Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Strukturen von Glykoproteinkomplexen zu untersuchen, die auf den Oberflächen von behüllten Viren vorhanden sind. Dazu werden zunächst die Viruspartikel in den tomographischen Volumina lokalisiert, die zuvor aus Daten der Elektronenkryomikroskopie berechnet wurden. Der zweite Schritt besteht darin, zwei statistisch unabhängige Ausgangsmodelle der Glykoproteinkomplexe unter Verwendung einer manuell definierten Teilmenge von Daten zu erstellen.

Anschließend werden diese Modelle verfeinert und dann verwendet, um automatisch alle Glykoproteinkomplexe auf den Viruspartikeln nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, die Struktur des Glykoproteinkomplexes anhand des vollständigen Datensatzes zu verfeinern. Letztendlich werden molekulare Visualisierungswerkzeuge verwendet, um die endgültige Struktur zu interpretieren.

Die dreidimensionale Strukturanalyse dieser Glykoprotein-Spikes ist von unschätzbarem Wert für das Verständnis der viralen Pathogenese sowie für das Wirkstoffdesign. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Röntgenkristallographie, besteht darin, dass diese Technik das Lösen von Strukturen von Membranproteinen in der natürlichen Membranumgebung ermöglicht. Diese Technik kann helfen, Schlüsselthemen der Strukturbiologie zu bearbeiten.

Zum Beispiel die Struktur vieler Membranen, die Viren enthalten. Obwohl diese Technik Einblicke in die Glykoproteinkomplexe in diesen Viren geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Membranproteine angewendet werden, die in Liposomen eingebaut sind. Das Verfahren wird von zwei Mitgliedern meiner Fraktion, Slee und David Bittel, demonstriert.

Um zu beginnen, öffnen Sie eine Autogramm-Datei in B show. Wählen Sie Viruspartikel manuell in Gramm aus, indem Sie die Mittelkoordinate eines Viruspartikels mit dem Partikelauswahlwerkzeug definieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Varianten verarbeitet wurden.

Speichern Sie die Virenkoordinaten in einer Sterndatei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Tomos. Führen Sie anschließend J sub tomo py im Extraktionsmodus aus. Um Vari auf Sub-Volumes in einzelne Volume-Dateien zu extrahieren, verwenden Sie die gespeicherten Sterndateien als Eingabedateien, um zwei unabhängige Anfangsmodelle zu generieren.

Öffnen Sie zunächst die Ovarian Sub Volume Map-Datei. In der B-Show. Wählen Sie eine Teilmenge der Spikes in den Varian-Untervolumina aus, indem Sie die Mittelkoordinate einer Spitze mit dem Partikelauswahlwerkzeug definieren, das über das Toolbox-Fenster zugänglich ist.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle klar erkennbaren Spikes verarbeitet wurden. Speichern Sie die Spike-Koordinaten in einer Sterndatei. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis etwa 200 Glykoprotein-Spikes verarbeitet wurden.

Nachdem Sie den Varians Ansichten zugewiesen haben, wie im Textprotokoll beschrieben, erstellen Sie eine Realraummaske mit J sub tomo. Erstellen Sie die Maske py. Erzeugen Sie dann eine reziproke Raummaske mit J sub tomo create wedge mask py.

Die reziproke Raummaske wird verwendet, um Bereiche im fehlenden Keilbereich auszuschließen, die sich aus der einachsigen tomographischen Datenerfassung ergeben. Erstellen Sie als Nächstes zwei Anfangsdurchschnitte mit J.Sub tomo Durchschnitte erstellen. PY mit einer gespeicherten Auswahldatei als Eingabedatei.

Die Verwendung des Rauschens zur Reduzierung des Rauschens in den anfänglichen Mittelwerten besteht darin, die beiden zuvor erzeugten Modelle iterativ auszurichten und zu mitteln, wobei J sub tomo Gold PY iteriert. Details zu den beiden Stufen dieses Prozesses finden Sie im Textprotokoll. Beurteilen Sie den Grad der Symmetrie in der Struktur, indem Sie die resultierende Tiefpass-gefilterte Map-Datei in kyira untersuchen. Wenn es sich bei dem Spike beispielsweise um einen trimeren Komplex handelt, sollte eine dreifache Symmetrie erkennbar sein.

