Name: Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie Array-CGH zur Erkennung genomischer Copy-Number-Varianten in der genetischen Diagnostik. Diese Methode ermöglicht die präzise Identifikation von Imbalancen im Patientengenom.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

1. Kennzeichnung Reaktion <ol><li> Vor, Pre-Aliquot Cyanin 3 und 5-markierten dUTPs, unmarkierten Nukleotiden und Zufallsprimer an den Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwenden in 96-Well-Platten und bei -20 C einsatzbereit. Für die Zwecke dieses Protokolls Aliquot von 10,5 &amp; mgr; l des geeigneten markiertem dUTP und 10,5 ul unmarkierter Nukleotide und Zufallsprimer in jede Vertiefung. </li><li> Auftauen ready-to-use Platte mit 96 Vertiefungen von Nukleotiden und Primern bei 4 ° C für etwa 1 Stunde, vor Licht geschützt. </li><li> Nach dem Auftauen Gleichgewicht dieser Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, vor Licht geschützt. </li><li> Äquilibrieren DNA-Proben bei 60 ° C für mindestens 15 min. </li><li> Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboters, verzichtet Nuklease-freies Wasser zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. HINWEIS: Die Wassermenge hängt von der Konzentration jedes Eingangs DNA-Probe ab und sollte ausreichen, um in einer Endkonzentration von 50 ng / ul führt. </li><li> Verwendung eines flüssigen hanling Roboter-Pipette 1 ug DNA in eine Vertiefung der 96-Well-Platte (siehe 1.5), um das Gesamtvolumen auf 20 ul zu bringen. HINWEIS: Kleinere Mengen von DNA kann verwendet werden, obwohl die Qualität der resultierenden Daten beeinträchtigt sein kann (zum wertvollen Proben können Eingabe DNA Mengen bis 400 ng) verwendet werden. </li><li> Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboter, übertragen 20 ul äquilibrierten Nukleotide und Primer in jede Vertiefung der Platte verdünnt DNA. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit Verschlussstreifen (a dicht ist entscheidend). </li><li> Die DNA zu denaturieren bei 99 ° C für 10 min in einer PCR-Maschine mit einem beheizten Deckel und rasten kühl auf Eis für 5 min auf Glühen Primer. </li><li> Mit einem Liquid-Handling-Roboter, fügen Sie 10 ul Klenow-Exo-DNA-Polymerase-Enzym zu jedem DNAs und Pipetten Mischung gründlich. HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte 50 ul sein. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 37 ° C für 16 Stunden. ANMERKUNG: Eine kürzere Inkubationszeit von 4 h reicht jedoch ein O / Ncubation kann bequemer sein. </li><li> Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter, mit 5 ul Stoppuffer zu jedem Well. ANMERKUNG: Eine Zusammenfassung der für die Markierungsreaktion verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol> 2. Entfernung von Nicht eingebaute Nukleotide <ol><li> Entfernen eingebauten Nukleotiden unter Verwendung von Silica-Membran von Spin-Säulen und eine dedizierte Spin-Säule Bearbeitungsroboter (die Spin-Säulen können auch manuell bearbeitet werden). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Den Inhalt jeder Vertiefung in ein 2-ml-Tube; Pre-Label diese mit gut-IDs. Anmerkung: Dieser Schritt kann manuell oder vorzugsweise mit Hilfe einer Flüssigkeitshandhabungsroboter durchgeführt werden. </li><li> Bei Verwendung einer Spin-Säule Bearbeitungsroboter, dann laden Sie den Roboter mit 2-ml-Röhrchen, die DNA-Reinigung Spin-Säulen und die damit verbundenen Puffer. </li><li> Nach Eintragen von 250 ul Hochsalz, DNA-Bindungspuffer (Puffer PB) an die Markierungsreaktion, um die markierten DNA an die Kieselsäure bindenMembran. </li><li> Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen der Membran mit 500 ul Waschpuffer (Puffer PE). </li><li> Werden 15 ul niedrigen Salz Elutionspuffer (Puffer EB) auf die Membran, um die gereinigte markierte DNA in einem Volumen von ~ 12 &amp; mgr; l zu gewinnen. </li></ol></li></ol> 3. Kombinieren Hyb Paare <ol><li> Kombinieren Sie die entsprechenden Paare von Cyanin 3 und 5-markierte DNA, COT-1-DNA, ein Hersteller gelieferten blockieren-Mix und ein Hersteller gelieferten Hybridisierungspuffer unter Verwendung eines flüssigen Handhabungsroboter. Hinweis: Diese hyb Paare können eine Probe und eine Referenz oder Probe vs Probe, wenn gemeinsamen CNVs sind kein Thema (zB wir routinemäßig zu koppeln Phänotyp-übereinstimmende Muster, wie ein Nierendysplasie Patienten vs einer Kraniosynostose Patienten, da sie sehr sind unwahrscheinlich, dass die gleichen klinisch signifikanten CNV tragen). Bei Verwendung einer Referenz-DNA ist eine kommerzielle DNA Versorgung empfohlen und sollte zusammen mit der Probe verarbeitet werden. <ol><li> Mit ein Liquid-Handling-roBot Fügen COT-1 DNA (3333 ng / ul), die vom Hersteller gelieferten Sperrmischung und Hybridisierungspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, so dass jede Mulde 1,1 ul Cot-1-DNA, 4,95 &amp; mgr; l Blockierungs Mischung und 24.75 ul Hybridisierungspuffer. </li><li> Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin 3-markierter DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. </li><li> Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin5 markierten DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Vortex für 1 min. Drehen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Inhalte auf den Boden jeder Vertiefung zu sammeln. </li></ol></li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Heizen Sie eine Hybridisierungsofen auf 65 ° C vorwärmen und eine Trägerschlitten und einer Hybridisierungskammer für jedes Array Objektträger. <ol><li> Denaturieren der markierten DNA in einem vorge Hybridisierungsinkubation bevor Aufbringen auf den Arrays. Führen Sie die Hybridisierung in einem rotierenden Ofen für 24 Stunden. </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 70 ° C für 30 min und dann lassen bei 37 ° C für mindestens 5 min. </li><li> Die Arbeit an einem beheizten Plattform bei 42 ° C, laden jede Sicherung Rutsche in eine Hybridisierungskammer vor der Verwendung. Sicherzustellen, dass der transparente Teil der Dichtung Schieber fluchtet mit dem &quot;gefensterten&quot; Teil des Hybridisierungskammer. </li><li> Pipettieren Sie 42 ul des Hybridisierungsmischung vorbereitete (siehe Abschnitt 3) auf die entsprechende Position auf dem Array sichern Rutsche. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. Pipette langsam auf die Mitte jeder Position, so dass die Flüssigkeit nicht den Gummiring Grenze berühren. </li><li> Wenn alle Positionen auf dem Trägerschlitten gefüllt sind, lassen Sie das Array Rutsche auf sie und die Hybridisierungskammer zu montieren. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Anordnung mit Schreiben auf es mit Blick auf die Unterlage Rutschbahn. Achten Sie darauf, die Hybridisierungskammer Schraube festdrehen. </li><li> Überprüfen Sie die zusammengebauten Hybridisierungskammer. ENSure daß es keine Leckage von Hybridisierungsmischung außerhalb der Gummiring Grenzen und jede Luftblase ~ 4 mm in der Höhe, wenn die Hybridisierungskammer ist an seinem Ende senkrecht ruhte. Drehen Sie die Hybridisierungskammer und überprüfen, dass sich keine Luftblasen, die in Position und bewegt sich nicht stecken. Wenn es irgendwelche von ihnen, geben dem Raum einen starken Schlag auf die Bank. Überprüfen Sie, ob alle Luftblasen in Bewegung sind. </li><li> Platzieren Sie die Hybridisierungskammer in den rotierenden Ofen bei 65 ° C für 24 Stunden. Sicherstellen, dass der Ofen Rotor ist ausgewogen; verwenden andere leere Kammern, falls erforderlich. </li></ol></li></ol> 5. Waschen und Scannen von Dias <ol><li> Waschen Sie Arrays, um überschüssige markierte DNA zu entfernen und dann scannen, um