Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Sehfunktion von Kaulquappen zu testen, indem die Zeit aufgezeichnet wird, die das Tier auf der Hälfte des Testbeckens verbringt, die schwarz bedeckt ist. Dies wird erreicht, indem die Kaulquappen zunächst auf die Stadien 45 bis 50 angehoben werden. Der zweite Schritt besteht darin, einen halb schwarzen, halb weißen Tank zusammen mit einer Kamera für den Verhaltenstest einzurichten.

Setze dann einen zweiten Tank mit einer Kaulquappe in den äußeren Tank ein. Für jede Kaulquappenaufzeichnung wird das sehgesteuerte Verhalten geändert, da der Hintergrund in der Umgebung geändert wird. Der letzte Schritt besteht darin, eine retinale Ex-Sodomie an den Kaulquappen durchzuführen und dann den Verhaltenstest zu wiederholen.

Letztendlich werden die Daten aus diesem einfachen, kostengünstigen Assay verwendet, um zu zeigen, dass die Kaulquappen unter Tests des Phototop-Sehvermögens eine Vorliebe dafür haben, auf einer Seite des Beckens zu schwimmen und nicht auf der anderen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Techniken wie der optischen kinetischen Reaktion oder dem Tail-Flip-Assay besteht darin, dass es sich um eine kostengünstige, einfache Methode handelt, bei der Geräte verwendet werden, die in den meisten Opus-Labors leicht verfügbar sind. Um die Kaulquappen vorzubereiten, erhalten Sie zunächst befruchtete Xenopus-Embryonen, legen Sie Markierungen, modifizierte Ringer oder MMR, die um den Faktor 10 verdünnt sind, in 60-Millimeter-Petrischalen mit 50 Mikrogramm pro Milliliter.

Gentamycin-Antibiotikum platzieren Blastula im Neuralplattenstadium von Embryonen. Stadien zwei bis 15 bei 18 Grad Celsius in den Petrischale. Sobald die Embryonen ein neues Becherstadium von etwa 27 bis 30 erreichen, stellen Sie sie ohne Antibiotika auf 0,1 XMMR um, um das Wachstum der Darmbakterien zu ermöglichen.

Wenn die Kaulquappen das Fressstadium um Stufe 45 erreichen, bringen Sie sie in 100-Millimeter-Petrischalen mit 0,1 XMMR. Füttern Sie sie am nächsten Tag mit Brennnesselpulverüberstand. Füllen Sie nach einer Woche in der 100-Millimeter-Petrischale einen halben Gallonentank mit Froschwasser.

Bringen Sie die Tiere in das Aquarium und setzen Sie den Fütterungsplan für den Brennnesselpulverüberstand fort, aber wechseln Sie das Wasser nur zwei- bis dreimal pro Woche. Wenn sich die Tiere in Halb-Gallonen-Tanks befinden, halten Sie sie in einem 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus, wobei die Lichter um 6:00 Uhr morgens eingeschaltet werden. Stellen Sie vor dem Test den Halb-Gallonen-Tank mit den Probanden über Nacht mindestens 12 Stunden vor dem Test auf eine weiße Oberfläche. Der Verhaltenstest sollte in einem ruhigen, wenig frequentierten Bereich mit Standard-Leuchtstofflampen durchgeführt werden.

Bereiten Sie zwei ineinander verschachtelte halbe Gallonen Testtanks an den äußeren Ecken des inneren Tanks vor. Markieren Sie mit einem Edding die Wasserlinie fünf Zentimeter über dem Boden. Identifizieren Sie auch für den Innentank alle Vertiefungen im Inneren.

Füllen Sie diese mit einer inerten Masse, um zu verhindern, dass Kaulquappen darin verweilen. Wenden Sie sich nun dem zweiten äußeren Tank zu. Besorgen Sie sich für den nächsten Schritt schwarzes Isolierband und weißes Seidenpapier.

Verwenden Sie das Klebeband, um die Außenseite einer Hälfte des Tanks abzudecken, und das Seidenpapier, um die Außenseite der anderen zu bedecken, wie hier gezeigt. Sobald die Tanks vorbereitet sind, stellen Sie einen Impfdrehtisch auf und platzieren Sie die verschachtelten Tanks darauf. Positionieren Sie ein Stativ und eine Webcam so, dass die Kamera das Innere der Panzer von oben abbilden kann.

Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Videoaufnahme- und -wiedergabesoftware an. Schalten Sie die Kamera ein und bereiten Sie sich auf die Aufnahme eines neuen Films vor. Drapieren Sie dann ein leichtes Baumwolltuch über die Kamera und die Tanks.

Um externe Signale auf die Kaulquappen zu reduzieren, verwenden Sie ein Leuchtdichtemessgerät und überprüfen Sie, ob die Leuchtdichte unter dem Tuch zwischen 35 und 50 Kerzen pro Quadratmeter liegt. Starten Sie den Verhaltenstest, indem Sie den inneren Testtank entnehmen. Füllen Sie es bis zur Fünf-Zentimeter-Marke mit Froschwasser.