Setzen Sie die Verfeinerung der Struktur fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Generieren Sie als Nächstes Seeds, die gleichmäßig auf der Varian-Oberfläche liegen, um den Vorlagenabgleich zu ermöglichen, und weisen Sie den Seeds einen anfänglichen Ansichtsvektor zu, indem Sie JVs py ausführen. Wenn Sie die zuvor generierten Sterndateien als Eingabedateien verwenden, werden etwa 1,5-mal mehr Seeds als die erwartete Anzahl von Spikes generiert.

Dieser Ansichtsvektor entspricht in etwa der Richtung der Spitze, die jedem Kernpunkt am nächsten liegt. Generieren Sie als Nächstes wie zuvor zwei unabhängige Mittelwerte der Virusoberfläche. Verfeinern Sie dann die Position der Seeds, wie im Textprotokoll beschrieben.

Generieren Sie abschließend mit jvs.py Com-Marker-Dateien der verfeinerten Seed-Star-Dateien. Untersuchen Sie die Seeds, indem Sie die CMM-Dateien und die zugehörigen Virion-Map-Dateien öffnen. In Kyira.

Stellen Sie sicher, dass die raffinierten Seeds korrekt relativ zur Virusmembran ausgerichtet sind. Die verfeinerten Marker können basierend auf ihrer Kreuzkorrelation eingefärbt werden: Koeffizienten lokalisieren automatisch alle Spitzen in den Varian-Untervolumina mithilfe des lokalen Vorlagenabgleichs um verfeinerte Ausgangswerte, Ausrichten und Mittelwerten der lokalisierten Spitzen verwenden die Durchschnittswerte, die aus einer Teilmenge manuell ausgewählter Spitzen generiert wurden, als Anfangsvorlagen. Zusätzliche Details zu diesem Prozess finden Sie im Textprotokoll Um die Ergebnisse zu visualisieren, öffnen Sie die verfeinerte Struktur des Spikes in Kyira zur Visualisierung.

Fahren Sie mit dem Anpassen der atomaren Strukturen fort. Erstellen Sie dann ein zusammengesetztes Modell des Virions mit j Subo Create model DO py. Öffnen Sie abschließend das zusammengesetzte Modell zur Visualisierung in Kyira.

Das erste Modell wurde mit 205 manuell gepflückten Spikes verfeinert. Dreifach. Die Symmetrie des mittleren Dorns war ohne Anwendung einer Symmetrie offensichtlich und wurde in den nachfolgenden Verfeinerungsrunden auferlegt, um alle Stacheln manuell auf den Varian-Oberflächen zu erkennen. Für jedes Vion wurden 106 Seeds mit einem Radius von 43 Nanometern und einem Abstand von 20 Grad erzeugt, und ihre Positionen wurden iterativ relativ zur Membran verfeinert.

Die am besten korrelierenden Glykoprotein-Spike-Patches wurden verwendet, um den endgültigen Durchschnitt zu berechnen. Der Durchschnitt wurde auf eine Auflösung von 35 Angström aufgelöst. Es zeigte sich eine trimere Spike-Struktur in der Mitte, zusätzlich zu einem Beitrag von sechs benachbarten Spikes.

Zusammengesetzte Modelle der Varis, die durch das Platzieren der Struktur an den bekannten Positionen berechnet wurden, zeigten die Platzierung von Zacken auf der Varian-Oberfläche. Gelegentlich waren lokal angeordnete Flecken von Stacheln zu sehen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, nur die besten Daten zu verwenden und alle Zwischenergebnisse sorgfältig zu überprüfen.

Nach diesem Verfahren können Röntgenkristallographie-Strukturen in den endgültigen Mittelwert eingepasst werden, um einen genaueren Überblick über die Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Hüllglykoproteinstrukturen mit J Omo mittelt.