Name: Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung dopaminerger Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Modellierung von Parkinson und zellbasierte Therapieansätze.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Renee Reijo Pera Labors für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls und bei der Vorbereitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wird durch das gemeinsame Labor des California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (CL-00518) unterstützt.

1. Herstellung von Nährmedien <ol><li> Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Medium durch die Kombination der folgenden: 445 ml DMEM, 50 ml fetales Rinderserum (FBS) und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 14 Tage. </li><li> Bereiten serumhaltigem HPSC Kulturmedium durch die Kombination der folgenden: 385 ml DMEM / F12, 100 ml Knockout Serumersatz (KSR), 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäure-Stammlösung, 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung, 5 ml 100x -Mercaptoethanol Stammlösung und 10 ng / ml bFGF. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage. </li><li> Bereiten mTeSR1 Serum-freien Medium durch die Kombination der folgenden: 400 ml mTeSR1 Grundmedium, 100 ml 5x zu ergänzen, und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage. </li><li> Bereiten 10x Kollagenase IV-Stammlösung: 0,5 g abwiegen Kollagenase IV Macht, undlösen sie mit 50 ml DMEM / F12 und Filter zu sterilisieren. Aliquots machen und versehen Sie sie bei -20 ° C für Monate. </li><li> Bereiten 0,1% Gelatine-Lösung: 0,5 g abwiegen Gelatine (aus Rinderhaut, Typ B) Kraft und löst ihn mit VE-Wasser. Halten Autoklaven sterilisierte Lösung bei Raumtemperatur für Wochen. </li><li> Bereiten KSR Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäure-Stammlösung, 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung, 5 ml 100x -Mercaptoethanol Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage. HINWEIS: KSR variiert von Charge zu Charge, die die Differenzierung Effizienz beeinträchtigen können. Es ist daher besser, mehrere Chargen von KSR zu testen, um das beste für die Differenzierung zu finden. </li><li> Bereiten N2 Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 Ergänzung und 1 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4° C für nicht mehr als 10 Tage. </li><li> Bereiten B27 Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 480 ml Neurobasalmedium, 10 ml 50x B27 ergänzen, 5 ml 100x Glutamax Stammlösung und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage. </li></ol> 2. Kultur von hES-Zellen und hiPSCs auf MEF Feeder-Zellen Die H9 hES wurden von WiCell Research Institute und hiPSCs wurden in der Reijo Pera Labor durch Retrovirus-vermittelte Transduktion von Yamanaka gegründet Faktoren OCT3 / 4, SOX2, Klf4 und c-MYC 18. <ol><li> Mindestens einen Tag vor der Zelldurchgang, bereiten einige Gelatineplatten durch Zugabe von 1 ml 0,1% Gelatine auf 1 und der 6-Well-Platten, Platten und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 30 min. </li><li> Nach der Inkubation aspirieren Gelatine von den Platten und Samen Bestrahlung inaktiviert MEF-Zellen auf die Platten in einer Dichte von 1,6 x 10 5 Zellen/ Well in MEF Medium mit einer Zählkammer, um die Zellen zu zählen. HINWEIS: Optional MEF Feeder schon nach 3 Tage vor der Zelldurchgang vorzubereiten. </li><li> Passage-Zellen einen Tag nach Plattierung MEF Anleger: absaugen Medium von hPSCs, fügen Sie 1 mg / ml Kollagenase IV-Zellen in 1 ml / Vertiefung und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Während dieser Inkubation, Waschen MEF Feeder einmal mit PBS, und fügen Sie dann warm (37 ° C) serumhaltigem HPSC Kulturmedium bei 1,5 ml / well. </li><li> Nach 1 Stunde, tippen Sie auf der Kulturplatte ein paar Mal, so dass die meisten der undifferenzierte Kolonien von den Platten lösen, während die differenzierte Kolonien befestigt bleiben. Sorgfältig sammeln die schwimmende Kolonien, und sie in 15-ml-Tube. </li><li> Die Platte vorsichtig waschen einmal mit warmem (37 ° C) DMEM / F12 und übertragen DMEM / F12 in den gleichen 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 179 g für 3 min. