Name: Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die visuelle Funktion von Xenopus laevis-Kaulquappen mit einem einfachen Verhaltenstest untersuchen. Diese Methode erfasst die Zeit, die Tiere auf der weißen Seite eines schwarz-weißen Tanks verbringen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) und EY019517 (ASV). Diese Arbeit wurde von der Forschung unterstützt, um Blindheit gebundene Zuwendung an die Augenklinik und die Lions des Zentral New York verhindern. Wir möchten auch unseren Tiertechniker, Matthew Mellini, für seine hervorragende Betreuung der Tiere und für die Intensivierung in in diesem Video Star danken.

Tierpflege Die Xenopus laevis Kaulquappen in dieser Studie verwendet wurden nach Verfahren, die von Upstate Medical University IACUC und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt angebaut, aufgezogen und behandelt. . Ein Pre-Verhalten Setup: Kaulquappen <ol><li> Erhalten befruchteten Xenopus-Embryonen aus einer handelsüblichen Quelle oder in vitro zu befruchten Oozyten, wie oben beschrieben 6. </li><li> Zeigen Blastula zu Neuralplatte Embryonen bei 18 ˚ C in 60 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR [10 X Marc Geändert Ringer-(MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, eingestellt auf pH 7,5, autoklaviert und bei RT gelagert)] mit 50 ug / ml Gentamicin-Antibiotikum. Ändern 0,1 X MMR jeden Tag und entfernen Sie alle toten Embryonen. </li><li> Sobald die Embryonen erreichen Nieuwkoop und Faber Bühne ~ von 27. bis 30. Juli, schalten thE Embryonen in 0,1 × MMR ohne Antibiotikum Darm Bakterienwachstum zu ermöglichen. </li><li> Wachsen die Kaulquappen, bis sie die Fütterungsstufe (Stufe 45) zu erreichen und sie in 100 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR gefüllt. Füttere sie Brennnesselpulver Stand jeden zweiten Tag für eine Woche, die Änderung der MMR 0,1 X auf dem dazwischen Tag. </li><li> Nach einer Woche in der 100-mm-Petrischale, verschieben Tiere halben Liter Tanks mit Wasser gefüllt Frosch [0,5 g / L Instant Meer und 2 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Füttere sie, wie in Schritt 2.4, aber ändern Sie Wasser nur 2-3 mal pro Woche, wenn das Wasser trüb ist. Pflegen Sie die Tiere in einer 12-Stunden-Licht/12 dunklen Lichtzyklus mit die Lichter einschalten um 6 Uhr. </li><li> Legen Sie die Hälfte-Liter-Tank mit den Testpersonen auf einer weißen Fläche wie ein Labortisch Unterlage, mindestens 12 Stunden O / N, vor der Prüfung. </li><li> Test Kaulquappen in Stufen 45 bis 50, wie in Schritt 3 unten beschrieben. </li></ol> . 2 Pre-Verhalten Setup: Equipment <ol><li> Beiseite stellen einen Bereich der Labor-Test für das Verhalten. Es sollte in einer ruhigen, verkehrsarmen Bereich mit Standard-Leuchtstofflampen sein. </li><li> Vorbereitung der Testbehälter für die Tiere. Die verschachtelte, halb-Liter Testbehälter sind aus zwei Teilen: einem Innenbehälter, die das Wasser und Kaulquappen halten wird; und einen äußeren Tank mit dem visuellen Stimulus. <ol><li> Für den Innentank, machen Sie eine kleine Markierung auf den Außenecken mit einem Sharpie, 5 cm aus dem Boden; dies ist die Wasserleitung (1A, grün gestrichelte Linie). </li><li> Auch für den inneren Tank, füllen die divets im Behälter (in den Ecken und der Mitte) mit einer inerten Verbindung, wie Sylgard Elastomer. HINWEIS: Die Kaulquappen werden in diesen Bereichen aufhalten, wenn sie nicht ausgefüllt </li><li> Für den äußeren Behälter, Deckel genau eine Hälfte der Außenseite eines Tanks mit schwarzem Isolierband und die andere Hälfte mit dem weißen Papier 1B. </li></ol></li><li> Legen Sie die Tanks auf dieImpfen Drehscheibe. </li><li> Setup die Webcam / Stativ, so dass es über den Testtanks. Einstellen der Kamera auf die Visualisierung der Testfläche zu ermöglichen, wie in Fig. 1C gezeigt. </li><li> Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Quicktime Player Software installiert 5. Schalten Sie die Kamera ein. Im Quicktime Player unter Datei, wählen Sie &quot;Neue Video-Aufnahme.&quot; Das Verhalten Test-Setup wird sofort auf dem Computer sichtbar sein. </li><li> Drape ein leichtes Baumwolltuch über die gesamte Setup auf externe Signale, die Kaulquappe Verhalten beeinflussen könnten zu reduzieren, als auch auf der Oberfläche des Wassers zu reduzieren reflektierte Licht. </li><li> Sicherzustellen, dass die Leuchtdichte unter dem Tuch Maßnahmen zwischen 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Verhalten Assay <ol><li> Füllen Sie den Innentank zur Prüfung 5 cm Wassermarke in Schritt 1.2.1 mit Frosch Wasser. </li><li> Mit einem kleinen Netz, sanft bewegen, das Tier in die innere Prüfung Tank. </li><li> Offene QuickTime Software auf dem Computer und mit dem Außentank als Leitfaden, stellen Sie sicher, dass die Kamera in der Lage ist, zu visualisieren und notieren Sie den Testbereich. </li><li> Schreiben Sie die Tiernamen, Datum und Zeit auf ein Stück Papier und notieren mit der Kamera. </li><li> Die Testbehälter in den Außenbehälter mit der schwarzen Seite des Behälters nach rechts 2. </li><li> Starten Sie die Filmaufnahme unmittelbar nach der Anordnung der Tank und setzen Timer für 2 min. </li><li> Nach dem Signal, entfernen Sie die inneren Testtank, drehen Sie den Außentank 180 ° und legen Sie den inneren Testtank im Inneren des Außentanks. Starten Sie den Timer. Hinweis: die schwarze Seite sollte nun auf der anderen Seite sein. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.7, acht weitere Male für insgesamt zehn Studien. Verwenden Sie Abbildung 2 als ein Führer, Abhaken jede Studie. </li><li> Wiederholen Sie den Test Verhalten an zwei verschiedenen Tagen. </li></ol> 4. Retinal Axotomie <ol><li> Tier in den 0,02% Tricaine bis sie nicht mehr reagiert werdenzu einem Schwanz mit einer Prise Nr. 3 Pinzette. </li><li> Schmelze 1% Agarose in 0,1 × MMR und dann zu einer 60 mm Petrischale hinzuzufügen. Nach dem Abkühlen einen kleinen rechteckigen Divot in der Agarose und fügen die Kaulquappe zum Divot mit wenig Tricaine 0,02%, so dass das Tier ist teilweise in die Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Die Schale in einem 45 Grad-Winkel hinter dem dorsalen Bereich des Auges mit einer 25 G Nadel, während die Abstützung des Tieres gegen Zange an der gegenüberliegenden Seite. </li><li> Kümmert sich nicht um die Ader, die neben dem Sehnerv liegt schnippeln, zu erreichen sorgfältig in das Loch mit der Pinzette Nr. 5, schnipp den Sehnerv und drehen Sie sie aus dem Weg. Wenn es schwere Blutungen aufgrund versehentlich Kappen der Arterie, dann schnell zu platzieren, das Tier in 2% Tricaine zu einschläfern. ACHTUNG: 2% Tricaine Lösung kann Taubheitsgefühl in den Menschen verursachen. Diese Lösung sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Um das Tier zu bergen nach der Operation, legen Tier in 100 mm Petrischale mit 0,7 X MMR und 50 ug / ml Gentamicin für 20 min. Next, Transfer Kaulquappe zum Frosch Rückgewinnungstank mit Wasser. Lassen Tier Rest O / N. </li><li> Am nächsten Morgen, testen Sie die visuelle Funktion wie oben beschrieben (Schritte von 3,1 bis 3,9). </li></ol> 5. Analysieren Ergebnisse <ol><li> Nachdem die Studien abgeschlossen haben, messen Sie die Zeit, die der Kaulquappe bleibt auf der schwarzen Seite des Tanks. <ol><li> Manuell die Videos mit einer Software, die die Zeit anzeigt und ermöglicht häufigen Pausen. Schauen Sie sich die Video-Anzeigezeit. Notieren den Beginn der zwei-Minuten-Studie, die ist, wenn der Innentank erfolgreich verschachtelt innerhalb des Außenbehälters und wird im Hinblick auf die Kamera quadriert. </li><li> Verwenden Sie die Position der Augen des Kaulquappe ist zu definieren, welche Seite des Tanks werden die Tiere schwimmen auf. Definieren Sie über Kreuzung von einer Seite des Tanks auf die andere nur dann, wenn beide Augen haben die schwarz / weiße Linie gekreuzt. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich den Anfang und das Ende jedes Intervalls (in sec), dass das Tier auf der schwarzen Seite verbringt. Pause und Wiederwickeln Sie das Video, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Insgesamt sec die in jeder Studie. </li><li> Eingangs diese Zahlen in der beigefügten Verhalten Arbeitsblatt. Das Arbeitsblatt wird das Verhältnis der Zeit, dass das Tier auf der weißen Seite verbracht, indem die Zeit auf der schwarzen Seite des Tanks von der Gesamt 120 sec Versuch und Division durch die Gesamtzeit in Sekunden ausgegeben berechnen [(120 - Gesamtaufwand für Sekunden die schwarze Seite) / 120 sec]. Die Arbeitsblattdurchschnittswerte dieses Verhältnis über alle 10 Studien. </li><li> Verwenden Sie ein Student-T-Test, gepaart, two-tailed Verteilung zu bestimmen, ob die Prozesse zwischen den Tagen sind signifikant (P ≤ 0,05). </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
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<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
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<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir berichten hier über eine einfache Vision geführte Verhaltenstest, die leicht in weniger als einer Woche durch minimal geschulte Laborpersonal durchgeführt werden können. Während andere Tests erfordern spezielle Ausrüstung und Know-how in das Verhalten der Tiere, ermöglicht dieser Test ein Schnelltest der visuellen Funktion zu bestimmen. Ein anderer Verhaltenstest, der Visual Avoidance Assay wurde entwickelt, um zu bestimmen, wie Tectum trägt zur visuellen Wahrnehmung in Xenopus 10. Dieser Assay m...