Fluoreszenz jeder Probe zu messen. <ol><li> Nehmen Hybridisierungskammern aus dem Ofen und zu demontieren. Die Array-und Dichtungsfolien werden miteinander verklebt werden; tauchen diese in Waschpuffer 1 und mit einem Paar aus Kunststoff, Flachzange eingefasst, sie auseinander zu hebeln. </li><li> Discard die Dichtung Rutsche und legen Sie das Array Rutsche in ein Rack in Puffer 1 getaucht. </li><li> Waschen Sie die Array-Folie in ~ 700 ml frischem Waschpuffer 1 für 5 Minuten, unter starkem Rühren (mit einem Floh und Magnetrührer). </li><li> Übertragen Sie die Array-Folie, um ~ 700 ml Waschpuffer 2 und waschen für 90 sec, unter kräftigem Rühren. Gently heben Sie die Array gleitet aus Waschpuffer 2, sollten sie trocken entstehen. </li><li> Laden Sie das Array Abgleiten in einen Objektträgerhalter aus dem Scanner, über einen Schiebeschutz. Legen Sie die Folie in das Array-Scanner und scannen folgenden des Arrays Herstellers. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Array-CGH wird ausgewogenen Umlagerungen oder Ploidie Anomalien wie Triploidie nicht erkennen. Ferner können geringe mosaic Ungleichgewichte nicht erkannt werden. Hat Array-CGH jedoch eine höhere Auflösung für CNV Erkennung als G-gebändert Chromosomenanalyse, die es in vielen Labors Zytogenetik ersetzt hat. Es ist daher der derzeitige Goldstandard für die genomweite CNV-Erkennung. Sie kann von der nächsten Generation Sequenziertechnologien in der Zukunft ersetzt werden, aber derzeit, ihre Kosten und die technischen Schw...

Es ist seit vielen Jahren, dass Deletionen oder zusätzliche Kopien von Chromosomensegmente verursachen geistiger Behinderung, Dysmorphien und congentical Fehlbildungen bekannt, und in einigen Fällen dazu führen, genetische Syndrome 1. Doch die einzige Technologie zur Verfügung, bis Mitte der 2000er Jahre für die genomweite Erfassung dieser Veränderungen war, G-gebändert Chromosomenanalyse, die eine Auflösung von rund 5-10MB hat, je nach Region und Art des Ungleichgewichts und welche nicht abnorme Chromosomen, wo Material wurde von einer Region aus einem anderen Chromosom mit der gleichen Bandenmuster ersetzt. Neben zytogenetischen Techniken wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Multiplex Ligation-spezifischen Sonde Verstärkung wurden für die Abfrage bestimmter Loci vorhanden, bei Verdacht auf bestimmte syndromale Ungleichgewicht, aber es war nicht bis zur Einführung der Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) in der klinischen Routinediagnose service 2-5, die genomweite Erfassung der Kopienzahl-Varianten (CNVs) wurde zu einem stark erhöhten Auflösung (typischerweise um 120kb) möglich. Klinische Servicearbeiten neben Studien haben gezeigt, dass CNVs für einige Regionen in der Normalbevölkerung 6-7 weit verbreitet, während andere CNVs, die zuvor nicht nachweisbar, werden mit neurodisabilities wie Autismus und Epilepsie 8-11 verbunden. Die in diesem Dokument beschriebenen Protokoll wird in unserem UK National Health Service (NHS) klinisch-diagnostischen Labor; wir neuartige Hybridisierung Strategien, Chargenprüfung und Robotik zu Kosten in diesem staatlich finanzierten Dienst minimieren. Vor dem unten beschriebenen Protokoll sollte hochwertige DNA aus dem entsprechenden Ausgangsmaterial, meist Blut, kultivierten Zellen oder Gewebeproben entnommen werden. Spektrophotometrie verwendet werden, um Konzentration zu messen (sollte&gt; 50 ng / ul) und prüfen 260: 280 Absorptionsverhältnisse (zu be von 1,8 bis 2,0). Die Gelelektrophorese kann kontrolliert werden, dass die DNA mit hohem Molekulargewicht ohne signifikanten Abbau werden. Dieses Protokoll wird für einen höheren Durchsatz Laboratorien, Kennzeichnung 96 Proben pro Lauf mit automatisierten Liquid-Handling-Robotik sollen. Es kann jedoch für niedrigere Durch Labors ohne Automatisierung angepaßt werden.

