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Tilt Probenahme (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Daten und Raffinesse </td><td></td></tr><tr><td> Schnittbilder </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virionen </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Samen pro Virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Gesamtzahl Samen </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spikes erkannt </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Spikes nach dem Entfernen Überschneidungen </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Spikes nach Kreuzkorrelationsbasierte Auswahl </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spikes in der letzten Durchschnitt ein, </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Symmetrie </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Winkel Probenahme (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> AuflösungBereich in der Verfeinerung (a) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Endgültige Auflösung Schätzung (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Bunyamwera Datensammlung und Verfeinerung Statistik. ein CTF, Kontrastübertragungsfunktion. b Berechnet mit Fourier-Shell Korrelation zwischen zwei unabhängig raffinierten Strukturen bei einer Schwelle von 0.143. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2:. Scheibe durch ein Tomogramm Bunyamwera Virionen Mehrere Spike Seitenansichten zeigt sich in der Peripherie jedes Virion sind mit Pfeilspitzen markiert. Das Schnittbild ist Low-Pass bis 60 Å gefiltert. Maßstab 100 nm auf. Zunächst wird ein erstes Modell mit 205 manuell abgeholt Spikes (raffiniertes wir <strong&gt; 3). Dreifache Symmetrie der Mitte-Spitze am meisten war klar, ohne Anwendung von Symmetrie (3B) und wurde in den folgenden Runden der Verfeinerung (3C) auferlegt. Zur automatischen Erkennung alle Spitzen auf der Virion-Oberfläche erzeugten wir 106 Samen pro Virion am Radius von 43 nm und der Abstand von 20 Grad (4A) und iterativ verfeinert ihre Positionen relativ zu der Membran (4B). <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3: Verfeinerung der ursprünglichen Template-Struktur. (A) Zylindrisch gemittelt (C100) Vorlage aus manuell definierten Positionen von Spitzen gebaut. (B), gemittelt Dichte nach fünf Runden der Verfeinerung ohne Symmetrie (C1) auferlegt zeigt eine Spitze mit drei-fachsymmetrische Funktionen. Die Auflösung des Modells ist 48 Å. (C) Durchschnittliche der Spitze wurde bei 41 A nach fünf Runden der Verfeinerung mit Dreifach-Symmetrie gelöst. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4:. Verfeinerung der Samen AB) Eine Teilmenge der Samen vor (A) und nach (B) sind auf einer Verfeinerung Virion Dichte von 2 gezeigt Seeds in (B) wurden farbcodiert auf der Grundlage der jeweiligen Quer. Korrelationskoeffizienten (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation). Die besten korrelierende Glykoprotein Spike Patches (Top 75% nach dem Entfernen Überschneidungen; ~ 1.000 Spikes) wurden verwendet, um die endgültige Durchschnitt zu berechnen. Die durchschnittliche wurde auf 35-Å Auflösung (Abbildung 5) gelöst. Es zeigte eine trimere Struktur Dorn in der Mitte, inNeben einigen Beitrag aus sechs Nachbar Spikes. Verbund Modelle der Virionen, indem die Struktur in den bekannten Positionen berechnet wird, offenbart die Anordnung der Spikes auf der Oberfläche des Virions (6A). Gelegentlich waren vor Ort bestellt Patches von Spikes deutlich (Abbildung 6B). <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5: raffinierte Struktur eines Patches von dem Glykoprotein Spike Schicht nach Template-Matching. (AB) Zwei Karten &quot;auch&quot; und &quot;ungerade&quot;, aus zwei Hälften der Daten rekonstruiert werden angezeigt. Die beiden Karten zeigen einen bemerkenswerten Grad der Ähnlichkeit, die Überprüfung der Ihrer Gültigkeit des Ansatzes. Die Ausrichtung um die Längsachse Spitze unterscheidet, als die beiden Karten sind vollständig unabhängig voneinander rekonstruiert. (C) Durchschnitt der beiden Karten an gezeigtdie endgültige Auflösung von 35 Å. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Abbildung 6: Platzierung der Spikes auf der Bunyamwera Virus. (A) Composite-Modell eines Virions. Ansicht Vektoren (Sticks) zeigen die Orientierung der Spikes. Farben zeigen die Kreuzkorrelation zwischen jedem Spike und der Template-Struktur (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation). (B) A close-up von einer geordneten Patch von Spikes.