Xenopus laevis wurden als Modellorganismus zur Augenbildung studieren verwendet. Die Augen entwickeln schnell wachsenden Zeit in weniger als einer Woche zum Testen Gene oder Wege, die einen Einfluss auf die visuelle Entwicklung und Funktion haben. Um visuelle Funktion zu testen, hat die optokinetischen und optomotorischen Reaktion im Zebrafisch und Xenopus Kaulquappen verwendet wurde, bzw. 1,2. Da die Augen von Xenopus Kaulquappen sind relativ kleiner als Zebrafisch, dieser Test erfordert den Einsatz von Spezialgeräten und geschultes Personal, um die subtilen tail-Flip und Blickbewegungsverhalten in Xenopus zu erkennen. Ein robusteres Verhalten in Xenopus ist die Vorliebe für das Schwimmen in einem Tank mit einem weißen Hintergrund, die hier 3 beschrieben wird. Beim Platzieren einer Kaulquappe in einem halb schwarz / halb-weißen Tank, die Pre-metamorphen Kaulquappe schnell schwimmt auf der weißen Seite des Tanks. Bislang hatten wir diesen Test, um festzustellen, ob pluripotenten Zellen abgeleitetenAugen waren funktionellen 4. Hier berichten wir über eine detaillierte Version dieses Assays, die verwendet werden können, um die visuelle Funktion premetamorphic Xenopus-Kaulquappen testen. Dieser Test ist einfacher als der optomotorischen Reaktion Assay, da bedarf es nur einen montierten digitalen Camcorder, Digitalkamera-Software und Standard-Ausrüstung in den meisten Labors Xenopus gefunden. Darüber hinaus ist die aufgezeichnete Reaktion erfordert keine spezielle Ausbildung, um tally Ergebnisse. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die gleiche Gruppe von Kaulquappen, mit Doppelnetzhaut Axotomie unterzogen, schwimmen zufällig um den Tank. Wir haben auch die Verhaltens Assay-Ergebnisse aus einer repräsentativen Kaulquappe, die zeigt, wie ein Auge für die visuelle Reaktion getestet werden. Ein Arbeitsblatt aufgenommen wurde, so daß während des Tests erworben Zahlen eingesetzt und ausgewertet werden. Dieses Arbeitsblatt kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die getesteten Kaulquappen eine visuelle Antwort sein.