<table><tbody><tr><td>CGH Microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH Waschpuffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH Hybridisierungspuffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH Beschriftungskit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array-cgh) zum nachweis von genomic copy number varianten

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH zum Nachweis genomischer Kopienzahlvarianten hat die G-Banden-Karyotyp-Analyse ersetzt. In diesem Beitrag wird die Technologie und ihre Anwendung in einem klinisch-diagnostischen Dienstleistungslabor beschrieben. DNA, die aus einer Patientenprobe (Blut, Speichel oder andere Gewebetypen) extrahiert wird, wird mit einem Fluorochrom (entweder Cyanin 5 oder Cyanin 3) markiert. Eine DNA-Referenzprobe wird mit dem entgegengesetzten Fluorochrom markiert. Es folgt ein Reinigungsschritt, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen, bevor die markierten DNAs gemischt und in einem Hybridisierungspuffer resuspendiert und auf ein Array aus ~60.000 Oligonukleotidsonden aus Loci im gesamten Genom aufgebracht werden, mit hoher Sondendichte in klinisch wichtigen Bereichen. Nach der Hybridisierung werden die Arrays gewaschen, dann gescannt und die resultierenden Bilder analysiert, um die rote und grüne Fluoreszenz für jede Sonde zu messen. Software wird verwendet, um die Qualität jeder Sondenmessung zu bewerten, das Verhältnis von roter zu grüner Fluoreszenz zu berechnen und potenzielle Kopienzahlvarianten zu erkennen.

Jede Sonde auf einem Array hybridisiert wird als eine Mischung aus roten und grünen Fluorochrome visualisiert (siehe Abbildung 1). Das Verhältnis von rot nach grün fluoreszierenden Signals für jede Sonde wird vom Scanner quantifiziert und die zugehörige Software zeichnet diese als log2 Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position und identifiziert Bereiche, die außerhalb voreingestellten Grenzen. Die resultierende Array Spuren ermöglichen Interpretation der Regionen als genomisch unsymmetrische ...

Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels komparativer genomischer Hybridisierung genomische Ungleichgewichte zu identifizieren, die zu einer Vielzahl genetischer Erkrankungen führen können. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA des Patienten mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wird. Im zweiten Schritt werden die DNA des Patienten und eine anders markierte Referenz-DNA an das Array hybridisiert.Anschließend wird der Array gescannt, um die Menge an an jede Sonde gebundenen DNA des Patienten und der Referenz zu messen. Im letzten Schritt wird das gescannte Bild verarbeitet, um die Genomregionen zu identifizieren, in denen die DNA des Patienten mehr oder weniger Material als die Referenz-DNA aufweist. Die komparative genomische Hybridisierung wird verwendet, um festzustellen, ob der Patient eine Kopienzahlvariante trägt, die zu einem genetischen Syndrom führt.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Montage des Array-Objektträgers schwierig sein kann und eine Auslaufrisiko der Hybridisierung besteht. Rühren Sie die Mischung vor Beginn der Markierungsreaktion aus der Kammer heraus. Tauen Sie die gebrauchsfertige 96-Loch-Platte mit Nukleotiden und Primern etwa eine Stunde lang bei vier Grad Celsius und lichtgeschützt auf.Nach dem Auftauen die abgedeckte Platte weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren und gleichzeitig die DNA-Proben 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius äquilibrieren. Während die Proben erwärmen, mit einem Flüssigkeitsmanipulator ausreichend nukleasefreies Wasser in jedes Loch einer neuen 96-Loch-Platte geben. Sobald die DNA bereit ist, je Probe ein Mikrogramm pro Loch in die 96-Loch-Platte mit Wasser überführen.