Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hocheffiziente dopaminerge Neuronendifferenzierung zu induzieren. In vitro. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Einzelzelladhäsionskultur von humanen pluripotenten P-Stammzellen hergestellt wird.

Im zweiten Schritt wird das Zellkulturmedium auf Neuronen-Induktionsmedien umgestellt, um Bodenplatten-Vorläuferzellen zu induzieren. Anschließend werden die dopaminergen Neuronen in Reifungsmedien kultiviert. Und schließlich werden die einzelligen dopaminergen Neuronenvorläuferzellen 30 Tage lang auf Poly-L-Ornithin-Laminat-Fibronektinplatten und Reifungsmedien kultiviert.

Letztendlich kann die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Expression wichtiger dopaminerger Neuronenmarker zu beurteilen. Diese Technik hat einen größeren Vorteil gegenüber der bestehenden Neurosphäre im Neuro-Acid-Protokoll. Es kann eine homogenere doppelte neuronale Population mit höherer Effizienz erzeugen.

Vier Tage nach der Passage wird das Medium aus den Zellkulturen abgesaugt. Trennen Sie die Zellen mit einem Milliliter Accutane pro Vertiefung und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie während der Inkubation einen Milliliter Gelatine in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und legen Sie die Platte dann zusammen mit den frisch vorbereiteten Matri-Gel-beschichteten Platten in den Inkubator.

Wenn die Zellen halb schwimmend geworden sind, pipettieren Sie sie mehrmals auf und ab, um eine einzelne Zellsuspension herzustellen. Dann ziehst du die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugierst sie drei Minuten lang. Bei 258 g und Raumtemperatur wird das Pellet in der entsprechenden Menge an humanem pluripotentem Stammzellkulturmedium, das mit Serum ergänzt wird, wieder suspendiert und dieses Vivin bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren zugegeben.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in den mit Gelatine beschichteten Platten im Eins-zu-Eins-Verhältnis bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Um die Meth-Feeder zu entfernen, geben Sie die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie sie in humanem pluripotentem Stammzellmedium, ergänzt mit Serum, und zählen Sie sie, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Zellen in MT.SR einem Medium mit diesem Ivan auf eine Konzentration von 180.000 Zellen pro Milliliter.

Aspirieren Sie dann das Matrigel aus den beschichteten Platten und dosieren Sie zwei Milliliter Zellen pro Well. 48 Stunden. Nach dem Replattieren der Zellen in die Matrigelplatten.

Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Geben Sie dann zwei Milliliter KSR-Differenzierungsmedium, das mit SB 4 31, 50 42 und L DN 1 9 3 1 8 9 zu den Zellen ergänzt wird, indem Sie das Medium täglich von D Null auf D 20 wechseln, wie in der Tabelle am Tag 20 dargestellt, aspirieren Sie das Differenzierungsmedium und lösen Sie die Zellen mit einem Milliliter 37 Grad Celsius Acutus pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ab. Während der Inkubation die Poly-L-Orin-Laminin-Fibronektinplatten im Inkubator erwärmen.

Dann, nach der Resus, suspendieren Sie die abgelösten Zellen in einer Einzelzellsuspension und verdünnen Sie die Zellen in neurobasalen Medien. Nach dem Zählen schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet in B 27, Differenzierungsmedium mit einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter. Aspirieren Sie dann das Fibronektin aus den Polyol-Orin-Laminin-Fibronektinplatten.

Waschen Sie sie zweimal mit PBS und übertragen Sie jeweils 400 Mikroliter Zellen darauf. Nun, wechseln Sie schließlich das Medium nach den ersten 24 Stunden und dann jeden zweiten Tag bis zum experimentellen Endpunkt, um alle nicht anhaftenden toten Zellen zu entfernen. Wie in diesen Bildern dargestellt, expandieren replattierte einzellige humane pluripotente Stammzellkulturen während der ersten 48 Stunden der Differenzierung als Cluster und erreichen eine Konfluenz von etwa 70 %.

Nach der Differenzierung erreichen die Zellen in nur drei bis vier Tagen eine vollständige Konfluenz. Am 20. Tag heften sich die differenzierten Zellen an und wachsen als kleine Klumpen. In den nächsten fünf Tagen treten in den Klumpen deutlich intensivere und morphologisch intakte Axone und Neuriten auf, die einige Verbindungen zwischen den Klumpen bilden.

Nach 11 Tagen Differenzierung können die humanen pluripotenten Stammzellen effizient in Bodenplatten-Vorläufer umgewandelt werden. Wie in diesen Bildern gezeigt, exprimieren fast alle Zellen den Bodenplatten-Vorläufer, Zellmarker nisten sich ein und Fuchs A zwei und mehr. 90% der Zellen exprimieren Corin O OTX zwei und LM X one A. Nach weiterer Differenzierung spezialisieren sich die Bodenplatten-Vorläuferzellen auf dopaminerge Neuronen, die TUJ one und TH exprimieren. Diese dopaminergen Neuronen haben eine Neun-Identität, da sie GK zwei exprimieren und negativ für Calbindin sind. Immunfärbeexperimente zeigen auch, dass es keine GFAP-Astrozyten und sehr wenige GABAerge Neuronen gibt, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung ausschließlich spezifisch für die dopaminerge Neuronenlinie ist.

Beim Testen dieses Verfahrens ist es wichtig, die Konsistenz in der täglichen Zellkultur zu wahren und sicherzustellen, dass das Medium frisch mit den richtigen Zutaten zubereitet wird.