<table><tbody><tr><td>1/2 Gallone Flex-Tank mit Abdeckung</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Größe: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"</td></tr> <tr><td>Schwarzes Isolierband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weißes Seidenpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Großer Impfplattenteller</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Größe: Durchmesser 114,3 x & nbsp; H 76,2 mm (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3")</td></tr><tr><td>Durasorb Unterlage</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Größe: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Standardstativ</td><td></td><td>Verschiedenes iSight</td><td></td></tr><tr><td>Kamera oder Webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Gut für größere Kaulquappen, aber kleine sind schwer zu sehen</td></tr><tr><td>Tragbarer Computer</td><td>Apple/PC</td><td>Verschiedenes</td><td>Wir haben ein 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo mit MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV Handycam Camcorder</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td> <td>verwendetVerbunden über Firewire mit dem Computer mit einem 6-adrigen und 4-adrigen alpha FireWire 400&nbsp;</td></tr><tr><td>Handycam-Station</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>Dies kann zum Verbinden von Firewire mit der Kamera verwendet werden</td></tr><tr><td>QuickTime Player Software</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadel (5/8" Länge)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegartikel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Stammlösung = 100 g/L gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Stammlösung = 0,4 M gelagert bei RT</td></tr><tr><td>In vitro befruchtete Embryonen</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 Embryonen/Einheit</td></tr></tbody></table>

eine einfache verhaltenstest zur prüfung von visual function in<em&gt; xenopus laevis</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Die Messung der visuellen Funktion in den Kaulquappen der Frösche, Xenopus laevis, ermöglicht Screening für Blindheit in lebenden Tieren. Der optokinetische Reaktion ist eine Vision-basierte, reflexive Verhalten, das in allen getesteten Wirbeltieren beobachtet worden ist. Tadpole Augen sind klein, so wurde der Schwanz Flip Antwort als alternative Maßnahme, die einen geschulten Techniker, um die subtile Antwort aufzeichnen erfordert verwendet. Wir haben eine alternative Verhalten Assay basiert auf der Tatsache, dass Kaulquappen lieber auf der weißen Seite eines Tanks schwimmen, wenn sie in einem Behälter mit sowohl Schwarz-Weiß-Seiten angeordnet. Die hier vorgestellte Test ist eine kostengünstige, einfache Alternative, die eine Antwort, die leicht gemessen wird erstellt. Der Aufbau besteht aus einem Stativ, Webcam und verschachtelte Prüfung Tanks, in den meisten Labors Xenopus leicht verfügbar. Dieser Artikel enthält einen Film, die das Verhalten von Kaulquappen, vor und nach dem Durchtrennen des Sehnervs. Um die Funktion von einem Auge zu testen, sind wir auch Vertretreter Ergebnisse einer Kaulquappe, in dem jedes Auge unterzog Netzhaut Axotomie an aufeinander folgenden Tagen. Zukünftige Studien könnten eine automatisierte Version dieses Tests für die Prüfung der Vision von vielen Kaulquappen auf einmal zu entwickeln.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass Xenopus Kaulquappen premetamorphic lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank schwimmen und nannte diesen Test, der Hintergrundfarbe Vorlieben Assay 3 Wir haben diesen Test, um die visuelle Funktion eines Augen von Kaulquappen in testen geändert weniger als eine Woche. Auf diese Weise kann die Augen für die histologische Untersuchung gesammelt werden. Wir zeigen hier, wie die Reaktion durch visuelle Hinweise ist. In <stron...

