Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten
21. Februar 2015
Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels komparativer genomischer Hybridisierung genomische Ungleichgewichte zu identifizieren, die zu einer Vielzahl genetischer Erkrankungen führen können. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA des Patienten mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wird. Im zweiten Schritt werden die DNA des Patienten und eine anders markierte Referenz-DNA an das Array hybridisiert.
Anschließend wird der Array gescannt, um die Menge an an jede Sonde gebundenen DNA des Patienten und der Referenz zu messen. Im letzten Schritt wird das gescannte Bild verarbeitet, um die Genomregionen zu identifizieren, in denen die DNA des Patienten mehr oder weniger Material als die Referenz-DNA aufweist. Die komparative genomische Hybridisierung wird verwendet, um festzustellen, ob der Patient eine Kopienzahlvariante trägt, die zu einem genetischen Syndrom führt.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Montage des Array-Objektträgers schwierig sein kann und eine Auslaufrisiko der Hybridisierung besteht. Rühren Sie die Mischung vor Beginn der Markierungsreaktion aus der Kammer heraus. Tauen Sie die gebrauchsfertige 96-Loch-Platte mit Nukleotiden und Primern etwa eine Stunde lang bei vier Grad Celsius und lichtgeschützt auf.
Nach dem Auftauen die abgedeckte Platte weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren und gleichzeitig die DNA-Proben 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius äquilibrieren. Während die Proben erwärmen, mit einem Flüssigkeitsmanipulator ausreichend nukleasefreies Wasser in jedes Loch einer neuen 96-Loch-Platte geben. Sobald die DNA bereit ist, je Probe ein Mikrogramm pro Loch in die 96-Loch-Platte mit Wasser überführen.
Überführen Sie nun 20 Mikroliter der equilibrierten Nukleotide und Primer in jede Vertiefung der Platte mit den verdünnten DNA-Proben und verschließen Sie die Platte mit Streifenkappen, wobei darauf zu achten ist, dass ein dichter Abschluss gewährleistet ist. Anschließend denaturieren Sie die DNA bei 99 Grad Celsius in einem PCR-Gerät mit beheiztem Deckel nach 10 Minuten und lagern Sie die Primer durch schnelles Abkühlen der Platte auf Eis für fünf Minuten an. Danach verwenden Sie den Flüssigkeits-Handling-Roboter, um 10 Mikroliter des Clean-Exo-DNA-Polymerase-Enzyms zu jeder Probe hinzuzufügen.
Mischen Sie die Proben mit einer Pipette, verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern Stop-Puffer pro Bohrung. Entfernen Sie anschließend die nicht eingebauten Nukleotide. Übertragen Sie den Inhalt jeder Bohrung in einzelne vorbeschriftete 2-Milliliter-Röhrchen.
Laden Sie die Proben und DNA-Reinigungs-Spin-Säulen sowie die entsprechenden Puffer in einen Spin-Säulen-Verarbeitungsroboter. Gemäß den Herstelleranweisungen bindet der Spin-Säulen-Verarbeitungsroboter die markierte DNA mit 250 µL hochsalzigem DNA-Bindungspuffer pro Röhrchen an die Silica-Membran, wonach die Verunreinigungen durch zwei Waschschritte mit jeweils 500 µL Waschpuffer von den Membranen entfernt werden. Anschließend gibt der Roboter 15 µL niedrigsalzigen Elutionspuffer auf die Membranen, um die gereinigten, markierten DNA-Proben in einem Volumen von etwa 12 µL zu eluieren, um die Proben anschließend zu hybridisieren.
Als Nächstes einen Hybridisierofen auf 65 Grad Celsius vorheizen und die Trägerobjektträger sowie die Hybridisierkammern vorwärmen. Zum Herstellen der Hybridisierungslösung 1,1 µL Cot-1-DNA, 4,95 µL der vom Hersteller bereitgestellten Blockierlösung und 24,75 µL Hybridisierungspuffer kombinieren. Den Flüssigkeitsmanipulationsroboter verwenden, um diese Mischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Loch-Platte abzugeben, wobei jede Pipettenspitze vorab benetzt wird, um die Übertragungsgenauigkeit zu erhöhen.
Als Nächstes pipettieren Sie 9,35 µL der entsprechenden, mit Drei markierten DNA, gefolgt von 9,35 µL der entsprechenden, mit Fünf markierten DNA. Versiegeln Sie jede Vertiefung der Platte, inkubieren Sie die Proben eine Minute lang und zentrifugieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt am Boden jeder Vertiefung zu sammeln. Denaturieren Sie die markierte DNA in einem vorgewärmten Hybridisierungsinkubator.
