Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die seltenen Reprogrammierungs-Zwischenprodukte aus Kulturen von embryonalen Fibroblasten der Maus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Fibroblasten der Maus aus E 13,5-Embryonen eines reprogrammierbaren Mausstamms gewonnen werden. Im zweiten Schritt werden die embryonalen Fibroblasten der Maus mit niedriger Passage in induzierte pluripotente Stamm- oder IPS-Zellmedien ausgesät, die mit Doxycyclin ergänzt werden, um den Reprogrammierungsprozess zu initiieren.

Anschließend werden die Zellen zu ausgewählten Zeitpunkten während der Reprogrammierung geerntet und mit Antikörpern gegen bestimmte Zelloberflächenmarker markiert. Letztendlich können die seltenen Reprogrammierungs-Zwischenprodukte durch Fakten für weitere experimentelle Analysen isoliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden besteht darin, dass mechanistische Studien an den seltenen Reprogrammierungszwischenprodukten in Abwesenheit von Zellen durchgeführt werden können, die auf den Reprogrammierungsprozess refraktär sind und den Großteil der Population ausmachen. Um embryonale Maus-, Fibroblasten oder Mes zu erzeugen, beginnen Sie mit der Übertragung eines embryonalen Uterushorns am Tag 13,5 in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale, die 10 Milliliter steriles PBS enthält.

Schneiden Sie dann mit einer sterilisierten chirurgischen Schere das Horn in einzelne Stücke, die jeweils einen Embryo enthalten. Als nächstes entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop in einer Gewebekulturhaube mit einer sterilisierten Pinzette vorsichtig die Gebärmutterhülle und die zusätzliche embryonale Membran, die jeden Embryo umgibt, und übertragen Sie jeden entblößten Embryo in einzelne 10-Zentimeter-Schalen mit 10 Millilitern frischem PBS. Fahren Sie dann fort, indem Sie den Kopf, die Gliedmaßen, den Schwanz und die inneren Organe jedes Embryos mit einer Zange entfernen.

Frieren Sie die Köpfe bei Bedarf für die Genotypisierung in einzelnen 1,5-Milliliter-Röhrchen ein. Übertragen Sie jeden Torso in neue einzelne 10 Zentimeter große Platten und verwenden Sie zwei chirurgische Klingen, um jeden Embryo zwei Minuten lang zu zerkleinern. Verdauen Sie die Gewebestücke in 200 Mikrolitern Trypsin-EDTA für drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von weiteren zwei Minuten Zerkleinerung.

Dann inaktivieren Sie das Tryin mit zwei Millilitern Meth-Medien und überführen Sie den Zellschlamm mit einer 1000-Mikroliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Dissoziieren Sie das Gewebe durch vorsichtiges Pipettieren weiter mechanisch und geben Sie die Zelllösung dann in eine mit Gelatine beschichtete 10-Zentimeter-Schale. Gib weitere 10 Milliliter Meth-Medien in die Kultur.

Nach 24 bis 48 Stunden sollte die Platte dicht mit MEFs bedeckt werden, um die MEFs neu zu programmieren, zuerst eine gefrorene Meth-Kultur mit niedrigem Durchgang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufzutauen und dann den Inhalt in ein Röhrchen mit 10 Millilitern vorwarmem Meth-Medium zu überführen. Nach dem Schleudern der Zellen wird das Pellet in 12 Millilitern frischem Meth-Medium resuspendiert und die Zellsuspension in ein mit Gelatine beschichtetes T 75-Kulturgefäß überführt. Nach einer Erholungsphase von 24 bis 48 Stunden waschen Sie die MEFs mit PBS und lösen Sie die Zellen dann drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit drei Millilitern Trypsin-EDTA ab.

Stoppen Sie dann den enzymatischen Verdau mit fünf Millilitern Meth-Medien und dissoziieren Sie die Zellen durch sanftes Mischen mit einer 10-Milliliter-Pipette weiter. Als nächstes programmieren Sie die Mets neu, indem Sie die Zellen in den ersten sechs Tagen auf neue Gelatine säen, beschichtete T-75-Kolben mit 6,7 mal 10 bis zu den dritten Zellen pro Quadratzentimeter in 12 Millilitern IPSC-Medien, die zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin enthalten. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch frisches, mit Doxycyclin angereichertes IPSE-Medium, indem Sie die Reprogrammierungszwischenprodukte zu den erforderlichen Zeitpunkten durch Trypsin-EDTA-Ablösung ernten, wie gerade für jede geerntete Zwischensuspension demonstriert.

Waschen Sie die Zellen in PBS. Dann Reanimation. Suspendieren Sie die Pellets in Faxmedien für die Antikörpermarkierung, um vollständig reprogrammierte IPSC-Kulturen zu etablieren.