Es wird ein Ansatz zur Bestimmung der Strukturen von viralen Membran-Glykoprotein-Komplexen unter Verwendung einer Kombination aus Elektronen-Kryo-Tomographie und Sub-Tomogramm-Mittelung mit dem Rechenpaket Jsubtomo vorgestellt.

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Strukturen von Glykoproteinkomplexen zu untersuchen, die auf den Oberflächen umhüllter Viren vorhanden sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die Viruspartikel in den tomographischen Volumina lokalisiert werden, die zuvor aus Kryoelektronenmikroskopiedaten berechnet wurden. Der zweite Schritt besteht darin, zwei statistisch voneinander unabhängige Anfangsmodelle der Glykoproteinkomplexe mithilfe eines manuell definierten Datenteilsatzes zu erstellen.Anschließend werden diese Modelle verfeinert und anschließend verwendet, um automatisch alle Glykoprotein-Komplexe auf den Viruspartikeln nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, die Struktur des Glykoprotein-Komplexes unter Verwendung des vollständigen Datensatzes zu verfeinern. Letztendlich kommen molekulare Visualisierungswerkzeuge zum Einsatz, um die endgültige Struktur zu interpretieren.Die dreidimensionale strukturelle Analyse dieser Glykoprotein-Spitzen ist von unschätzbarem Wert für das Verständnis der viralen Pathogenese sowie für den Wirkstoffdesign. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Röntgenkristallographie liegt darin, dass sie die Aufklärung der Strukturen von Membranproteinen in ihrer natürlichen Membranumgebung ermöglicht. Diese Technik kann dazu beitragen, zentrale Fragestellungen der Strukturbiologie zu bearbeiten.Beispielsweise die Struktur vieler membranhaltiger Viren. Obwohl diese Technik Einblicke in Glykoproteinkomplexe dieser Viren ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise Membranproteine, die in Liposomen eingebaut sind. Das Verfahren wird von zwei Mitgliedern meiner Gruppe, Slee und David Bittel, demonstriert.Öffnen Sie zunächst eine Autogramm-Datei in B show. Markieren Sie Viruspartikel manuell in den Aufnahmen, indem Sie die Mittelkoordinate eines Viruspartikels mit dem Partikelmarkierungswerkzeug definieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Varianten verarbeitet wurden.Speichern Sie die Viruskoordinaten in einer Star-Datei. Fahren Sie fort, indem Sie diesen Prozess für alle Tomos wiederholen. Führen Sie anschließend J sub tomo py im Extraktionsmodus aus, um Vari-Subvolumina in einzelne Volumendateien zu extrahieren. Verwenden Sie die gespeicherten Star-Dateien als Eingabedateien, um zwei unabhängige Anfangsmodelle zu generieren.Öffnen Sie zunächst die Untervolumen-Karten-Datei des Ovars. Zeigen Sie in B. Wählen Sie eine Teilmenge von Peaks in den Varianz-Untervolumina aus, indem Sie die Mittelkoordinate eines Peaks mit dem Partikel-Auswahlwerkzeug definieren, das über das Werkzeugfenster zugänglich ist.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle deutlich unterscheidbaren Spikes verarbeitet wurden. Speichern Sie die Spike-Koordinaten in einer Star-Datei. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis ungefähr 200 Glykoprotein-Spikes verarbeitet wurden.Nachdem die Ansichten den Varianten wie im Textprotokoll beschrieben zugeordnet wurden, erstellen Sie eine Maskierung des Realraums mithilfe von J sub tomo. Erstellen Sie mask py. Generieren Sie anschließend eine Maskierung des reziproken Raums mit J sub tomo create wedge mask py.Die Reziprokraummaske wird verwendet, um Bereiche aus der fehlenden Keilregion auszuschließen, die sich aus der tomographischen Datensammlung entlang einer einzigen Achse ergeben. Erstellen Sie anschließend zwei Anfangsdurchschnitte mithilfe von J.Sub tomo, um Durchschnitte zu erzeugen. PY unter Verwendung einer gespeicherten Auswahldatei als Eingabedatei.Verwenden Sie die Reduzierung