Zuerst drei Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend auf einem beheizten Platz mit 42 Grad Celsius arbeiten. Die Rückplatte in die Hybridisierungskammer stellen, wobei der transparente Teil der Dichtung mit dem Fensterbereich der Hybridisierungskammer ausgerichtet werden muss, unter Verwendung vornassierten Pipettenspitzen.
Pipettieren Sie nun langsam 42 µL der Hybridisierungslösung in die Mitte der entsprechenden Position der Array-Trägerslide, wobei darauf zu achten ist, dass die Flüssigkeit die Begrenzung des Gummiringes nicht berührt. Sobald alle Positionen gefüllt sind, setzen Sie die Array-Slide vorsichtig auf die Trägerslide auf und bauen Sie die Hybridisierungskammer zusammen.
Stellen Sie sicher, dass die Seite des Arrays mit der Beschriftung zur Trägerplatte weist, und ziehen Sie anschließend die Schraube der Hybridisierungskammer vollständig fest. Überprüfen Sie die montierte Hybridisierungskammer daraufhin, dass keine Hybridisierungsflüssigkeit außerhalb der Grenzen des Gummirings austritt und dass jede Luftblase etwa vier Millimeter Höhe aufweist. Wenn die Hybridisierungskammer senkrecht auf ihrem Ende steht, drehen Sie sie, um dies zu überprüfen.
Alle Luftblasen an jeder Position bewegen sich. Falls sich einige der Blasen festgesetzt haben, klopfen Sie kräftig auf die Kammer. Anschließend werden die Hybridisierungskammern für 24 Stunden in den rotierenden Ofen bei 65 Grad Celsius gestellt.
Am nächsten Tag tauchen Sie die Hybridisierungskammern in Waschpuffer eins ein und verwenden ein Paar plastische, flachkantige Pinzetten, um die Objektträger voneinander zu lösen. Entsorgen Sie danach die Dichtungsobjektträger und legen Sie die Array-Objektträger in ein Gestell, das in frischen Puffer eins eingetaucht ist. Waschen Sie die Array-Objektträger etwa eine bis fünf Minuten lang in ca. 700 Milliliter Waschpuffer, wobei kräftig mit einem Rührfisch und einem magnetischen Rührstab gerührt wird.
Überführen Sie die Array-Objektträger dann in etwa 700 Milliliter Waschpuffer, zwei Mal je 90 Sekunden, wobei am Ende der zweiten Waschung eine intensivere Rührtätigkeit erfolgen sollte. Heben Sie die Array-Objektträger vorsichtig aus dem Puffer heraus. Sie sollten trocken herauskommen.
Danach laden Sie die Array-Schlitten zusammen mit den Schlittenprotectoren in die Schlittenhalter am Scanner ein und scannen anschließend die Proben. Gemäß den Anweisungen des Array-Herstellers wird jede Sonde auf einem hybridisierten Array als Mischung aus roten und grünen Fluorochromen visualisiert. Die Verhältnisse des roten zu grünen Fluoreszenzsignal für jede Sonde werden vom Scanner quantifiziert, und die zugehörige Software erfasst sie als Logarithmus-zu-Basis-zwei-Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position.
Die resultierenden Array-Spuren ermöglichen die Interpretation von Regionen, die als genomisch unausgeglichen identifiziert wurden. Beispielsweise wurde in dieser Spur eines Kindes mit Williams-Syndrom, einem wiederkehrenden Mikrodelitionssyndrom, das durch Low-Copy-Repeats im proximalen Bereich des Chromosoms sieben vermittelt wird, die genomische Unaufhebung von der Software mit einer roten Linie markiert. Der prop. fluoreszierende Logarithmus-Quotient sollte eng um Null streuen, was ein Verhältnis von grün zu rot von eins zu eins für normale Genomregionen anzeigt.
Verstreute Array-Spuren, wie sie bei dieser Analyse beobachtet wurden, können zu ungenauen Zuordnungen abnormaler Regionen oder zum Versagen bei der Identifizierung genomischer Ungleichgewichte führen und können durch verschiedene Faktoren verursacht werden, darunter schlechte DNA-Qualität oder die Anwesenheit von Strahlen, Ozonkonzentrationen in der Atmosphäre. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Patientenproben für die Untersuchung mittels aCGH aufzubereiten sind und wie qualitativ hochwertige Daten für die nachgeschaltete Analyse und Detektion von Kopplungszahlvariationen erzeugt werden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die arraybasierte komparative genomische Hybridisierung (aCGH) als Methode zur Detektion genomischer Kopplungszahlvarianten besprochen, die die traditionelle G-bandierte Karyotyp-Analyse weitgehend ersetzt hat. Das Verfahren zielt darauf ab, genomische Ungleichgewichte zu identifizieren, die zu verschiedenen genetischen Erkrankungen führen können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genomik
- Genetische Diagnostik
- Vergleichende genomische Hybridisierung
Hintergrund
- Array-CGH ist eine moderne Technik zur Analyse genomischer Variationen.
