Name: In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die 3D-Kultivierung von embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen in Matrigel zur Erzeugung verzweigter Organoide. Diese Methode ermöglicht Expansion, Differenzierung und Selbstorganisation für die Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde nacheinander von einem NFS Frontiers in Genetics Pilot Auszeichnung, Juvenile Diabetes Research Foundation Grants 41-2009-775 und Grant 12-126875 von Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom finanziert. Die Autoren danken der Spagnoli Labor für die Ausrichtung der Videoaufnahmen.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu wachsen Bauchspeicheldrüsen Organoide aus murinen E10.5 abgeleitet dissoziiert epithelialen Zellen der Bauchspeicheldrüse. Das Protokoll erfordert ethische Genehmigung für Tierversuche. 1. Präparation der dorsalen Pankreas-Knospe von E10.5 Maus Embryonen <ol><li> Sacrifice timed-schwangeren Mäusen an embryonalen Tag (E) 10.5, öffnen Sie den Bauch mit einer Schere entfernen Sie die beiden Uterushörner und legen Sie sie in einem 10-cm-Petrischale mit kaltem Phosphat-Pufferlösung (PBS) gefüllt oder Dulbecco modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) auf Eis gehalten. Die Gesamt Experiment aus dem Opfer zu Zellaussaat ist in 60-90 Minuten durchgeführt, um Zellschäden zu verhindern. </li><li> Trennen Sie die Gebärmutter in einzelne Segmente Embryo mit einer kleinen Schere. Übertragen eines Embryos auf eine 35 mm Petrischale mit kaltem PBS und visualisieren sie unter einem Binokular mit Beleuchtung von oben. Mit einer Pinzette entfernen Dissektion der umliegenden Muskeln, decidua und Dotter sac und setzen den Embryo. Setzen Sie den Embryo wieder in kaltem DMEM Medium. Embryonen kann leicht mit Hilfe eines 3-ml-Plastiktransferpipette / Dropper übertragen werden. Isolieren jedes einzelnen Embryos in ähnlicher Weise vor dem Fortfahren. </li><li> Legen Sie einen Embryo in eine saubere 35-mm-Petrischale in PBS. <ol><li> Verwenden dünnen Pinzette (0,05 mm Breite), um die Vordergliedmaße zu entfernen. Sanft die Zange im Öffnungseinsatz um den Verdauungstrakt aus dem Rückenmark Region (Fig. 1) zu lösen. Optional: Um bequemer sehen den Magen, entfernen Sie den Oberkörper des Embryos, bis hin zu Herz-und Heckbereich unterhalb des Dotter Stiel. </li><li> Suchen Sie den Magen, Leber und Darm. Mit den Zangen, isolieren die Magen-Darmtrakt aus dem Magen in den Darm und legen Sie sie in kaltem DMEM auf Eis (Abbildung 1). Die dorsale Pankreas Knospe dorsal angebracht, hinter dem Magen (Abbildung 1). </li><li> Isolieren Sie jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einer ähnlar Weise, bevor Sie fortfahren. Wenn die Embryonen müssen genotypisierende, sammeln den Schwanz zum Zeitpunkt der Präparation und halten jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einem anderen auch in einer 24-Well-Platte mit kaltem DMEM auf Eis. </li></ol></li><li> Legen Sie ein Magen-Darm-Trakt in einem sauberen 35 mm Petrischale in kaltem PBS. Jetzt benutze Beleuchtung von unten in Hellfeld unter der Dissektionsmikroskop visualisieren und sezieren die dorsalen Pankreas Knospe. Diese Bedingungen werden die Visualisierung von Volumen zu optimieren. Mit elektrolytisch geschärften Wolfram Nadeln oder 20 G Spritzennadeln, isolieren das Pankreas Knospe mit so wenig wie möglich um Mesenchym des Epithels (Abbildung 1). <ol><li> Übertragen der isolierten Knospe in eine Petrischale mit einem kalten Dispase-Lösung (1,25 mg / ml) für 2-3 min. Von diesem Punkt kann die Übertragung am einfachsten mit flamm gezogen 50 ul Glaskapillaren mit einem Mund-gesteuerten flexiblen Schlauch befestigt erfolgen. Alternativ, aber mit mehr risk verlieren die Knospe, verwenden Sie eine 10 ul automatischen Pipette (Pipetman) mit entsprechenden Kunststoffspitzen. </li><li> Führen Pankreas Knospe Aspiration und Ausstoß unter mikroskopischer Kontrolle. Setzen Sie den Pankreas Knospe zurück in PBS. Weitere aus dem Mesenchym mit den Nadeln und leichtes Ansaugen mit der Glaskapillare (Abbildung 1) reinigen die isolierte Pankreasknospe. </li><li> Wenn das gesamte Mesenchym entfernt ist, spülen Sie die Pankreas Knospe in kaltem PBS; Übertragen Sie jede Knospe zu kalt DMEM in einzelnen Vertiefungen (60-well Mini-Trays mit 10 ul kalten DMEM gefüllt). Es ist wichtig, das Mesenchym in Dispase zu entfernen, die das Gewebe sehr klebrig macht. </li></ol></li></ol> 2. Überzug und Kultur der dispergierten Zellen <ol><li> Übertragen Sie die seziert Epithelien aus allen Embryonen mit einem flamm gezogen Glaskapillare in konische Vertiefungen der 60-Well-Mini-Trays mit 10 ul PBS gefüllt zum Spülen. <ol><li> Übertragen Sie die Knospe in 10 ul Trypsin 0,05% einnd lassen Sie es bei 37 ° C inkubieren 4 min. Inaktivierung des Trypsins durch Übertragen der Keim in einem gut mit 10 &amp;mgr; l DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS). </li><li> Distanzieren Sie die Zellsuspension durch Aspiration durch eine dünne Kapillare mit einer Pipette Puller gezogen. Es ist wichtig, um Blasen zu vermeiden, in dieser Phase, während und Abpipettieren, um die Zellen zu distanzieren. Bauchspeicheldrüse Organoide optimal vor kleinen Gruppen von 5-15 Zellen beginnen und deshalb teilweise Dissoziation empfohlen (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Pool der Zellen aus mehreren Embryonen in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Unterschiede aufgrund der individuellen Verarbeitung zu minimieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in gekühlten Matrigel bei einem Verhältnis von 1:3. Aliquote dieser Mischung in eine 96-Well-Platte, 8 &amp;mgr; l / Vertiefung in einer Platte oder für die Abbildung optimiert (siehe unten). </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 Minuten, so dass die Matrigel zu verdicken. Füllen Sie die Vertiefungen mit 70 ul Medium der Wahl (Organoid oder Kugel, siehe Tab.les 1 und 2) und lassen