Überführen Sie nun 20 Mikroliter der equilibrierten Nukleotide und Primer in jede Vertiefung der Platte mit den verdünnten DNA-Proben und verschließen Sie die Platte mit Streifenkappen, wobei darauf zu achten ist, dass ein dichter Abschluss gewährleistet ist. Anschließend denaturieren Sie die DNA bei 99 Grad Celsius in einem PCR-Gerät mit beheiztem Deckel nach 10 Minuten und lagern Sie die Primer durch schnelles Abkühlen der Platte auf Eis für fünf Minuten an. Danach verwenden Sie den Flüssigkeits-Handling-Roboter, um 10 Mikroliter des Clean-Exo-DNA-Polymerase-Enzyms zu jeder Probe hinzuzufügen.Mischen Sie die Proben mit einer Pipette, verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern Stop-Puffer pro Bohrung. Entfernen Sie anschließend die nicht eingebauten Nukleotide. Übertragen Sie den Inhalt jeder Bohrung in einzelne vorbeschriftete 2-Milliliter-Röhrchen.Laden Sie die Proben und DNA-Reinigungs-Spin-Säulen sowie die entsprechenden Puffer in einen Spin-Säulen-Verarbeitungsroboter. Gemäß den Herstelleranweisungen bindet der Spin-Säulen-Verarbeitungsroboter die markierte DNA mit 250 µL hochsalzigem DNA-Bindungspuffer pro Röhrchen an die Silica-Membran, wonach die Verunreinigungen durch zwei Waschschritte mit jeweils 500 µL Waschpuffer von den Membranen entfernt werden. Anschließend gibt der Roboter 15 µL niedrigsalzigen Elutionspuffer auf die Membranen, um die gereinigten, markierten DNA-Proben in einem Volumen von etwa 12 µL zu eluieren, um die Proben anschließend zu hybridisieren.Als Nächstes einen Hybridisierofen auf 65 Grad Celsius vorheizen und die Trägerobjektträger sowie die Hybridisierkammern vorwärmen. Zum Herstellen der Hybridisierungslösung 1,1 µL Cot-1-DNA, 4,95 µL der vom Hersteller bereitgestellten Blockierlösung und 24,75 µL Hybridisierungspuffer kombinieren. Den Flüssigkeitsmanipulationsroboter verwenden, um diese Mischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Loch-Platte abzugeben, wobei jede Pipettenspitze vorab benetzt wird, um die Übertragungsgenauigkeit zu erhöhen.Als Nächstes pipettieren Sie 9,35 µL der entsprechenden, mit Drei markierten DNA, gefolgt von 9,35 µL der entsprechenden, mit Fünf markierten DNA. Versiegeln Sie jede Vertiefung der Platte, inkubieren Sie die Proben eine Minute lang und zentrifugieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt am Boden jeder Vertiefung zu sammeln. Denaturieren Sie die markierte DNA in einem vorgewärmten Hybridisierungsinkubator.Zuerst drei Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend auf einem beheizten Platz mit 42 Grad Celsius arbeiten. Die Rückplatte in die Hybridisierungskammer stellen, wobei der transparente Teil der Dichtung mit dem Fensterbereich der Hybridisierungskammer ausgerichtet werden muss, unter Verwendung vornassierten Pipettenspitzen.Pipettieren Sie nun langsam 42 µL der Hybridisierungslösung in die Mitte der entsprechenden Position der Array-Trägerslide, wobei darauf zu achten ist, dass die Flüssigkeit die Begrenzung des Gummiringes nicht berührt. Sobald alle Positionen gefüllt sind, setzen Sie die Array-Slide vorsichtig auf die Trägerslide auf und bauen Sie die Hybridisierungskammer zusammen.Stellen Sie sicher, dass die Seite des Arrays mit der Beschriftung zur Trägerplatte weist, und ziehen Sie anschließend die Schraube der Hybridisierungskammer vollständig fest. Überprüfen Sie die montierte Hybridisierungskammer daraufhin, dass keine Hybridisierungsflüssigkeit außerhalb der Grenzen des Gummirings austritt und dass jede Luftblase etwa vier Millimeter Höhe aufweist. Wenn die Hybridisierungskammer senkrecht auf ihrem Ende steht, drehen Sie sie, um dies zu überprüfen.Alle Luftblasen an jeder Position bewegen sich. Falls sich einige der Blasen festgesetzt haben, klopfen Sie kräftig auf die Kammer. Anschließend werden die Hybridisierungskammern für 24 Stunden in den rotierenden Ofen bei 65 Grad Celsius gestellt.Am nächsten Tag tauchen Sie die Hybridisierungskammern in Waschpuffer eins ein und verwenden ein Paar plastische, flachkantige Pinzetten, um die Objektträger voneinander zu lösen. Entsorgen Sie danach die Dichtungsobjektträger und legen Sie die Array-Objektträger in ein Gestell, das in frischen Puffer eins eingetaucht ist. Waschen Sie die Array-Objektträger etwa eine bis fünf Minuten lang in ca. 700 Milliliter Waschpuffer, wobei kräftig mit einem Rührfisch und einem magnetischen Rührstab gerührt wird.