- Sie bietet einen detaillierteren Überblick über genomische Ungleichgewichte im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Die Technologie ist entscheidend für die Diagnose genetischer Syndrome.
- Die fluoreszenzmarkierte Kennzeichnung von DNA ist ein zentraler Schritt im Verfahren.
Zweck der Studie
- Um Kopienzahlvarianten in den Genomen von Patienten zu identifizieren.
- Um die diagnostische Genauigkeit bei genetischen Erkrankungen zu verbessern.
- Um die Anwendung der aCGH in einem klinischen Laboreinstellung zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Markierung der DNA des Patienten mit fluoreszierenden Farbstoffen.
- Hybridisierung der DNA des Patienten und der Referenz-DNA an ein Array.
- Scannen des Arrays zur Messung der DNA-Bindung an Sonden.
- Auswertung der gescannten Bilder zur Identifizierung genomischer Regionen mit Ungleichgewichten.
Hauptergebnisse
- Identifizierung genomischer Regionen mit Kopplungszahlvariationen.
- Nachweis der Wirksamkeit der aCGH bei der Diagnose genetischer Syndrome.
- Vergleich der DNA des Patienten mit einer Referenz zur Detektion von Ungleichgewichten.
- Überprüfung der Zuverlässigkeit der Methode im diagnostischen Kontext.
Schlussfolgerungen
- Array-CGH ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genetische Diagnostik.
- Die Technik verbessert das Verständnis genetischer Erkrankungen.
- Sie stellt eine bedeutende Weiterentwicklung gegenüber herkömmlichen Karyotypisierungsmethoden dar.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Array-CGH ermöglicht den hochauflösenden Nachweis genomischer Kopplungszahl-Varianten und unterstützt die Zielvalidierung in der genetischen Krankheitsforschung, indem sie quantitative, genomweite Daten zu Ungleichgewichten liefert. Diese Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem sie pathogene Varianten identifiziert, die mit Syndromen assoziiert sind, und trägt so zur mechanistischen Entwederisikominimierung und zur Priorisierung von Portfoliovorhaben in der frühen Entdeckungsphase bei. Ihre klinisch-diagnostische Anwendbarkeit findet sich in der Entwicklung biomarkerbasierter Assays für Programme zu seltenen Erkrankungen wieder.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Nachweis pathogener Kopienzahlvarianten im gesamten Genom.
- Operativer Wert: Liefert quantitative rot-zu-grün-Fluoreszenzverhältnisse zur präzisen Unausgeglichenheitsmessung pro Sondenprobe.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken mittels hochdichter Oligonukleotid-Arrays, die auf klinisch relevante Loci abzielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe durch gereinigte, markierte DNA-Hybridisierung vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch kontrollierte Waschschritte, Scannen und Log2-Verhältnisanalyse.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen, indem genomische Ungleichgewichte erkannt werden, die phänotypische Screening-Verfahren beeinträchtigen könnten.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Zuordnung zu krankheitsrelevanten Systemen, indem Syndrome wie das Williams-Beuren-Syndrom durch den Nachweis rekurrenter Mikrodeletionen identifiziert werden.
- Operationaler Wert: Stellt eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem ein konsistenter Vergleich mit Referenz-DNA erfolgt.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem die genomische Stabilität in Modellsystemen validiert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Forschung ein, wobei die Beurteilung der genomischen Integrität die Identifizierung von Leitstrukturen und die Eignung von Krankheitsmodellen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Identifizierung von Kopplungszahlveränderungen in krankheitsassoziierten Genen.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand der Vorbereitung des Hybridisierungspuffers und der Signalquantifizierung auf Sondenebene.
- Analytik: Hebt log-zwei-Ratio-Ausgaben hervor, die den Vergleich von Patienten-DNA mit Referenz-DNA über genomische Positionen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem genomische Hintergründe in krankheitsrelevanten Modellen validiert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit zur Batch-Verarbeitung von Proben aus Patienten oder Modellsystemen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeit.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Markierung von Nukleinsäuren, der Hybridisierung und der Fluoreszenzbildgebung.
- Benötigt Infrastruktur wie Mikroarray-Scanner, Flüssigkeits-Handling-Roboter und Hybridisierungsöfen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Auswahl der Sonden, den Waschprotokollen und der Festlegung der Verhältnisschwellenwerte.
- Erfordert Anpassungen hinsichtlich der Qualität der eingesetzten DNA und der Probentypen (Blut, Speichel, Gewebe).
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber DNA-Reinheit, Ozonkonzentrationen und Blasenbildung während der Hybridisierung.
