DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, genomische Bindungsstellen bakterieller Two-Component-Response-Regulatoren mithilfe eines in-vitro-Mikroarray-basierten Assays zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein markierter Response-Regulator-Protein kloniert und gereinigt, durch in-vitro-Phosphorylierung aktiviert und ein Genziel mithilfe von Elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays identifiziert wird, das als positiver Kontrollpunkt für die nachfolgenden Mikroarray-Schritte dient. Im zweiten Schritt wird das gereinigte Response-Regulator-Protein mit der genomischen DNA vermischt, wodurch die proteingebundene DNA von der Eingangs-DNA mittels Affinitätsreinigung getrennt werden kann.

Anschließend werden die proteingebundene DNA und die Input-DNA mittels qPCR amplifiziert und auf die Anreicherung des positiven Kontrollgenziels in der proteingebundenen Fraktion überprüft, fluoreszenzmarkiert, gepoolt und auf ein Kachelmikroarray hybridisiert. Um die genomischen Bindungsstellen des Response-Regulators zu bestimmen, zeigen die Ergebnisse die wahrscheinlichsten Gene, die durch den untersuchten Response-Regulator reguliert werden, und können weiterhin mittels Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebeassays validiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie dem in-vivo-Chip-Chip-Verfahren besteht darin, dass sie auch dann eingesetzt werden kann, wenn die aktivierenden Signale und Bedingungen für die Zweikomponentensysteme nicht bekannt sind.

Diese Methode ist von großer Bedeutung für das Forschungsgebiet der bakteriellen Signalübertragung, da die überwiegende Mehrheit der Response-Regulatoren unbekannte Genziele besitzt und diese Methode hilft, komplexe regulatorische Netzwerke aufzuklären. Diese Prozedur wird Amy Chen, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, vor Beginn dieses Verfahrens demonstrieren.

Reinigen Sie ein rr, speziell das DVU 3 0 2 3 Protein, das aus einem klonierten DVU 3 0 2 3 Gen-Mix exprimiert wurde. 0,5 Pikomol DVU 3 0 2 3 Protein mit 100 Femtomol eines zuvor hergestellten, inaktivierten DNA-Substrats in einer gepufferten Lösung auf ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Nachdem eine Reaktion ohne jegliches Protein als Kontrolle eingerichtet wurde, inkubieren Sie die Reaktionen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Laborpult.

Nach der Inkubation fünf Mikroliter fünffach konzentrierter Puffer zur Beladung zu den Bindungsreaktionen hinzufügen. Achtzehn Mikroliter jeder Reaktion auf ein zuvor vorbereitetes Mini-6%-Polyacrylamid-Gel mit 0,5× TBE-Puffer auftragen und zwei Stunden lang bei 100 Volt laufen lassen. Nach Beendigung des Gelauflaufs eine beladene Nylonmembran auf die Größe des Gels zuschneiden und mindestens 10 Minuten in 0,5× TBE-Puffer einweichen lassen. Anschließend das Gel aus der Kassette entfernen.

Schneiden Sie alle Rillen aus dem Gel heraus und legen Sie das Gel und die Membran zwischen zwei dicke Filterpapiere, die in 0,5 XTBE getränkt wurden. Platzieren Sie das Gel und die Membran in einer Halb-Trocken-Blotting-Vorrichtung und laufen Sie 30 Minuten bei 20 Volt. Danach platzieren Sie die Membran in ein handelsübliches UV-Licht-Vernetzungsgerät und stellen Sie die Zeit auf drei Minuten ein; nach der Entwicklung des Blots mit einem chemilumineszenten Nachweiskit nehmen Sie das Bild mithilfe eines Computers, der an eine Kamera mit CCD-Sensor angeschlossen ist, auf.

Suchen Sie nach einer Verschiebung der Mobilität des DNA-Substrats in Gegenwart des RR, was darauf hinweist, dass der RR an die getestete DNA bindet. Mischen Sie anschließend zwei bis drei Mikrogramm gemeinsamer genomischer DNA mit 0,5 Pikomol DVU 3 0 2 3 in einer gepufferten Lösung. Nach einer Inkubation der Reaktion bei 25 Grad Celsius für 30 Minuten überführen Sie 10 Mikroliter davon in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und kennzeichnen es als Input-DNA.