Überführen Sie die Array-Objektträger dann in etwa 700 Milliliter Waschpuffer, zwei Mal je 90 Sekunden, wobei am Ende der zweiten Waschung eine intensivere Rührtätigkeit erfolgen sollte. Heben Sie die Array-Objektträger vorsichtig aus dem Puffer heraus. Sie sollten trocken herauskommen.Danach laden Sie die Array-Schlitten zusammen mit den Schlittenprotectoren in die Schlittenhalter am Scanner ein und scannen anschließend die Proben. Gemäß den Anweisungen des Array-Herstellers wird jede Sonde auf einem hybridisierten Array als Mischung aus roten und grünen Fluorochromen visualisiert. Die Verhältnisse des roten zu grünen Fluoreszenzsignal für jede Sonde werden vom Scanner quantifiziert, und die zugehörige Software erfasst sie als Logarithmus-zu-Basis-zwei-Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position.Die resultierenden Array-Spuren ermöglichen die Interpretation von Regionen, die als genomisch unausgeglichen identifiziert wurden. Beispielsweise wurde in dieser Spur eines Kindes mit Williams-Syndrom, einem wiederkehrenden Mikrodelitionssyndrom, das durch Low-Copy-Repeats im proximalen Bereich des Chromosoms sieben vermittelt wird, die genomische Unaufhebung von der Software mit einer roten Linie markiert. Der prop. fluoreszierende Logarithmus-Quotient sollte eng um Null streuen, was ein Verhältnis von grün zu rot von eins zu eins für normale Genomregionen anzeigt.Verstreute Array-Spuren, wie sie bei dieser Analyse beobachtet wurden, können zu ungenauen Zuordnungen abnormaler Regionen oder zum Versagen bei der Identifizierung genomischer Ungleichgewichte führen und können durch verschiedene Faktoren verursacht werden, darunter schlechte DNA-Qualität oder die Anwesenheit von Strahlen, Ozonkonzentrationen in der Atmosphäre. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Patientenproben für die Untersuchung mittels aCGH aufzubereiten sind und wie qualitativ hochwertige Daten für die nachgeschaltete Analyse und Detektion von Kopplungszahlvariationen erzeugt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video ist eine technische Demonstration der Hybridisierung Protokoll für gesamte Genom Fliesen Weg Array-CGH, ​​die das gesamte menschliche Genom mit nur 25-100 ng DNA, die aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Archivierung Formalin fixiert Material isoliert werden können Scans.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Einzelne Zell Sequenzierung ist ein immer beliebter und zugängliches Werkzeug für genomische Veränderungen bei hoher Auflösung Adressierung. Wir bieten ein Protokoll, das einzelne Zelle Sequenzierung verwendet Kopienzahl Veränderungen in einzelnen Zellen zu identifizieren.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Hierin beschreiben wir ein Verfahren zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs. Das Verfahren ist von Bedeutung für Studien, die Zusammenhänge zwischen Methylierungsmustern von Genen und Faktoren untersuchen, die zur Karzinogenese bei Magen-Darm-Krebs beitragen.

Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs

Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

Lernen Sie Array-CGH zur Erkennung genomischer Copy-Number-Varianten in der genetischen Diagnostik. Diese Methode ermöglicht die präzise Identifikation von Imbalancen im Patientengenom.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

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