Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine vergleichende genomische Hybridisierung durchzuführen, um Ungleichgewichte im Genom zu identifizieren, die zu einer Vielzahl von genetischen Krankheiten führen können. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA des Patienten mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wird. Im zweiten Schritt werden der Patient, die DNA und eine anders markierte Referenz-DNA mit dem Array hybridisiert.

Als nächstes wird das Array gescannt, um die Menge des Patienten und die Referenz-DN zu messen, die für jede Sonde reichlich vorhanden sind. Im letzten Schritt wird das gescannte Bild verarbeitet, um die Regionen des Genoms zu identifizieren, in denen die DNA des Patienten mehr oder weniger Material enthält als das Referenz-DNA-Array. Die vergleichende genomische Hybridisierung wird verwendet, um festzustellen, ob der Patient eine Kopienzahlvariante trägt, die zu einem genetischen Syndrom führt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Zusammenbau des Array-Objektträgers schwierig sein kann und die Hybridisierung einfach ist. Mischen Sie den Auslauf aus der Kammer Vor Beginn der Markierungsreaktion. Tauen Sie die gebrauchsfertige 96-Well-Platte mit Nukleotiden und Primern bei vier Grad Celsius auf und schützen Sie sie etwa eine Stunde lang vor Licht.

Nach dem Auftauen die abgedeckte Platte für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren, äquilibrieren Sie die DNA-Proben ebenfalls für 15 Minuten bei 60 Grad Celsius. Während sich die Proben erwärmen, verwenden Sie einen Liquid-Handling-Roboter, um genügend nukleasefreies Wasser in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte zu dosieren. Wenn die DNA fertig ist, übertragen Sie ein Mikrogramm Probe pro Vertiefung auf die 96-Well-Platte mit Wasser.

Übertragen Sie nun 20 Mikroliter der äquilibrierenden Nukleotide und Primer auf jede Platte mit den verdünnten DNA-Proben und verschließen Sie die Platte mit Streifenkappen, wobei Sie auf einen dichten Verschluss achten. Als nächstes denaturieren Sie die DNA bei 99 Grad Celsius in einem PCR-Gerät mit beheiztem Deckel nach 10 Minuten und knieen die Primer durch Schnappen und kühlen die Platte fünf Minuten lang auf Eis ab. Verwenden Sie dann den Liquid-Handling-Roboter, um jeder Probe 10 Mikroliter des Clean-Out-Exo-DNA-Polymerase-Enzyms hinzuzufügen.

Mischen Sie die Proben mit einer Pipette und verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag beenden Sie die Reaktion mit fünf Mikrolitern Stopppuffer pro Vertiefung Entfernen Sie dann die nicht eingebauten Nukleotide. Übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einzelne, vorbeschriftete Zwei-Milliliter-Röhrchen.

Laden Sie die Proben und die Spin-Säulen für die DNA-Aufreinigung in einen Spin-Säulen-Verarbeitungsroboter sowie die entsprechenden zugehörigen Puffer. Gemäß den Anweisungen des Herstellers bindet der Spinnsäulen-Verarbeitungsroboter die markierte DNA mit 250 Mikrolitern hochsalzigem DNA-Bindungspuffer pro Röhrchen an die Kieselsäuremembran, wonach die Verunreinigungen mit zwei Waschgängen von jeweils 500 Mikrolitern Waschpuffer von den Membranen entfernt werden. Der Roboter fügt dann den Membranen 15 Mikroliter salzarmen Lösungspuffer hinzu, um die gereinigten markierten DNA-Proben in einem Volumen von etwa 12 Mikrolitern zu gewinnen und die Proben zu hybridisieren.

Als nächstes heizen Sie einen Hybridisierungsofen auf 65 Grad Celsius vor und wärmen die Objektträger und Hybridisierungskammern vor. Zur Herstellung der Hybridisierungsmischung werden 1,1 Mikroliter cot 1D NA, 4,95 Mikroliter der vom Hersteller gelieferten Blockierungsmischung und 24,75 Mikroliter Hybridisierungspuffer kombiniert. Verwenden Sie den Liquid-Handling-Roboter, um diese Mischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte zuzuweisen und jede Spitze vorzubenetzen, um die Übertragungsgenauigkeit zu erhöhen.

Als nächstes pipettieren Sie 9,35 Mikroliter der entsprechenden Signierung, drei markierte DNA, gefolgt von 9,35 Mikrolitern der entsprechenden Signierung, fünf markierte DNA. Um die Platte zu verschließen, vierexen Sie die Proben eine Minute lang und drehen Sie die Platte kurz, um den Inhalt am Boden jeder Platte zu sammeln. Denaturieren Sie die markierte DNA in einem Inkubator vor der Hybridisierung.