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Röhren, man aufpassen, dass das Pellet nicht zu stören. Krieg hinzufügenm HPSC Kulturmedium, Pipette die Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sie in kleinen Gruppen zu brechen und mischen sie gut. </li><li> Übertragen Sie die Zellen auf neue MEF Feeder bei 1: 3-1: 6-Verhältnis. </li><li> Ändern Sie das Medium jeden Tag und Durchgang die Zellen alle 5-6 Tage. </li></ol> 3. Herstellung von Zellen zur Differenzierung <ol><li> Mindestens einen Tag vor der Herstellung der Zellen, bereiten einige Matrigel Platten (typischerweise 3 Wells einer 6-Well-Platte). Verdünnen Sie die Matrigel mit kaltem (4 ° C) DMEM / F12 um 1:40 und 1 ml pro Vertiefung Matrigel 6-Well-Platten. Inkubieren Matrigel Platten bei 4 ° C über Nacht. Hinweis: Man kann Matrigel Platten mit Parafilm versiegeln haben und lagern bei 4 ° C solange eine Woche. </li><li> Verwenden Zellen (siehe Schritt 2) 4 Tage nach Durchgang. Entfernen Sie alle differenzierte Kolonien von den Platten. Absaugen Medium von der Kulturplatte, 1 ml pro Vertiefung Accutase, und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Während der Inkubation bereiten einige GelAtins Platten durch Zugabe von 1 ml Gelatine 1 und der 6-Well-Platten. Legen Sie diese Platten und die Matrigel-Platten einen Tag vor im Inkubator bereit. </li><li> Nach der 5-minütigen Inkubation oder wenn die Zellen haben sich halbschwimmend, Pipetten Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sie in Einzelzellen zu machen. </li><li> Sammeln Sie einzelne Zellen in 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren bei 258 g für 3 min. </li><li> Die Zellen mit einer geeigneten Menge an Serum, HPSC Kulturmedium, und fügen Thiazovivin bis zu einer Endkonzentration von 2 uM. </li><li> Übertragung von Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten in einer 1: 1-Verhältnis, und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 30 min bis MEF Feeder entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen, fügen Sie entsprechende Serum mit HPSC Medium und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 258 g für 3 min. </li><li> Während Zentrifuge, fügen Thiazovivin zu mTeSR1 geeignete Medium, um eine Konzentration von 2 um zu machen. </li><li> Nach Zentrifuge, einspirate das Medium mit der geeigneten mTeSR1 Medium mit Thiazovivin so, dass es 1,8 x 10 5 Zellen / ml Medium. </li><li> Nehmen Sie die Matrigel Platten aus dem Inkubator, saugen Sie den Matrigel und 2 ml der gemischten Zellen auf 1 und der 6-Well-Platten. HINWEIS: Die Zelldichte sollte 3,6 x 10 4 Zellen / cm 2 Oberfläche ist. </li><li> Bringen Sie die Platten wieder in den Inkubator, und lassen die Zellen legen für 24 Stunden. </li><li> 24 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen absaugen alte Medium und 2 ml Medium pro neue mTeSR1 gut und lassen Zellen wachsen weitere 24 Stunden vor Beginn der Differenzierung. </li></ol> Zelldifferenzierung <ol><li> Starten Differenzierung 48 Stunden nach der Neubelegung der Zellen auf Matrigel Platten. </li><li> Absaugen Kulturmedium von der Platte, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, und 2 ml der folgenden Differenzierungsmedium pro Well: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542 und 100 nM LDN-193 ergänzt189. Mark diesen Tag als D0 der Differenzierung. </li><li> Ändern Medium täglich von D0 bis D20. HINWEIS: Man kann Medium zur Verwendung nicht mehr als 2 Tage zu einer Zeit vorzubereiten. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D1 und D2: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine und 50 ng / ml FGF8b ergänzt. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D3 und D4: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b und 3 um CHIR99021 ergänzt. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D5 und D6: 75% KSR Differenzierungsmedium plus 25% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b und 3 um CHIR99021 ergänzt. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D7 und D8: 50% KSR Differenzierungsmedium plus 50% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189 und 3 um CHIR99021 ergänzt.</li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D9 und D10: 25% KSR Differenzierungsmedium plus 75% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189 und 3 um CHIR99021 ergänzt. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für D11 und D12: B27 Differenzierungsmedium mit 3 um CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM cAMP ergänzt. </li><li> Verwenden Sie das folgende Medium für den Rest der Differenzierung: B27 Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM cAMP ergänzt. </li><li> Bei etwa D16 der Differenzierung, bereiten einige Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten. Verdünnen Poly-L-Ornithin-Stammlösung mit kaltem (4 ° C) PBS bis 15 pg / ml, 1 ml auf 1 und der 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Saugen Sie den Poly-L-Ornithin-Lösung, waschen Sie die Platten 3 mal mit sterilem Wasser und dann an der Luft trocknen die Platten. </li><li> Verdünnen Laminin Lager Solution mit kaltem (4 ° C) PBS auf 1 pg / ml, 1 ml einer gut 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Saugen Sie den Laminin-Lösung, waschen Sie die Platten 3 mal mit sterilem Wasser und dann an der Luft trocknen die Platten. </li><li> Verdünnen Fibronektin-Stammlösung mit kaltem (4 ° C) PBS auf 2 pg / ml, 1 ml auf 1 und der 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Dichtungsplatten mit Parafilm und sie bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. </li><li> Nach 20 Tagen der Differenzierung, Ausstrich der Zellen an die Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten. Absaugen Differenzierungsmedium, 1 ml warmem (37 ° C) bis 1 Accutase auch der 6-Well-Platten und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Während der Inkubation, legen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten in den Inkubator. </li><li> Nach der 5-minütigen Inkubation oder wenn die Zellen haben sich halbschwimmende, sanft Pipette Zellen nach oben und unten mehrere Male, ummachen sie in einzelne Zellen. </li><li> Sammeln Sie die einzelnen Zellen in 15 ml konischen Röhrchen, und fügen Sie die entsprechende Menge an Neurobasalmedium zur Zellzählung, die je nach Ausdehnung variieren (nach 11 Tagen der Differenzierung, Zellen 15-20 fach erweitern). Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 258 g für 3 min. Überstand wird abgesaugt, und resuspendieren Zellen mit B27 Differenzierungsmedium, so daß die Zellkonzentration 1 x 10 6 Zellen / ml Medium. </li><li> Absaugen Fibronektin von den Platten, zweimal waschen mit PBS, und 2 ml Zellen 1 gut 6-Well-Platten. HINWEIS: Die Zelldichte für Replattierung sollte 2 x 10 5 Zellen / cm 2 Oberfläche ist. </li><li> Ändern Medium 24 Stunden später, um alle losen toten Zellen zu entfernen. </li><li> Ändern Medium jeden zweiten Tag, bis die gewünschten Zeitpunkte für einen bestimmten Experiment. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hES und einschließlich der beiden hiPSCs) in vitro differenziert werden, um die meisten zu erzeugen, wenn nicht alle, Zellarten des Körpers einschließlich der DA-Neuronen, die in früheren Studien 19 nachgewiesen wurde. Hier, auf der Kenntnis von embryonalen dopaminergen Neuronen-Entwicklung 20 und veröffentlichte Protokolle von anderen Laboratorien 14,15 optimierten wir die Kulturbedingungen für die Erzeugung von DA-Neuronen aus HES und hi...