von Rauschen in den anfänglichen Mittelwerten durch iteratives Ausrichten und Mitteln der beiden zuvor generierten Modelle mit J sub-tomo-iterate gold PY. Details zu beiden Stadien dieses Prozesses finden sich im Textprotokoll. Beurteilen Sie den Grad der Symmetrie in der Struktur, indem Sie die resultierende tiefpassgefilterte Karten-Datei in Kyira untersuchen. Wenn beispielsweise der Spike ein trimerer Komplex ist, sollte eine dreizählige Symmetrie erkennbar sein.Setzen Sie die Verfeinerung der Struktur wie im Textprotokoll beschrieben fort. Generieren Sie anschließend gleichmäßig auf der Varian-Oberfläche verteilte Keime für das Schablonenabgleich und weisen Sie den Keimen einen initialen Blickvektor zu, indem Sie JVs py ausführen. Verwenden Sie die zuvor generierten Star-Dateien als Eingabedateien und erzeugen Sie etwa 1,5-mal mehr Keime als die erwartete Anzahl an Spikes.Dieser Blickvektor approximiert die Richtung der Spitze, die jedem Keimpunkt am nächsten liegt. Generieren Sie anschließend zwei unabhängige Mittelwerte der Virusoberfläche wie zuvor. Anschließend verfeinern Sie die Position der Keimpunkte, wie im Textprotokoll beschrieben.Erzeugen Sie abschließend COM-Markerdateien der verfeinerten Seed-Star-Dateien mithilfe von jvs.py. Untersuchen Sie die Seeds, indem Sie die CMM-Dateien und die zugehörigen Virion-Kartendateien in kyira öffnen.Stellen Sie sicher, dass die verfeinerten Samen korrekt in Bezug auf die Virusmembran ausgerichtet sind. Die verfeinerten Marker können basierend auf ihren Kreuzkorrelationskoeffizienten eingefärbt werden, um mithilfe lokalen Template-Matchings um die verfeinerten Samen herum automatisch alle Spikes in den Varian-Teilvolumina zu lokalisieren, die lokalisierten Spikes auszurichten und zu mitteln und die aus einer Teilmenge manuell ausgewählter Spikes erzeugten Mittelwerte als Anfangstemplates zu verwenden. Weitere Einzelheiten zu diesem Verfahren finden sich im Textprotokoll. Um die Ergebnisse zu visualisieren, öffnen Sie die verfeinerte Struktur des Spikes in Kyira zur Visualisierung.Fahren Sie fort, die atomaren Strukturen anzupassen. Erstellen Sie anschließend ein kombiniertes Modell des Virions mithilfe von j Subo Create model DO py. Öffnen Sie abschließend das kombinierte Modell zur Visualisierung in kyira.Das anfängliche Modell wurde mithilfe von 205 manuell ausgewählten Spikes verfeinert. Dreifache Symmetrie des mittigsten Spikes war ohne Anwendung jeglicher Symmetrie erkennbar und wurde in den nachfolgenden Verfeinerungsrunden auferlegt, um alle Spikes manuell auf den Varian-Oberflächen zu detektieren. Für jedes Vion wurden 106 Keime in einem Radius von 43 Nanometern und mit einem Abstand von 20 Grad erzeugt, und ihre Positionen wurden iterativ relativ zur Membran verfeinert.Die am stärksten korrelierenden Glykoprotein-Spike-Partikel wurden zur Berechnung des endgültigen Durchschnitts verwendet. Der Durchschnitt wurde bis zu einer Auflösung von 35 Ångström aufgelöst. Er zeigte eine trimere Spike-Struktur in der Mitte sowie Beiträge von sechs benachbarten Spikes.Zusammengesetzte Modelle der Varis wurden berechnet, indem die Struktur an den bekannten Positionen platziert wurde, wodurch die Anordnung der Spikes auf der Varian-Oberfläche sichtbar wurde. Gelegentlich waren lokal geordnete Bereiche von Spikes erkennbar. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ausschließlich die besten Daten zu verwenden und alle Zwischenergebnisse sorgfältig zu überprüfen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können Röntgenkristallographie-Strukturen in den endgültigen Durchschnitt eingepasst werden, um ein genaueres Bild der Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Strukturen viraler Hüllglykoproteine mithilfe von J Omo mitteln kann.

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