in einer befeuchteten Umgebung mit 5% CO 2 und 95% Luft bei 37 ° C. </li><li> Jeden 4. Tag Ersetzen Sie das Medium. Überwachen Sie die wachsenden Kolonien Bauchspeicheldrüsen täglich und dokumentieren den Prozess durch Bildgebung. </li><li> Kleine Moleküle oder Proteine ​​von Interesse können dem Medium zu diesem Zeitpunkt für Interferenzexperimente hinzugefügt werden, wie vorher 28 gemeldet. </li></ol> Tabelle 1: Organoide Medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Name des Materials </td><td> Auf Konzentration </td><td> Konzentration in endgültige Medium </td><td> Volumen der Stamm </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> KnockOut Serum Ersatz (Ergänzung) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td&gt; <td> 0,1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) </td><td> 16 uM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK-Inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 &amp;mgr; g / ml </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Rekombinantem humanem R-1 Spondin </td><td> 250 &amp;mgr; g / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Oder - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Mouse R-1 Spondin </td><td> 250 &amp;mgr; g / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Rekombinantem humanem FGF1 (aFGF) </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 25 &amp;mgr; g / ml </td><td> 1,25 ul </td></tr><tr><td> Heparin (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2,5 U / ml </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Recomnante Menschen FGF10 </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Sphere Medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Name des Materials </td><td> Auf Konzentration </td><td> Konzentration in endgültige Medium </td><td> Volumen der Stamm </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (Ergänzung) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Recombinant Human FGF2 (bFGF) </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK-Inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> 3. Imaging der Progression der Organoide Entwicklung <ol><li> Bild Organoide mit einem fluoreszierenden Zeitraffer-Mikroskop entweder täglich oder Zeitraffer-Mikroskopie. Für Zeitreihen-Aufnahmen, verwenden Sie ein XY (Z) automatisierte invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Kaution kleine Tröpfchen von 3 ul in 4-Well-Platten oder Glasbodenplatten mit 2-5 ml Medium gefüllt ist. Bild mit einem 10-fach Fernziel. Hinweis: Transgene Mäuse, die fluoreszierenden Indikatoren verwendet werden. Film 1 zeigt zum Beispiel die anfängliche Expansion Organoide von Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + 4 Mäuse. Die Kern GFP ermöglicht dem Benutzer, Zellen zu verfolgen als einzelne Objekte aber ähnliche Prinzipien angewendet werden, um Zellen mit Membran Fluoreszenz verfolgt werden,als mT / mg Mäuse 29. </li><li> Starten Zeitraffer-Bildgebung 3 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, um den Fokus Verwehungen zu vermeiden und setzen die Software die Steuerung Automatisierung, um ein Bild / h für 3 oder mehr Tage bei manuell definierten Positionen zu nehmen. Für jede Position, erwerben eine Differentialinterferenzkontrast (DIC), als auch die GFP-Signal, Reporting Fluoreszenzmarker Ausdruck. </li></ol> 4. Wiederherstellung von Organoide für Histologie <ol><li> Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium, mit eiskaltem PBS ersetzt. Diese teilweise depolymerisiert Matrigel. </li><li> Vorsichtig absaugen jedes einzelne OBs, das Entfernen der umgebenden Matrigel mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht zu stören. Übertragen Sie jede Organoid zu einem gut mit eiskaltem PBS. Halten Sie die Platte auf Eis. Direktbefestigung in Matrigel ist ebenfalls möglich. </li><li> Befestigen Sie die Organoid für 15 min in 4% Paraformaldehyd (PFA), Kryokonservierung in Saccharose und binde sie in Gelatine. An jederorganoiden für Kryoschneiden und Histologie wie zuvor beschrieben (Johansson et al., 2007) 4. </li></ol> 5. Organoide Erholung der für die PCR und Biochemie <ol><li> Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium. In 60 ul pro RNAlater auch zur Stabilisierung und zum Schutz zellulärer RNA. </li><li> Stört Sie das Gel in jedem gut mechanisch durch teilweise Depolymerisation es auf Eis. Entweder erholen einzelnen Organoide mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht stören oder Wiederherstellung der kompletten gut (mit Matrigel) durch Unterbrechung der Gel mechanisch mit einer 200 ul Spitze. Verwenden Sie ein 1.000 ul Spitze, die auch Inhalt in ein RNase-frei nicht klebrig Eppendorf-Röhrchen übertragen auf Eis gehalten. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 60 ul RNAlater und das restliche Inhalt zum gleichen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Dreh die Röhrchen für 5 min bei 500-1.000 x g bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, so dass nur 20-30 ulRNAlater in das Rohr zusammen mit dem Pellet. Für Biochemie, speichern Sie die Proben so trocken wie möglich. </li><li> Proben in RNAlater sofort nicht einfrieren; bei 4 ° CO / N (damit RNAlater, um das Gewebe gründlich zu durchdringen). Das Gewebe kann bei -20 ° C zur Langzeitspeicher gespeichert werden und können später zur Gewebezerstörung und Extraktion von kleinen Mengen von RNA verarbeitet werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Großtechnische Produktion von Funktions Beta-Zellen in vitro ist immer noch ineffektiv ein. In diesem schwierigen Kontext kann der Entwicklungsbiologie Studien helfen, die Entschlüsselung der Signale, die exakte für die Differenzierung von funktionellen Beta-Zellen benötigt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Erhaltung, Expansion und Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen in embryonalen vitro. Dazu gehören die Bildung von Insulin-produzierenden Beta-Zellen, die nicht mit-e...