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Sehfunktion von Kaulquappen zu testen, indem die Zeitspanne aufgezeichnet wird, die das Tier in der Hälfte des Versuchsbassins verbringt, die mit Schwarz abgedeckt ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Kaulquappen bis zu den Stadien 45 bis 50 aufgezogen werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein halb schwarzes, halb weißes Becken zusammen mit einer Kamera für den Verhaltensversuch einzurichten.Als Nächstes ein zweites Becken mit einem Kaulquappen in das äußere Becken stellen. Für jede Kaulquappe das visuell gesteuerte Verhalten aufzeichnen, während sich die Hintergrundumgebung verändert. Der letzte Schritt besteht darin, eine retinale Exsodomy an den Kaulquappen durchzuführen und anschließend den Verhaltensassay zu wiederholen.Schließlich werden die Daten aus diesem einfachen, kostengünstigen Test verwendet, um zu zeigen, dass die Kaulquappen unter Prüfungen des Phototopsehens eine Präferenz dafür aufweisen, sich auf einer Seite des Beckens gegenüber der anderen aufzuhalten. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode gegenüber anderen Techniken wie der optokinétischen Reaktion oder dem Schwanzreflex-Test besteht darin, dass es sich um eine kostengünstige, einfache Methode handelt, die Geräte verwendet, die in den meisten Opus-Laboren leicht verfügbar sind. Um die Kaulquappen vorzubereiten, beschaffen Sie zunächst befruchtete Xenopus-Embryonen, geben Sie Mark's modifizierte Ringer-Lösung oder MMR, die um einen Faktor von 10 in 60 Millimeter Petrischalen mit 50 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurde.Gentamycin-Antibiotikum zugeben zu Blastula- bis Neuralplatten-Stadium-Embryonen. Stadien zwei bis 15 bei 18 Grad Celsius in den Petrischalen inkubieren. Sobald die Embryonen das Cup-in-favor-Stadium von etwa 27 bis 30 erreichen, auf 0,1 XMMR ohne Antibiotika umstellen, um das Wachstum der Darmbakterien zu ermöglichen.Wenn die Kaulquappen das Fütterungsstadium um Stufe 45 erreichen, überführen Sie sie in 100 Millimeter große Petrischalen mit 0,1 XMMR. Füttern Sie sie am nächsten Tag mit Brennnesselpulver-Überstand. Nach einer Woche in der 100 Millimeter Petrischale füllen Sie einen halben Gallonen-Behälter mit Froschwasser.Bringen Sie die Tiere in den Behälter und setzen Sie den Fütterungsplan mit Brennnesselpulver-Überstand fort, jedoch wechseln Sie das Wasser nur zwei bis drei Mal pro Woche. Wenn sich die Tiere in 2-Liter-Behältern befinden, halten Sie sie in einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus, wobei das Licht um 6:00 Uhr morgens eingeschaltet wird. Vor der Durchführung des Tests stellen Sie den 2-Liter-Behälter mit den Versuchstieren mindestens 12 Stunden vorher über Nacht auf eine weiße Unterlage. Der Verhaltensversuch sollte in einem ruhigen Bereich mit geringem Verkehr und bei normalem Leuchtstofflicht durchgeführt werden.Bereiten Sie zwei halbe Gallonen große Testbehälter als Nistbehälter an den äußeren Ecken dessen vor, was der innere Behälter sein wird. Markieren Sie mit einem Edding die Wasserlinie fünf Zentimeter über dem Boden. Identifizieren Sie außerdem für den inneren Behälter Vertiefungen in dessen Innerem. Füllen Sie diese mit einer inerten Verbindung, um zu verhindern, dass Kaulquappen darin verweilen. Richten Sie nun die Aufmerksamkeit auf den zweiten äußeren Behälter. Beschaffen Sie sich für den nächsten Schritt schwarzes Isolierband und weißes Papiertuch.Verwenden Sie das Klebeband, um die Außenseite einer Hälfte des Tanks und das Filterpapier, um die Außenseite der anderen Hälfte zu bedecken, wie hier gezeigt. Sobald die Tanks vorbereitet sind, richten Sie eine Inokulationsdrehscheibe ein und stellen Sie die ineinandergefügten Tanks darauf ab. Positionieren Sie ein Stativ und eine Webcam so, dass die Kamera das Innere der Tanks von oben aufnehmen kann.Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Software zur Videoaufnahme und -wiedergabe an. Schalten Sie die Kamera ein und bereiten Sie eine neue Videoaufnahme vor. Anschließend legen Sie ein leichtes Baumwolltuch über die Kamera und die Behälter.Um externe Reize für die Kaulquappen zu reduzieren, verwenden Sie ein Leuchtdichtemessgerät und prüfen Sie, ob die Leuchtdichte unter dem Tuch zwischen 35 und 50 Candela pro Quadratmeter liegt. Beginnen Sie den Verhaltensversuch, indem Sie den inneren Testbehälter entnehmen. Füllen Sie ihn mit Froschwasser bis zur 5-cm-Marke. Verwenden Sie ein Netz, um ein Tier aus seinem Halbgallonen-Behälter in den inneren Versuchstank am Computer zu überführen. Stellen Sie sicher, dass die Aufnahmesoftware geöffnet ist und den Versuchsbereich zur Dokumentation aufzeichnet. Notieren Sie den Namen des Tieres, das Datum und die Uhrzeit auf einem Zettel.Platzieren Sie dies unter die Kamera zur Aufnahme. Stellen Sie danach einen Timer auf zwei Minuten. Richten Sie anschließend den äußeren Behälter auf dem Drehteller so aus, dass die schwarze Seite rechts ist.Stellen Sie nun den Prüftank in den äußeren Tank. Schließen Sie im Aufnahmebereich den Vorhang und verwenden Sie den Computerschirm, um die Ausrichtung des äußeren Tanks zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Videoaufnahme läuft, und starten Sie die Stoppuhr.Wenn der Timer piept, halten Sie die Abdeckung in Position und entfernen Sie den inneren Probekolben. Drehen Sie anschließend den äußeren Kolben um 180 Grad, sodass die schwarze Seite nun links ist. Setzen Sie den Probekolben wieder in den äußeren Kolben ein und starten Sie den zweiminütigen Timer.Entfernen Sie erneut den inneren Tank. Drehen Sie den äußeren Tank um 180 Grad und setzen Sie den inneren Tank insgesamt zehnmal alle zwei Minuten wieder ein. Sobald dies abgeschlossen ist, beenden Sie die Videoaufnahme.Bringen Sie den Tintenfisch wieder in seinen halben Gallonenbehälter zurück. Bereiten Sie ein Mikroskop für die Durchführung der Retinol-Ex-Sodomie vor. Füllen Sie eine 60 Millimeter große Petrischale mit 1 % Aros, das in 0,1 XMMR geschmolzen wurde, und lassen Sie es erstarren.Entfernen Sie ein kleines rechteckiges Stück der Aros in der Größe des Kaulquappen. Wenn Sie fortfahren möchten, holen Sie das Testtier und legen Sie es in 0,02 % Trica. Fahren Sie fort, wenn es nicht auf einen Schwanzkneif mit Pinzette Nummer drei reagiert.Überführen Sie das Tier anschließend in die Schale. Befestigen Sie die Petrischale am Mikroskop. Bereiten Sie sich darauf vor, das Tier mit einer Pinzette von einer Seite her zu fixieren.Verwenden Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine 25-Gauge-Nadel, um die Haut hinter dem dorsalen Bereich des Auges in einem Winkel von 45 Grad zu durchbohren, führen Sie vorsichtig die Nr. 5-Pinzette in die Öffnung ein und durchtrennen Sie den Sehnerv, wobei Sie die danebenliegende Vene vermeiden. Kippen Sie den Nerv beiseite und ziehen Sie die Pinzette nach der Operation zurück. Stellen Sie das Tier wieder her, indem Sie es in eine 100 Millimeter große Petrischale mit 0,7 XMMR und 50 Mikrogramm pro Milliliter geben.20 Minuten lang Gentamycin. Danach den Kaulquappen in ein Wiederherstellungsbecken mit Froschwasser überführen. Das Becken zur Vorbereitung auf die Tests auf eine weiße Unterlage stellen.Lassen Sie das Tier über Nacht ruhen. Testen Sie am nächsten Morgen die Sehfunktion mithilfe des Verhaltensassays. Dieser Film zeigt repräsentative Daten für das Experiment.Links sind die Tiere vor der Operation, rechts dieselben Tiere nachdem die Netzhaut-Axone beider Augen durchtrennt wurden. Dies wird durch die schematische Darstellung in den unteren Ecken angezeigt. Das Wasser wurde bewegt, um zu zeigen, dass nichts hinzugefügt wurde, um die Tiere von der schwarzen Seite abzustoßen oder zur weißen Seite hinzuzulocken.Die Kaulquappen vor der Operation reagieren innerhalb von weniger als 30 Sekunden auf die Hintergrundfarbe, während die blinden Kaulquappen ziellos im Becken schwimmen. Dieses Diagramm zeigt den prozentualen Anteil der Zeit, die ein einzelnes Tier unter drei Bedingungen in den weißen und schwarzen Bereichen verbringt. Zunächst wurde das Tier vor jedem Eingriff mithilfe des Assays beobachtet.An zwei aufeinanderfolgenden Tagen nachdem der rechte Sehnerv durchtrennt worden war, wurde das Verhalten über zwei Tage mit dem Testverfahren beobachtet. Schließlich erfolgten nach der Durchtrennung beider Sehnerven noch zwei weitere Beobachtungstage mit dem Assay. Das Tier verbrachte mehr Tage auf der weißen Seite des Beckens, wenn mindestens ein Sehnerv intakt war.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Sehfähigkeit von Kaulquappen mithilfe einfacher Reagenzien und Geräte testet, wie sie in den meisten Froschlaboratorien zu finden sind. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Testen visuelle Empfindlichkeit in Echsen mit einem operante Konditionierung, die Video-Wiedergabe von random-dot kinematograms und computer-generierte Wirbellosen beschäftigt.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