Zuerst für drei Minuten bei 95 Grad Celsius, dann 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Dann arbeiten wir auf einer 42 Grad Celsius beheizten Plattform. Setzen Sie den Trägerschlitten in die Hybridisierungskammer ein und stellen Sie sicher, dass der transparente Teil der Dichtung mit dem Fensterteil der Hybridisierungskammer ausgerichtet ist.

Pipettieren Sie nun langsam 42 Mikroliter der Hybridisierungsmischung in die Mitte der entsprechenden Position des Array-Objektträgers. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit die Gummiringgrenze nicht berührt. Sobald alle Positionen besetzt sind, senken Sie den Array-Schlitten vorsichtig auf den Trägerschlitten ab und bauen Sie die Hybridisierungskammer zusammen.

Achten Sie darauf, dass die Seite des Arrays mit der Beschriftung dem Trägerschlitten zugewandt ist, ziehen Sie dann die Schraube der Hybridisierungskammer vollständig fest und inspizieren Sie die zusammengebaute Hybridisierungskammer, um sicherzustellen, dass keine Hybridisierungsleckage vorliegt. Mischen Sie außerhalb der Gummiringgrenzen und dass jede Luftblase etwa vier Millimeter hoch ist. Wenn die Hybridisierungskammer vertikal auf ihrem Ende aufliegt, drehen Sie die Hybridisierungskammer, um dies zu überprüfen.

Alle Luftblasen in jeder Position bewegen sich. Wenn eine der Blasen feststeckt, klopfen Sie kräftig auf die Bank. Dann stellen Sie die Hybridisierungskammern für 24 Stunden bei 65 Grad Celsius in den rotierenden Ofen.

Tauchen Sie am nächsten Tag die Hybridisierungskammern in Waschpuffer eins und hebeln Sie die Objektträger mit einer flachkantigen Kunststoffzange auseinander. Entsorgen Sie dann die Dichtungsschieber und legen Sie die Array-Objektträger in ein Rack, das in frischen Puffer eingetaucht ist. Waschen Sie die Objektträger ein bis fünf Minuten lang in etwa 700 Millilitern Waschpuffer und rühren Sie dabei kräftig mit einem Floh und einem Magnetstern um.

Übertragen Sie dann die Objektträger des Arrays auf etwa 700 Milliliter Waschpuffer, zwei für 90 Sekunden und stärkeres Rühren am Ende des zweiten Waschvorgangs. Heben Sie die Array-Schieberegler vorsichtig aus dem Puffer heraus. Sie sollten trocken herauskommen.

Legen Sie dann die Array-Objektträger zusammen mit den Objektträgerschutzfolien in die Objektträgerhalter am Scanner ein und scannen Sie dann die Proben. Gemäß den Anweisungen des Array-Herstellers wird jede Sonde auf einem hybridisierten Array als eine Mischung aus roten und grünen Fluorochromen visualisiert. Die Verhältnisse des roten zu grünen Fluoreszenzsignals für jede Sonde werden vom Scanner quantifiziert und von der zugehörigen Software entsprechend ihrer genomischen Position als log zwei Verhältnisse gelotst.

Die resultierenden Array-Traces ermöglichen die Interpretation von Regionen, die als genomisch unausgeglichen identifiziert wurden. In dieser Spur eines Kindes mit Williams-Syndrom, einem wiederkehrenden Mikrodeletionssyndrom, das durch geringe Kopienwiederholungen in der proximalen Region des Chromosoms sieben vermittelt wird, wurde beispielsweise das genomische Ungleichgewicht von der Software mit einer roten Linie identifiziert. Das Prop-Fluoreszenz-Logarithmus-Verhältnis sollte sich eng um Null gruppieren, was auf ein Grün-Rot-Verhältnis von eins zu eins für normale Regionen des Genoms hinweist.

Verstreute Array-Spuren, wie sie in diesem Scan beobachtet wurden, können zu einer ungenauen Bezeichnung der abnormalen Regionen oder zu einem Versagen bei der Identifizierung des genomischen Ungleichgewichts führen und können durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden, einschließlich schlechter DNA-Qualität oder des Vorhandenseins von Strahlen oder Ozonwerten in der Atmosphärensphäre. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Patientenproben für Tests durch A CGH verarbeitet und qualitativ hochwertige Daten für die nachgelagerte Analyse und den Nachweis von Kopienzahlvariationen erstellt werden.