Dopaminergen (DA) Neuronen in verschiedenen Hirnregionen, einschließlich des Mittelhirns, dem Hypothalamus, der Netzhaut und Riechkolben finden. Die A9 DA Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) Regelverhalten und Bewegung durch die Projektion zum Striatum im Vorderhirn und Formen des extrapyramidal-motorischen Systems. Degeneration der A9 DA Neuronen führt zu Parkinson-Krankheit (PD), die die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung menschlichen und derzeit unheilbar ist. Zellersatztherapie ist eine der vielversprechendsten Strategien für die Behandlung von PD 1, daher besteht ein großes Interesse bei der Ableitung A9 DA-Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), die sowohl menschliche embryonale Stammzellen (hES) und jüngsten Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Viel Forschung hat versucht, A9 DA Neuronen aus hPSCs mit verschiedenen Methoden abzuleiten. Die frühesten Berichte alle generierten DA Neuronen durch ein neuronalesRosette Vorläuferstadium. Durch Co-Kultivierung mit MS5 2 oder PA6 3-5 Stromazellen mit oder ohne externe Wachstumsfaktoren für 2-4 Wochen, L. Studer und Kollegen und drei anderen Gruppen erfolgreich induzierte neuronale hES Rosetten zu produzieren. Sie bereicherten dann diese Rosetten durch mechanische Präparation oder enzymatische Verdauung zur weiteren Differenzierung. In anderen Berichten, erzeugt Forscher neuralen Rosetten durch Embryoidkörper (EB) schwimmenden Kultur Differenzierung 6-9. Später etablierte Forscher eine Monoschicht auf Basis Differenzierung Methode 10,11, wo sie vergoldet und hES hiPSCs auf extrazellulären Matrix, fügte verschiedene Wachstumsfaktoren in der Kultur, die Differenzierung von hPSCs DA Neuronen, die die In-vivo-embryonalen Entwicklung DA Neuronen imitiert induzieren . Obwohl alle diese Studien erhalten Tyrosinhydroxylase (TH) exprimierenden Zellen mit einigen Merkmalen der DA-Neuronen, die gesamte Prozesszeit Differenzierung und arbeitsaufwendig,im allgemeinen ineffizient, und noch wichtiger, sind die A9 Identität dieser Neuronen in den meisten Studien, außer dem einen mit LMX1A ektopische Expression 12 gezeigt. Kürzlich wurde eine neue Bodenplatte (FP) basierenden Protokoll wurde entwickelt, 13-16, bei der die FP-Vorstufen mit DA Neuron Potential wurden zuerst durch Aktivierung des Sonic-Hedgehog und Wnt-Signalwege während der frühen Phase der Differenzierung erzeugt wird, und dann Die FP-Zellen wurden weiter auf DA-Neuronen angegeben. Obwohl dieses Protokoll ist effizienter, gibt es noch einige Probleme; zum Beispiel, dauert der gesamte Differenzierung lange Zeit (mindestens 35 Tage) und feeder-Zelle abhängig 15 oder 16 abhängig ist, EB oder A9 Identität nicht nachgewiesen wurde 14. Hier, auf der Basis der Kenntnis von in vivo embryonalen DA Neuronenentwicklung und andere Forscher veröffentlichten Ergebnisse haben wir die Kulturbedingungen für die eff optimiertiziente Generation von DA Neuronen von beiden HES-Zellen und hiPSCs. Zunächst erzeugt FP-Vorläuferzellen durch Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalmolekül mit kleinen CHIR99021 und Sonic Hedgehog-Signal mit kleinen Molekülen und SAG purmorphamine. Diese FP-Zellen exprimieren FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 und NESTIN. Wir angegebene dann diese FP-Zellen zu DA Neuronen mit Wachstumsfaktoren, einschließlich BDNF, GDNF, etc. Die erzeugten DA Neuronen der A9 Zelltyp, wie sie sind für GIRK2 positive und negative für Calbindin 17. Dieses Protokoll ist Feederzell-oder EB-unabhängigen, hocheffiziente und reproduzierbar. Mit diesem Protokoll kann man DA Neuronen in weniger als 4 Wochen aus hES-Zellen oder hiPSCs von Normalpersonen für Zelltransplantation Studie oder von hiPSCs von PD-Patienten für die in vitro Modellierung der PD oder Test potentielle therapeutische Mittel für PD abzuleiten.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Ampicillin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologien</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>F& Technik D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-NESTIN Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-OTX2-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Human-FOXA2-Antikörper</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen anti human LMX1a Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen anti human TH Antikörper</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Huhn anti human TH Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus anti human TUJ1 Antikörper</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen anti human GIRK2 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen anti human Calbindin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 Verdünnung</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

