Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Sehfunktion von Kaulquappen zu testen, indem die Zeitspanne aufgezeichnet wird, die das Tier in der Hälfte des Versuchsbassins verbringt, die mit Schwarz abgedeckt ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Kaulquappen bis zu den Stadien 45 bis 50 aufgezogen werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein halb schwarzes, halb weißes Becken zusammen mit einer Kamera für den Verhaltensversuch einzurichten.

Als Nächstes ein zweites Becken mit einem Kaulquappen in das äußere Becken stellen. Für jede Kaulquappe das visuell gesteuerte Verhalten aufzeichnen, während sich die Hintergrundumgebung verändert. Der letzte Schritt besteht darin, eine retinale Exsodomy an den Kaulquappen durchzuführen und anschließend den Verhaltensassay zu wiederholen.

Schließlich werden die Daten aus diesem einfachen, kostengünstigen Test verwendet, um zu zeigen, dass die Kaulquappen unter Prüfungen des Phototopsehens eine Präferenz dafür aufweisen, sich auf einer Seite des Beckens gegenüber der anderen aufzuhalten. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode gegenüber anderen Techniken wie der optokinétischen Reaktion oder dem Schwanzreflex-Test besteht darin, dass es sich um eine kostengünstige, einfache Methode handelt, die Geräte verwendet, die in den meisten Opus-Laboren leicht verfügbar sind. Um die Kaulquappen vorzubereiten, beschaffen Sie zunächst befruchtete Xenopus-Embryonen, geben Sie Mark's modifizierte Ringer-Lösung oder MMR, die um einen Faktor von 10 in 60 Millimeter Petrischalen mit 50 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurde.

Gentamycin-Antibiotikum zugeben zu Blastula- bis Neuralplatten-Stadium-Embryonen. Stadien zwei bis 15 bei 18 Grad Celsius in den Petrischalen inkubieren. Sobald die Embryonen das Cup-in-favor-Stadium von etwa 27 bis 30 erreichen, auf 0,1 XMMR ohne Antibiotika umstellen, um das Wachstum der Darmbakterien zu ermöglichen.

Wenn die Kaulquappen das Fütterungsstadium um Stufe 45 erreichen, überführen Sie sie in 100 Millimeter große Petrischalen mit 0,1 XMMR. Füttern Sie sie am nächsten Tag mit Brennnesselpulver-Überstand. Nach einer Woche in der 100 Millimeter Petrischale füllen Sie einen halben Gallonen-Behälter mit Froschwasser.

Bringen Sie die Tiere in den Behälter und setzen Sie den Fütterungsplan mit Brennnesselpulver-Überstand fort, jedoch wechseln Sie das Wasser nur zwei bis drei Mal pro Woche. Wenn sich die Tiere in 2-Liter-Behältern befinden, halten Sie sie in einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus, wobei das Licht um 6:00 Uhr morgens eingeschaltet wird. Vor der Durchführung des Tests stellen Sie den 2-Liter-Behälter mit den Versuchstieren mindestens 12 Stunden vorher über Nacht auf eine weiße Unterlage. Der Verhaltensversuch sollte in einem ruhigen Bereich mit geringem Verkehr und bei normalem Leuchtstofflicht durchgeführt werden.

Bereiten Sie zwei halbe Gallonen große Testbehälter als Nistbehälter an den äußeren Ecken dessen vor, was der innere Behälter sein wird. Markieren Sie mit einem Edding die Wasserlinie fünf Zentimeter über dem Boden. Identifizieren Sie außerdem für den inneren Behälter Vertiefungen in dessen Innerem.

Füllen Sie diese mit einer inerten Verbindung, um zu verhindern, dass Kaulquappen darin verweilen. Richten Sie nun die Aufmerksamkeit auf den zweiten äußeren Behälter. Beschaffen Sie sich für den nächsten Schritt schwarzes Isolierband und weißes Papiertuch.

Verwenden Sie das Klebeband, um die Außenseite einer Hälfte des Tanks und das Filterpapier, um die Außenseite der anderen Hälfte zu bedecken, wie hier gezeigt. Sobald die Tanks vorbereitet sind, richten Sie eine Inokulationsdrehscheibe ein und stellen Sie die ineinandergefügten Tanks darauf ab. Positionieren Sie ein Stativ und eine Webcam so, dass die Kamera das Innere der Tanks von oben aufnehmen kann.

Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Software zur Videoaufnahme und -wiedergabe an. Schalten Sie die Kamera ein und bereiten Sie eine neue Videoaufnahme vor. Anschließend legen Sie ein leichtes Baumwolltuch über die Kamera und die Behälter.

Um externe Reize für die Kaulquappen zu reduzieren, verwenden Sie ein Leuchtdichtemessgerät und prüfen Sie, ob die Leuchtdichte unter dem Tuch zwischen 35 und 50 Candela pro Quadratmeter liegt. Beginnen Sie den Verhaltensversuch, indem Sie den inneren Testbehälter entnehmen. Füllen Sie ihn mit Froschwasser bis zur 5-cm-Marke.