Orgelkultur bietet ein nützliches Modell, das die Lücken zwischen der komplexen, aber sehr relevant in-vivo-Untersuchungen und die bequeme, aber ungefähre Simulation von Zelllinie Modelle überbrückt. Im Falle der Bauchspeicheldrüse, gibt es keine Zelllinie perfekt entspricht Pankreas-Vorläufer, obwohl es sind transformierte Zellinien Simulation endokrine und exokrine Zellen. Die erwachsenen ganze Bauchspeicheldrüse kann nicht kultiviert werden; endokrinologischen Inseln können für einige Wochen beibehalten werden, ohne die Zellproliferation und Gewebeschnitten können in vitro für einige Stunden 5 gehalten werden. Embryonale Bauchspeicheldrüse Kultur ist weit verbreitet, nicht nur ihre Entwicklung zu studieren, sondern auch epitheliale-mesenchymale Interaktionen 4,6,7 untersuchen, Bild verarbeitet 8 oder 9, um mit ihnen chemisch stören. Zwei Orgelkultur Methoden werden hauptsächlich verwendet: Die erste besteht in der Kultivierung von Bauchspeicheldrüsenknospen auf Fibronektin-beschichtete Platten 2, das ist komfortabler zur Bildgebung; Die zweite Möglichkeit ist die Kultur die Organe über Filter an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die 3,4 am besten bewahrt Morphogenese. Obwohl sehr nützlich führen diese Verfahren zu einem gewissen Grad der Abflachung; der Ausbau der Vorläufer sehr begrenzt im Vergleich zu der normalen Entwicklung und der Ausgangspopulation Komplex, alle Typen von pankreatischen Zellen und mesenchymalen Zellen. Die Fähigkeit, Kultur und erweitern verteilten Primärzellen ist wertvoll für Linie Beziehungen zu studieren und entdecken Sie die intrinsischen Eigenschaften von isolierten Zelltypen 10. Sugiyama et al 11. Könnte Pankreas-Vorläufern und endokrine Vorläuferzellen, die einige funktionale Zeichen für 3-5 Tage in Kultur auf Feeder-Schichten beibehalten zu halten. Pancreatospheres, ähnlich Neurosphären mammospheres 12 und 13 sind aus adulten Inseln und duktalen Zellen erweitert worden, obwohl die Art der Vorläufer / Stammzellen, die diese Kugeln zu erzeugen, ist nicht klar. Darüber hinaus im Gegensatz physiologische Entwicklung enthielten die pancreatospheres einige Neuronen 14,15. Kugeln wurden vor kurzem auch aus embryonalen Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse 16,17 und regenerierende Bauchspeicheldrüsen 18 mit guten Vorläufer Expansion und nachfolgende Differenzierung produziert aber nicht Morphogenese rekapitulieren. 3D-Modelle aus dispergierten, oft definierte Zellen, die durch Selbstorganisation miniaturisierten Organen mit blühten und simulieren die Entwicklung oder Erwachsener Umsatz von mehreren Organen, wie dem Darm 19,20, dem Magen 21, Leber 22, die Prostata 23 und die Trachea 24. In einigen Fällen wurden Entwicklungs Morphogenese und Differenzierung von ES-Zellen 3D rekapituliert wurde, wie im Fall der Augenbecher 25, 26 Darm, Gehirn 27. Hier haben wir describe eine Methode, um multi dissoziierten Pankreas-Vorläuferzellen in einer 3D-Matrigel Gerüst, wo sie differenzieren können und selbst zu organisieren, zu erweitern.