Geben Sie 30 Mikroliter Nickel-NTA-Aros-Harz in ein 0,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 100 ×g für eine Minute, um das Harz am Boden des Röhrchens zu sammeln. Entfernen Sie danach den Überstand.

Geben Sie 100 Mikroliter Waschpuffer hinzu und schwenken Sie das Röhrchen, um den Inhalt zu mischen. Nach der Zentrifugation 100 G für zwei Minuten anwenden und den Überstand entfernen. Geben Sie die verbleibenden 90 Mikroliter der Bindungsreaktion zur Waschung an das Nickel-NTA-Harz.

Anschließend die Probe 30 Minuten lang in einem Rüttelschüttler inkubieren. Danach die Probe zwei Minuten bei 100 Gs zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstandes die Waschschritte insgesamt dreimal wiederholen.

Fügen Sie als Nächstes 35 Mikroliter Eluierpuffer an das Harz hinzu und mischen Sie durch Vortexen. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Laborpult. Nach der Zentrifugation der Probe überführen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und beschriften Sie dieses als DNA-Fraktion mit gebundenem Protein.

Fügen Sie anschließend 35 Mikroliter Puffer zur Elution zum Input-DNA nach der Reinigung der Input- und der proteingebundenen DNA-Fraktionen hinzu. Geben Sie jeweils 10 Mikroliter in separate PCR-Röhrchen. Fügen Sie dann je ein Mikroliter 10x Fragmentierungspuffer, zwei Mikroliter Bibliotheksvorbereitungspuffer und ein Mikroliter Bibliotheksstabilisierungslösung zu jeder Probe hinzu und mischen Sie die Proben gründlich durch Vortexen.

Die Proben zwei Minuten lang in einem Thermocycler bei 95 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Proben auf Eis abkühlen lassen. Danach ein Mikroliter Bibliotheksvorbereitungsenzym zu den Proben hinzufügen und den Inhalt durch Pipettieren mischen.

Die Proben in einem Thermocycler inkubieren. Nach der Inkubation 47,5 µL Wasser, 7,5 µL 10 x Amplifikations-Master-Mix und 5 µL Polymerase zu jedem Röhrchen hinzufügen. Nach dem Mischen der Proben diese in einem Thermocycler erhitzen.

Richten Sie für jede DNA-Vorlage jeweils drei QPCR-Ansätze ein, indem Sie einen einmaligen Master-Mix für jeden zuvor entworfenen Primer-Satz vorbereiten und anschließend 18 Mikroliter des Master-Mix pro Vertiefung einer 96-Loch-PCR-Platte abfüllen. Verdünnen Sie die amplifizierten und gereinigten Input- sowie proteingebundenen DNA-Proben mit Wasser auf fünf Nanogramm pro Mikroliter und geben Sie jeweils zwei Mikroliter jeder Probe in die Vertiefungen. Danach verschließen Sie die Platte mit einem UltraClear QPCR-Dichtfolie.

Zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 200 ×g. Nachdem Sie die Platte in einen Echtzeit-QPCR-Maschinenzyklus eingelegt haben, mischen Sie ein Mikrogramm DNA mit 40 Mikrolitern S3 SCI-FI-markierten 9-mers und stellen Sie das Volumen mit Wasser auf 80 Mikroliter ein, um die Eingabe-DNA mit S3 und die angereicherte DNA mit SCI5 zu markieren. Denaturieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 98 Grad Celsius im Dunkeln im Thermocycler.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, kühlen Sie die Proben kurz für zwei Minuten auf Eis ab, geben Sie zwei Mikroliter Three Prime, Five Prime Exo-Polymerase, fünf Millimolar Desoxynukleotidtriphosphate und acht Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion hinzu. Nach dem Mischen inkubieren Sie die Reaktionen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln in einem Thermocycler. Fügen Sie an diesem Punkt EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 Millimolar hinzu, um die Reaktionen zu stoppen, sowie Natriumchloridlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Molar.