regie dopaminergen neuron differenzierung von humanen pluripotenten stammzellen

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminerge (DA) Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (auch bekannt als A9 DA-Neuronen) sind der spezifische Zelltyp, der bei der Parkinson-Krankheit (PD) verloren geht. Es besteht ein großes Interesse an der Gewinnung von A9-DA-Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für die regenerative Zellersatztherapie bei Parkinson. Während der neuronalen Entwicklung stammen A9-DA-Neuronen aus den Vorläufern der Bodenplatte (FP), die sich an der ventralen Mittellinie des Zentralnervensystems befinden. In dieser Arbeit optimierten wir die Kulturbedingungen für die schrittweise Differenzierung von hPSCs zu A9 DA-Neuronen, was die Entwicklung embryonaler DA-Neuronen nachahmt. In unserem Protokoll beschreiben wir zunächst die effiziente Erzeugung von FP-Vorläuferzellen aus hPS-Zellen mit einer niedermolekularen Methode und wandeln dann die FP-Zellen in A9-DA-Neuronen um, die in vitro über mehrere Monate aufrechterhalten werden können. Dieses effiziente, wiederholbare und kontrollierbare Protokoll funktioniert gut in humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) von normalen Personen und Parkinson-Patienten, in denen man A9-DA-Neuronen ableiten konnte, um eine In-vitro-Krankheitsmodellierung und ein Wirkstoffscreening sowie eine in vivo-Zelltransplantationstherapie für Parkinson durchzuführen.

Ein Überblick über die Differenzierung Protokoll ist in 1 dargestellt. Die Effizienz der hier vorgestellten Differenzierungsprotokoll beruht auf den Status der Ausgangszellen. Daher ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass alle ersten differenzierten Kolonien entfernt, bevor Dissoziieren hPSCs in einzelne Zellen zur Differenzierung und zweitens verbraucht eine meisten, wenn nicht alle, der MEF-Feeder-Zellen durch Inkubation der Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten 30 Minuten, und die dritte, e...