<table><tbody><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Lagerbestand gehalten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz (Ergänzung)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Lagerbestand gehalten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Lagerbestand bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Phorbol Myristatacetat (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Lagerbestand bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK-Inhibitor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Lagerbestand bei -20 °C gehalten. Achtung! Stabilität/Quelle ist eine häufige Ursache für Probleme.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Bestand bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Lagerbestand bei -80°; C</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td>Lagerbestand bei -80 &° gehalten; C</td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF1 (aFGF)</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td>Lagerbestand bei -80 > C - zur Steigerung der Betazellproduktion</td></tr><tr><td>Heparin (Liquemin)</td> nicht einschließen <td>Drossapharm</td><td></td><td>Bestand bei 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG-025</td><td>Lagerbestand bei -80 > C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Lagerbestand gehalten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>B27 x50 (Zuschläge)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Lagerbestand gehalten bei -20 > C</td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF2 (bFGF)</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td>Lagerbestand bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Lagerbestand bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Lagerbestand bei 4 > C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA-stabilisierendes Reagenz</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>Dispase lagern&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Arbeitskonzentration: 1,25 mg/ml. Lagerbestand bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BSA zur Rekonstitution</td><td>von Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>Zur Rekonstitution von Zytokinen&nbsp; - Vorrat bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Lagerbestand bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>60-Well-MicroWell-Trays</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95-Well-Platten F Boden</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenplatten</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Einwegglas-Mikropipetten</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td>Cell&#174; Bildgebungsstation (motorisiertes invertiertes Stativ Olympus IX81), ausgestattet mit einer Hamamatsu ORCA ER B7W Kamera und dem Ludin Cube und der Box. 
Leica DMI6000 B-Ständer, umgeben von einem Ludin Cube und einer Box, ausgestattet mit einer Leica DFC365 FX Kamera und der AF6000 Expert/Matrix Software-Befehlsschnittstelle.</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0,30 Luft 9,50 mm 10X lange Distanz; 
Leica HC PL FLUOTAR NA 0,30 Luft 11,0 mm 10X lange Distanz</td></tr></tbody></table>