Anschließend nach einer Inkubation im Dunkeln für 10 Minuten in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen, die ein 0,9faches Volumen Isopropanol enthalten. Die Proben bei 12.000 ×g für 10 Minuten zentrifugieren. Jeweils sechs Mikrogramm der mit S3 und sci-fi markierten DNA in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vereinigen und im Vakuum bei geringer Erwärmung im Dunkeln trocknen, wobei der Zentrifugendeckel abgedeckt wird, falls er durchsichtig ist.

Nachdem die Pellets trocken sind, resuspendieren wir sie in fünf µL Wasser. Anschließend geben wir 13 µL einer zuvor hergestellten 1x-Hybridisierungslösung-Mastermix nach dem Vortexen für 15 Sekunden zu den Proben hinzu, inkubieren die Proben fünf Minuten lang bei 95 °C in einem Trockenbad. Entnehmen Sie die Proben dem Trockenbad und stellen Sie sie bis zur Beladung in ein Hybridisierungssystem bei 42 °C.

Als Nächstes platzieren Sie die zuvor vorbereitete Mischerobjektträgeranordnung in das Hybridisierungssystem. Geben Sie 16 µL Probe in die Befüllöffnung. Versiegeln Sie anschließend die Öffnungen mit einer Klebefolie und schalten Sie die Mischfunktion im System ein. Nach der Hybridisierung für 16 bis 20 Stunden bei 42 °C.

Schieben Sie den Mischer, schieben Sie ihn in ein Demontagewerkzeug und legen Sie ihn in eine Schale mit warmem Puffer eins. Ziehen Sie den Mischer ab, während Sie das Demontagewerkzeug kräftig schütteln. Legen Sie den Objektträger in einen Behälter mit 50 Milliliter Waschpuffer eins und schütteln Sie ihn zwei Minuten lang kräftig.

Dann den vorherigen Schritt mit 50 Milliliter Waschpuffer zwei und 50 Milliliter Waschpuffer drei RRR DVU 3 0 2 3 verschoben wiederholen. Die upstream gelegene Region von DVU 3 0 2 5 QPCR zeigte, dass die upstream gelegene Region von DVU 3 0 2 5 in der proteingebundenen Fraktion im Vergleich zur Eingabe-DNA angereichert ist, was darauf hinweist, dass die Bindungsbedingungen für DVU 3 0 2 3 geeignet waren. DVU 0 0 1 3 diente als negativer Kontrollwert. Die vier stärksten Signale, die nach der DAP-Chip-Analyse erhalten wurden, wurden als die wahrscheinlichsten Zielstrukturen für DVU 3 0 2 3 ausgewählt.

Das positive Zielgen DVU 3 0 2 5 war der erste Peak mit der höchsten Punktzahl. Zwei Genziele sind zwei weitere, getrennt codierte Lactat-Permeasen. Das vierte Genziel liegt nicht in einem upstream gelegenen Bereich, sondern in der intergenischen Region zwischen zwei konvergent transkribierten Genen. Die upstream gelegenen Regionen der durch DAP-Chip-Meme erhaltenen Ziele wurden verwendet, um ein Bindungsmotiv für die Bindungsstelle vorherzusagen.

Das Motiv wurde weiter validiert, indem Substitutionen in den konservierten Basen innerhalb des Motivs vorgenommen wurden, wodurch die Bindungsverschiebung eliminiert wurde. Das validierte Motiv wurde verwendet, um Genome anderer sulfatreduzierender Bakterien zu durchsuchen, die DVU 3 0 2 3 Orthologe besitzen; Loci wurden als mögliche Genziele ausgewählt, wenn sich das Motiv in den upstream gelegenen Regionen offener Leserahmen befand, unter Verwendung von Motivsequenzen, die für autologe rs vorhergesagt wurden. Ein konsensmäßiges Bindungsstellenmotiv wurde generiert, das dem von Divo Garris Hilton Burrow stark ähnelte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Daptive-Methode verwendet wird, um Genziele für regulatorische Proteine zu bestimmen. Diese Methode kann eingesetzt werden, um die Bindungsgröße eines beliebigen regulatorischen Proteins zu analysieren, vorausgesetzt, das Protein kann gereinigt werden und die Genomsequenz ist bekannt.