Verwenden Sie ein Netz, um ein Tier aus seinem Halbgallonen-Behälter in den inneren Versuchstank am Computer zu überführen. Stellen Sie sicher, dass die Aufnahmesoftware geöffnet ist und den Versuchsbereich zur Dokumentation aufzeichnet. Notieren Sie den Namen des Tieres, das Datum und die Uhrzeit auf einem Zettel.

Platzieren Sie dies unter die Kamera zur Aufnahme. Stellen Sie danach einen Timer auf zwei Minuten. Richten Sie anschließend den äußeren Behälter auf dem Drehteller so aus, dass die schwarze Seite rechts ist.

Stellen Sie nun den Prüftank in den äußeren Tank. Schließen Sie im Aufnahmebereich den Vorhang und verwenden Sie den Computerschirm, um die Ausrichtung des äußeren Tanks zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Videoaufnahme läuft, und starten Sie die Stoppuhr.

Wenn der Timer piept, halten Sie die Abdeckung in Position und entfernen Sie den inneren Probekolben. Drehen Sie anschließend den äußeren Kolben um 180 Grad, sodass die schwarze Seite nun links ist. Setzen Sie den Probekolben wieder in den äußeren Kolben ein und starten Sie den zweiminütigen Timer.

Entfernen Sie erneut den inneren Tank. Drehen Sie den äußeren Tank um 180 Grad und setzen Sie den inneren Tank insgesamt zehnmal alle zwei Minuten wieder ein. Sobald dies abgeschlossen ist, beenden Sie die Videoaufnahme.

Bringen Sie den Tintenfisch wieder in seinen halben Gallonenbehälter zurück. Bereiten Sie ein Mikroskop für die Durchführung der Retinol-Ex-Sodomie vor. Füllen Sie eine 60 Millimeter große Petrischale mit 1 % Aros, das in 0,1 XMMR geschmolzen wurde, und lassen Sie es erstarren.

Entfernen Sie ein kleines rechteckiges Stück der Aros in der Größe des Kaulquappen. Wenn Sie fortfahren möchten, holen Sie das Testtier und legen Sie es in 0,02 % Trica. Fahren Sie fort, wenn es nicht auf einen Schwanzkneif mit Pinzette Nummer drei reagiert.

Überführen Sie das Tier anschließend in die Schale. Befestigen Sie die Petrischale am Mikroskop. Bereiten Sie sich darauf vor, das Tier mit einer Pinzette von einer Seite her zu fixieren.

Verwenden Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine 25-Gauge-Nadel, um die Haut hinter dem dorsalen Bereich des Auges in einem Winkel von 45 Grad zu durchbohren, führen Sie vorsichtig die Nr. 5-Pinzette in die Öffnung ein und durchtrennen Sie den Sehnerv, wobei Sie die danebenliegende Vene vermeiden. Kippen Sie den Nerv beiseite und ziehen Sie die Pinzette nach der Operation zurück. Stellen Sie das Tier wieder her, indem Sie es in eine 100 Millimeter große Petrischale mit 0,7 XMMR und 50 Mikrogramm pro Milliliter geben.

20 Minuten lang Gentamycin. Danach den Kaulquappen in ein Wiederherstellungsbecken mit Froschwasser überführen. Das Becken zur Vorbereitung auf die Tests auf eine weiße Unterlage stellen.

Lassen Sie das Tier über Nacht ruhen. Testen Sie am nächsten Morgen die Sehfunktion mithilfe des Verhaltensassays. Dieser Film zeigt repräsentative Daten für das Experiment.

Links sind die Tiere vor der Operation, rechts dieselben Tiere nachdem die Netzhaut-Axone beider Augen durchtrennt wurden. Dies wird durch die schematische Darstellung in den unteren Ecken angezeigt. Das Wasser wurde bewegt, um zu zeigen, dass nichts hinzugefügt wurde, um die Tiere von der schwarzen Seite abzustoßen oder zur weißen Seite hinzuzulocken.

Die Kaulquappen vor der Operation reagieren innerhalb von weniger als 30 Sekunden auf die Hintergrundfarbe, während die blinden Kaulquappen ziellos im Becken schwimmen. Dieses Diagramm zeigt den prozentualen Anteil der Zeit, die ein einzelnes Tier unter drei Bedingungen in den weißen und schwarzen Bereichen verbringt. Zunächst wurde das Tier vor jedem Eingriff mithilfe des Assays beobachtet.

An zwei aufeinanderfolgenden Tagen nachdem der rechte Sehnerv durchtrennt worden war, wurde das Verhalten über zwei Tage mit dem Testverfahren beobachtet. Schließlich erfolgten nach der Durchtrennung beider Sehnerven noch zwei weitere Beobachtungstage mit dem Assay. Das Tier verbrachte mehr Tage auf der weißen Seite des Beckens, wenn mindestens ein Sehnerv intakt war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Sehfähigkeit von Kaulquappen mithilfe einfacher Reagenzien und Geräte testet, wie sie in den meisten Froschlaboratorien zu finden sind. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.