Züchten Sie die Zellen für weitere vier bis sieben Tage in doxycyclinfreien IPSC-Medien, um die reprogrammierten Zellen zu markieren. Markieren Sie die geernteten Zwischenprodukte mit den entsprechenden Antikörpern von Interesse. Klopfen Sie nach 10 Minuten vorsichtig auf die Röhrchen, um die Zellen wieder zu resuspendieren, und legen Sie die Röhrchen dann für weitere 10 Minuten auf Eis.

Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern kaltem PBS pro Röhrchen. Aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in einem geeigneten Volumen des Markierungsmediums, das mit Strippin P der Größe sieben auf Eis ergänzt wird. Nach 20 Minuten waschen Sie die Zellen in weiteren 10 kalten PBS und resuspendieren Sie die Zellpellets in Markierungsmedien, die mit Propidiumiodid ergänzt sind.

Filtern Sie alle Zellklumpen heraus, indem Sie die Suspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb passieren und die Zellen dann auf Eis in die entsprechenden Faxröhren übertragen. Für die Kompensationssteuerung. Bei der Reanimation wird ein Kryo-Fläschchen mit IPS-Zellen suspendiert, die auf bestrahltem Mes in 800 Mikrolitern Markierungspuffer aufbewahrt werden.

Beiseite von 200 Mikrolitern Zellen für die unmarkierte Kontrollkontrolle. Teilen Sie dann die verbleibende Zellsuspension auf drei 15-Milliliter-Röhrchen für die einfarbige Kontrolle auf und markieren Sie die Proben wie gerade gezeigt, um die Zwischenprodukte durch Durchflusszytometrie zu analysieren. Beginnen Sie mit dem Festlegen eines Tors im Streudiagramm "Vorwärts an Seite", um Schmutz auszuschließen.

Verwenden Sie dann die Höhe der Vorwärtsstreuung im Vergleich zum Vorwärtsstreuungsbereich, um die Aggregate und den PI-Kanal im Vergleich zur Vorwärtsstreuung auszuschließen. Zum Gate auf die PI-negativen lebenden Zellen. Verwenden Sie die unbeschrifteten Zellen, um die Spannungen für die sieben Kanäle Pacific Blue FITC und PSI einzustellen.

Idealerweise wird die Zellpopulation am unteren Ende des jeweiligen Kanals positioniert. Setzen Sie als Nächstes die Gates mit den unmarkierten Kontrollzellen, um die Reprogrammierungskulturen in Tag drei, sechs und neun zu unterteilen. Populationen von SSEA, einer negativen TH 1.2 positiven Zellen, SSEA, einer negativen TH 1.2 negativen Zellen und den Reprogrammierungsintermedien SSEA, einer positiven TH 1.2 negativen Zellen.

Unterteilen Sie dann den neunten SSEA-Anteil, einen positiven, TH 1,2-negativen Anteil, weiter mit dem SSEA-Diagramm von eins gegen EPAM. Ziehen Sie mit dem unbeschrifteten Steuerelement Gates um die EPAM-positiven Zellen und die EPAM-negativen Zellen, wie hier gezeigt. Sammeln Sie abschließend die Zellen in ein bis zwei Millilitern IPS-Zellmedien.

Bei der Doxycyclin-Induktion erfahren die Reprogrammierungsmythen um den sechsten Tag herum deutliche morphologische Veränderungen. Frühe kolonieähnliche Flecken beginnen zu entstehen, die bei weiterer Kultivierung weiter an Größe zunehmen. Ein gutes Reprogrammierungsexperiment führt zu mehr als 500 Kolonien pro T 75, die zunächst mit fünfmal 10 bis fünften Zellen besiedelt werden, und etablierte IPS-Kulturen besitzen charakteristische kuppelförmige Kolonien und sind meist frei von differenzierten Zellen.

Morphologische und molekulare Veränderungen während der Reprogrammierung spiegeln sich in Veränderungen in der Zelloberflächenexpression von thigh 1.2, SSEA one und schließlich epca wider. Während MES überwiegend positiv für den Oberschenkel 1.2 und negativ für die anderen Marker sind, hat ein großer Teil der Zellen am dritten Tag begonnen, die Expression von Oberschenkel 1.2 herunterzuregulieren, und eine sehr kleine Untergruppe ist SSEA eins-positiv geworden. Die eigentliche Reprogrammierungs-Zwischenzeit für diesen Zeitpunkt an den Tagen sechs und neun, ein erhöhter Prozentsatz von SSEA-One-positiven Zellen, normalerweise weit über 10%, kann um den 12. Tag herum nachgewiesen werden.

Es kann eine Untergruppe von SSEA one positiven Zellen nachgewiesen werden, die ebenfalls positiv sind. Für epca. Etablierte bonafide IPS-Zellkulturen werden sehr positiv sein.

Für SSEA one und EPCA Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, nur Karten mit geringer Passage zu verwenden, die zuvor ordnungsgemäß genotypisiert wurden.