Verwenden Sie ein Netz, um ein Tier aus seinem halben Gallonenbehälter in den inneren Testtank am Computer zu transportieren. Stellen Sie sicher, dass die Aufzeichnungssoftware geöffnet ist und den Testbereich zur Aufzeichnung aufzeichnet. Schreibe den Namen des Tieres, das Datum und die Uhrzeit auf ein Blatt Papier.

Platzieren Sie diese für die Aufnahme unter der Kamera. Nachdem dies erledigt ist, stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten ein. Richten Sie als Nächstes den äußeren Tank auf dem Drehteller aus, so dass die schwarze Seite nach rechts zeigt.

Setzen Sie nun den Testtank in den Außentank ein. Schließen Sie im Aufnahmebereich das Vorhang und verwenden Sie den Computerbildschirm, um die Ausrichtung des äußeren Tanks zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Video aufgezeichnet wird, und starten Sie den Timer.

Wenn der Timer piept, halten Sie das Tuch in Position und entfernen Sie den inneren Prüfbehälter. Drehen Sie als Nächstes den äußeren Tank um 180 Grad, sodass sich die schwarze Seite nun auf der linken Seite befindet. Setzen Sie den Testtank wieder in den äußeren Tank ein und starten Sie den Zwei-Minuten-Timer.

Entfernen Sie erneut den Innentank. Drehen Sie den äußeren Tank um 180 Grad und tauschen Sie den inneren Tank alle zwei Minuten aus, insgesamt 10 Mal. Wenn Sie fertig sind, stoppen Sie die Videoaufnahme.

Setze die Kaulquappe wieder in ihren halben Gallonentank ein. Bereiten Sie ein Mikroskop für die Durchführung der Retinol-Ex-Sodomie vor. Füllen Sie eine 60 Millimeter Petrischale mit 1%aros geschmolzen in 0,1 XMMR und lassen Sie es erstarren.

Entferne ein kleines rechteckiges Stück des Aros in der Größe einer Kaulquappe. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, holen Sie das Versuchstier zurück und setzen Sie es in 0,02 % Trica. Fahren Sie fort, wenn es nicht auf eine Schwanzklemme mit der Pinzette Nummer drei reagiert.

Gib dann das Tier in die Schüssel. Fahren Sie fort, indem Sie die Petrischale auf das Mikroskop montieren. Bereiten Sie sich darauf vor, das Tier mit einer Pinzette auf einer Seite abzustützen.

Auf der gegenüberliegenden Seite stechen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel in einem 45-Grad-Winkel in die Haut hinter dem dorsalen Bereich des Auges, greifen vorsichtig in das Loch mit der Nummer fünf, einer Pinzette und schneiden den Sehnerv ab, während Sie die Vene daneben vermeiden. Schieben Sie den Nerv aus dem Weg und ziehen Sie die Pinzette nach der Operation zurück. Erholen Sie das Tier, indem Sie es in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 0,7 XMMR und 50 Mikrogramm pro Milliliter legen.

Gentamycin für 20 Minuten. Bringen Sie danach die Kaulquappe in ein Auffangbecken mit Strahlwasser. Stellen Sie den Tank zur Vorbereitung auf den Test auf eine weiße Oberfläche.

Lassen Sie das Tier über Nacht ruhen. Am nächsten Morgen verwenden Sie den Verhaltenstest, um die Sehfunktion zu testen. Dieser Film zeigt repräsentative Daten für das Experiment.

Links sind die Tiere vor der Operation zu sehen, rechts die gleichen Tiere, nachdem die Netzhautaxone beider Augen durchtrennt wurden. Dies wird durch den Schaltplan in den unteren Ecken angezeigt. Das Wasser wurde aufgewühlt, um zu zeigen, dass nichts hinzugefügt wurde, was die Tiere von der schwarzen Seite abstößt oder sie auf die weiße Seite lockt.

Die Kaulquappen vor der Operation reagieren in weniger als 30 Sekunden auf die Hintergrundfarbe, während die blinden Kaulquappen ziellos um das Becken herum schwimmen. Dieses Diagramm zeigt den Prozentsatz der Zeit, die ein einzelnes Tier unter drei Bedingungen im weißen und schwarzen Bereich verbracht hat. Zunächst wurde das Tier vor jeder Operation mit dem Assay beobachtet.

An zwei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Durchtrennung des rechten Sehnervs wurde sein Verhalten über zwei Testtage hinweg beobachtet. Nachdem beide Sehnerven durchtrennt worden waren, gab es schließlich zwei weitere Tage der Beobachtung mit dem Assay. Das Tier verbrachte mehrere Tage auf der weißen Seite des Beckens, wenn mindestens ein Sehnerv intakt war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Sehvermögen von Kaulquappen mit einfachen Reagenzien und Geräten testen können, die in den meisten Froschlaboren zu finden sind. Viel Glück bei Ihren Experimenten.