Die VisioTracker ist ein automatisiertes System für die quantitative Analyse der visuellen Leistung von Larven und kleine erwachsene Fische auf der Aufzeichnung von Augenbewegungen basieren. Es verfügt über die vollständige Kontrolle über visuelle Reiz Eigenschaften und Echtzeit-Analyse und ermöglicht High-Throughput-Forschung in Bereichen wie visuelle System Entwicklung und Funktion, Pharmakologie, neuronalen Schaltkreis Studien und sensomotorische Integration.

VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis

Dieses Video beschreibt den optokinetischen Reaktionstest im Zebrafisch. Das Video misst die reflexiven Augenbewegungen anhand des visuellen Bewegungsreizes und bestimmt die Sehschärfe beim Zebrafisch.

Optokinetic Response Assay: Eine Methode zur Messung der Sehschärfe bei Zebrafischen

Das Video beschreibt die Vermeidung und den Thigmotaxis-Assay von Zebrafischlarven. Das Video untersucht das Verhalten von Zebrafischlarven als Reaktion auf visuelle aversive Reize.

Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

Zebrafische haben ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsbereiche. Hier zeigen wir eine Methode, um eine visuelle Reaktion hervorzurufen und berechnen eine funktionale Sehschärfe im erwachsenen Zebrafisch.

Die optokinetischen Antwort als quantitatives Maß der Sehschärfe im Zebrafisch

Wir präsentieren eine Methode zur elektroretinographischen (ERG) Analyse von Zebrafischlarven unter Verwendung von Mikromanipulations- und Elektroretinographie-Techniken. Dies ist eine einfache und unkomplizierte Methode, um die Sehfunktion von Zebrafischlarven in vivo zu bestimmen.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Um die Sicht der Maus zu untersuchen, haben wir einen sich abzeichnenden Test durchgeführt. Mäuse wurden in einer großen quadratischen Arena mit einem Monitor an der Decke aufgestellt. Der sich abzeichnende visuelle Reiz rief konsequent Gefrier-oder Flugreaktionen bei den Mäusen hervor.

Die Verwendung von drohenden visuellen Stimuli zur Bewertung der Maus Vision

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Neuronale Degeneration in Augen und Gehirn als Folge von Diabetes kann durch Verhaltenstests an Nagetieren beobachtet werden. Das Y-Labyrinth, ein Maß für die räumliche Kognition, und die optomotorische Reaktion, ein Maß für die visuelle Funktion, geben beide Einblick in mögliche Diagnosen und Behandlungen.

Verhaltensbewertung der visuellen Funktion über optomotorische Reaktion und kognitive Funktion über Y-Maze bei diabetischen Ratten

Erfahren Sie, wie Sie die visuelle Funktion von Xenopus laevis-Kaulquappen mit einem einfachen Verhaltenstest untersuchen. Diese Methode erfasst die Zeit, die Tiere auf der weißen Seite eines schwarz-weißen Tanks verbringen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in

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