in-vitro-pankreas organogenese von dispersed embryonalen maus-vorläufer

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

Die Bauchspeicheldrüse ist ein essentielles Organ, das die Glukosehomöostase reguliert und Verdauungsenzyme absondert. Die Erforschung der Embryogenese der Bauchspeicheldrüse hat zur Entwicklung von Protokollen zur Herstellung von Pankreaszellen aus Stammzellen geführt 1. Das gesamte embryonale Organ kann in mehreren Entwicklungsstadien kultiviert werden 2-4. Diese Kulturmethoden haben sich als nützlich erwiesen, um Medikamente zu testen und Entwicklungsprozesse abzubilden. Die Ausdehnung des Organs ist jedoch sehr begrenzt und die Morphogenese wird nicht getreu rekapituliert, da das Organ abflacht. 
Wir schlagen dreidimensionale (3D) Kulturbedingungen vor, die die effiziente Expansion von dissoziierten embryonalen Pankreas-Vorläuferzellen der Maus ermöglichen. Durch Manipulation der Zusammensetzung des Kulturmediums ist es möglich, entweder Hohlkugeln zu erzeugen, die hauptsächlich aus Pankreasvorläuferzellen bestehen, die sich in ihrem Ausgangszustand ausdehnen, oder komplexe Organoide, die sich zu reiferen expandierenden Vorläuferzellen entwickeln und sich in endokrine, azinäre und duktale Zellen differenzieren und sich spontan selbst organisieren, um der embryonalen Bauchspeicheldrüse zu ähneln. 
Wir zeigen hier, dass der In-vitro-Prozess viele Aspekte der natürlichen Bauchspeicheldrüsenentwicklung rekapituliert. Dieses Kultursystem ist geeignet, um zu untersuchen, wie Zellen zusammenarbeiten, um ein Organ zu bilden, indem seine anfängliche Komplexität auf wenige Vorläuferzellen reduziert wird. Es handelt sich um ein Modell, das die 3D-Architektur der Bauchspeicheldrüse reproduziert und daher nützlich ist, um die Morphogenese zu untersuchen, einschließlich der Polarisation von Epithelstrukturen und Verzweigungen. Es ist auch angebracht, die Reaktion auf mechanische Signale der Nische wie Steifigkeit und die Auswirkungen auf die Tensegrity der Zelle zu bewerten.

E10.5 dorsalen Pankreasvorläuferzellen dissoziiert und in 3D Matrigel ausgesät rekapitulieren Bauchspeicheldrüse Entwicklung. Vorläufer lassen sich am einfachsten mit fluoreszierenden Reporter verfolgt werden. In unserem Fall haben wir eine transgene Maus, die ein Kernprotein mit GFP Pdx1 Promotor (Pdx1-Ngn3-ER-nGFP TM) (Film 1) in Abwesenheit von Tamoxifen und so gesteuert ohne Aktivierung NEUROG3 4 (Fig. 2) drückt. Mit dem organoiden...

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, assoziierte multipotente Pankreasvorläuferzellen in einem dreidimensionalen Matrigel-Scaffold zu expandieren, wo sie differenzieren und sich selbst organisieren können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Pankreas aus 10,5 Tage alten Maus-Embryonen isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Mesenchym zu entfernen und das Epithel in Einzelzellen und kleine Zellhaufen zu dissociieren.Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Matrigel zu suspendieren und das polymerisierte Gel zur Expansion zu inkubieren. Letztlich führt dies zu selbstorganisierenden, verzweigten pankreatischen Organoiden, die dem embryonalen Mauspankreas ähneln und mittels Mikroskopie entweder lebend oder am Verschlusspunkt visualisiert werden können. Der wesentliche Vorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren, wie beispielsweise allen Pankreas-Explantaten, liegt darin, dass man von einer gut definierten und weniger komplexen Zellpopulation ausgeht.Pankreatische Vorläuferzellen werden in 3D-Zellkulturen besser als in 2D-Zellkulturen erhalten. Diese Methode kann uns helfen, einige zentrale Fragen innerhalb des Forschungsfeldes zu bea

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine dreidimensionale klonogene Test, dass Pankreas-like Vorläuferzellen in Insulin-exprimierenden Kolonien unterscheiden können beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile von halbfesten Medien mit Methylcellulose, Matrigel und Wachstumsfaktoren, in denen einzelne Vorläuferzellen proliferieren und...

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine...

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die 3D-Kultivierung von embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen in Matrigel zur Erzeugung verzweigter Organoide. Diese Methode ermöglicht Expansion, Differenzierung und Selbstorganisation für die Entwicklungsbiologie.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

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