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine hochgradig effiziente Differenzierung dopaminerger Neuronen in vitro zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Einzelzell-Kultur menschlicher pluripotenter Stammzellen unter Verwendung einer Anheftungskultur vorbereitet wird.Im zweiten Schritt wird das Zellkulturmedium durch Neuroneninduktionsmedium ersetzt, um Floorplate-Progenitoren zu induzieren. Anschließend werden die dopaminergen Neuronen in Differenzierungsmedium kultiviert. Schließlich werden die einzelnen dopaminergen Neuronen-Progenitoren auf Poly-L-Ornithin-Laminin-Fibronectin-Platten in Differenzierungsmedium für einen Zeitraum von 30 Tagen kultiviert.Schließlich kann die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Expression wichtiger Marker dopaminergener Neuronen zu beurteilen. Diese Technik bietet gegenüber dem bestehenden Neurosphären- auf Neurosäure-Protokoll einen größeren Vorteil. Sie kann homogenere doppele neuronale Populationen mit höherer Effizienz erzeugen.Vier Tage nach der Passage das Medium aus den Zellkulturen aspirieren. Die Zellen mit einem Milliliter Accutase pro Vertiefung lösen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der Inkubation je ein Milliliter Gelatine in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte geben und anschließend die Platte zusammen mit frisch vorbereiteten, mit Matrigel beschichteten Platten in den Inkubator stellen.Wenn die Zellen halbschwebend geworden sind, pipettieren Sie sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Danach saugen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren sie drei Minuten lang bei 258 ×g und Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das Pellet in der geeigneten Menge an humanem pluripotenten Stammzell-Kulturmedium, das mit Serum ergänzt wurde, und geben Sie Thi Vivin in einer Endkonzentration von zwei Millimolar hinzu.Als Nächstes die Zellen in mit Gelatine beschichteten Platten im Verhältnis 1:1 bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Um die Meth-Feeder zu entfernen, die Zellen anschließend in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Mit humanem pluripotenten Stammzellmedium, ergänzt mit Serum, verdünnen und nach erneutem Abzentrifugieren der Zellen zählen. Die Zellen in MT.SR-einem Medium mit Thias-Ivan erneut suspendieren, um eine Konzentration von 180.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.Anschießend das Matrigel von den beschichteten Platten abpipettieren und zwei Milliliter Zellen pro Vertiefung zugeben. 48 Stunden. Nach dem Umpipettieren der Zellen in die Matrigel-Platten.Entfernen Sie das Medium aus jedem Well und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Geben Sie dann zwei Milliliter KSR-Differenzierungsmedium, ergänzt mit SB 4 31, 50 42 und L DN 1 9 3 1 8 9, zu den Zellen hinzu und wechseln Sie das Medium täglich von Tag null bis Tag 20, wie in der Tabelle dargestellt. Am Tag 20 saugen Sie das Differenzierungsmedium ab und lösen die Zellen mit einem Milliliter 37 Grad Celsius warmem Acutase pro Well bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ab. Während der Inkubation erwärmen Sie Poly-L-Ornithin-Laminin-Fibronectin-Platten im Inkubator. Danach nach Resus die abgelösten Zellen in eine Einzelzell-Suspension überführen und die Zellen in Neurobasal-Medium verdünnen. Nach der Zellzählung die Zellen centrifugieren und das Zellpellet in B-27-Differenzierungsmedium mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter resuspendieren. Anschließend das Fibronectin von den Poly-L-Ornithin-Laminin-Fibronectin-Platten abpipettieren.Waschen Sie sie zweimal mit PBS und überführen Sie 400 Mikroliter Zellen in jedes. Gut schließlich wechseln Sie das Medium nach den ersten 24 Stunden und danach alle zwei Tage bis zum experimentellen Endpunkt, um nicht angeheftete tote Zellen zu entfernen. Wie in diesen Bildern veranschaulicht, werden neu ausplattierte Einzelzell-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen sich während der ersten 48 Stunden der Differenzierung als Zellhaufen ausbreiten und eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen.Nach der Differenzierung erreichen die Zellen bereits innerhalb von drei bis vier Tagen vollständige Konfluenz. Am Tag 20 heften sich die differenzierten Zellen an und wachsen als kleine Zellhaufen. In den folgenden fünf Tagen treten deutlich intensivere sowie morphologisch intakte Axone und Neurite innerhalb der Haufen auf und bilden einige Verbindungen zwischen den Haufen aus.Nach 11 Tagen der Differenzierung können humane pluripotente Stammzellen effizient in Floor-Plate-Vorläuferzellen umgewandelt werden. Wie in diesen Bildern gezeigt, exprimieren nahezu alle Zellen die Marker für Floor-Plate-Vorläuferzellen, Nestin und FoxA2, und über 90 % der Zellen exprimieren Corin, OTX2 und LMX1A. Nach weiterer Differenzierung spezialisieren sich die Floor-Plate-Vorläuferzellen zu dopaminergen Neuronen, die TUJ1 und TH exprimieren. Diese dopaminergen Neuronen weisen eine mesenkphale Identität auf, da sie GSK3β exprimieren und für Calbindin negativ sind. Immunfärbungsexperimente zeigen außerdem, dass keine GFAP-positiven Astrozyten und nur sehr wenige GABAerge Neuronen vorhanden sind, was darauf hinweist, dass die Differenzierung ausschließlich spezifisch für die dopaminerge Neuronenlinie ist.Bei der Überprüfung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Konsistenz in der täglichen Zellkultur beizubehalten und sicherzustellen, dass das Medium frisch mit den richtigen Bestandteilen hergestellt wird.

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Dieses Video zeigt die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden unter Verwendung eines neuronalen Differenzierungsmediums zu neuralen Vorläuferzellen differenziert. Während die Differenzierung in nicht-transgenen Zellen mit kleinen Molekülen induziert wird, werden die transgenen hPSCs durch Zugabe eines Antibiotikums differenziert, das den Promotor für einen neuronalen differenzierungsspezifischen...

Differenzierung von nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung in Neuronen durch Transfektion mit gentechnisch veränderten Lentiviren, die ein neurogenes Transkriptionsfaktor-Gen tragen, unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements, gefolgt von einer Behandlung mit einem Tetracyclin-Derivat und einem Reifungsmedium.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Neuronen mit gentechnisch veränderten Lentiviren

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) in dopaminerge Neuronen, um ein Modell für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit bereitzustellen. Die hES-Zellen werden in einem neuronalen Induktionsmedium in einer Mikrotiterplatte kultiviert, um 3D-Neurosphären zu bilden. Diese werden dann in einem neuronalen Induktionsmedium kultiviert, um die Differenzierung in dopaminerge Vorläuferneuronen zu fördern. Die endgültige Reifung der Neuronen erfolgt in einem...

Erzeugung dopaminerger neuronaler Organoide aus humanen embryonalen Stammzellen

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung dopaminerger Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Modellierung von Parkinson und zellbasierte Therapieansätze.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

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