Die Anwendung der Zwei-Spinnmilbe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Spinnmilben eines bestimmten Entwicklungsstadiums schnell und zuverlässig zu sammeln. Dies wird erreicht, indem zunächst Spinnmilben auf Bohnenpflanzen gezüchtet werden. Anschließend wird die Versuchspflanze mit weiblichen Milben mit Hilfe eines Pinsels oder einer Pumpe befallen, abhängig von der Anzahl der Milben, die auf eine einzelne Pflanze aufgebracht werden sollen.

Der letzte Schritt besteht in der manuellen Quantifizierung der Pflanzenschäden mittels der Rastermethode in einem Grafikbearbeitungsprogramm. Abschließend wird eine statistische Analyse verwendet, um die unterschiedliche Anfälligkeit von Pflanzenlinien oder Ökotypen gegenüber Spinnmilben zu zeigen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren liegt darin, dass sie eine effiziente, schnelle und einfache Sammlung einer großen Anzahl erwachsener weiblicher Milben ermöglicht, deren Anwendung auf eine experimentelle Pflanzenwirtart sowie die Beurteilung der durch Milbenfressverhalten verursachten Pflanzenschäden.

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Sammlung von Hunderten von Individuen in jedem Entwicklungsstadium, die für nachfolgende experimentelle Anwendungen verwendet werden können. Beginnen Sie damit, Kalifornische rote Kidneybohnenpflanzen zwei bis drei Wochen vor der Infestation aus Samen zu ziehen, und mischen Sie diese Pflanzen mit befallenen Pflanzen. Adulte Milben besiedeln das frische Pflanzenmaterial rasch.

Entfernen Sie alle sieben bis zehn Tage alte befallene Bohnenpflanzen und ersetzen Sie sie durch frische Pflanzen, um die Milben mit der Waschmethode zu sammeln. Stellen Sie eine frische Bohnenpflanze ein bis zwei Tage vor dem Experiment in Kontakt mit den befallenen Pflanzen. Verwenden Sie 20 bis 30 frische Bohnenpflanzen, um 1000 bis 2000 weibliche erwachsene Milben zu sammeln.

Am Tag des Experiments schneiden Sie die Milbe. Behandeln Sie die befallenen Bohnenpflanzen am Stammansatz und waschen Sie die befallenen Bohnenpflanzen zwei bis drei Pflanzen gleichzeitig in einer 0,001 %igen Tween-20-Lösung. Jede Pflanze wird zwei bis drei Mal gewaschen, um alle Milben von den Blättern zu sammeln.

Arbeiten Sie innerhalb eines Zeitfensters von 10 Minuten, um die Mortalität der Milben zu vermeiden. Bereiten Sie anschließend ein 500-Mikrometer-Sieb vor, um Verunreinigungen zu entfernen, und ein 300-Mikrometer-Sieb, um weibliche adulte Milben zu sammeln. Filtern Sie die Suspension durch das 500-Mikrometer-Sieb und füllen Sie die Suspension danach erneut durch das 300-Mikrometer-Sieb.

Weibliche erwachsene Milben bleiben zurück, wenn sich zu viel Schaum im Sieb angesammelt hat. Bei Milben kann vorsichtig unter langsam laufendem Wasser mit Raumtemperatur nachgespült werden. Tauchen Sie ein 300-Mikrometer-Sieb mit erwachsenen weiblichen Milben in sauberes Leitungswasser, um das Tween 20 zu entfernen, und verteilen Sie die Milben gleichmäßig in einer einzigen Schicht auf dem Boden des Siebs.

Entfernen Sie mit einem Papiertuch überschüssiges Wasser vom Netz und den Seiten des Siebs, damit die Milben schnell austrocknen und sich erholen können. Stellen Sie anschließend ein Sieb mit Milben auf das als Unterlage verwendete Sieb. Umgeben Sie das untere Sieb mit Wasser, um zu verhindern, dass sich die Milben verteilen.

Dies ermöglicht es den Milben, sich frei zu bewegen, verhindert jedoch, dass sie entkommen. Die Infektion mit Spinnmilben mithilfe eines Pinsels wird verwendet, um bis zu 30 Milben pro Pflanze aufzutragen. Verwenden Sie einen weichen, runden Kunstpinsel der Stärke null, null oder feiner.

Befeuchten Sie die Bürste mit Wasser von Raumtemperatur. Nehmen Sie die Milben vorsichtig mit der Bürstenspitze vom Sieb auf und übertragen Sie sie auf die Pflanze. Wenn mehr als 30 Milben appliziert werden, erfolgt die Pflanzenbefallung mit Milben, die mittels einer Pump-Vakuumabsaugung gesammelt wurden.

Befestigen Sie für dieses Verfahren eine 1 ml Pipettenspitze an dem Röhrchen, das mit der Pumpe oder Vakuumleitung verbunden ist, indem Sie ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen verwenden. Schneiden Sie an der Unterseite ab und platzieren Sie als Adapter zwischen dem Vakuumrohr der Pumpe und der Spitze ein Stück Papiertuch zwischen die Pipettenspitze und den Adapter. Der Zweck hierbei besteht darin, Milben während des Aspirationsvorgangs in der Pipettenspitze einzufangen und zudem den Luftstrom zu verringern, um Milben direkt vom Sieb mithilfe der Pipettenspitze aufzusammeln.

Sammeln Sie die Milben alternativ einzeln von befallenen Blättern unter dem Stereomikroskop. Sobald die erforderliche Anzahl an Milben gesammelt wurde, nehmen Sie die Pipettenspitze vom Reagenzglas ab und achten Sie darauf, dass das Stück Papiertuch am hinteren Ende der Pipettenspitze ungestört bleibt.

Sammeln Sie die Milben, indem Sie die Pipettenspitze antippen und die Milben zusammenklumpen. Anschließend bringen Sie sie auf das Blatt. Innerhalb von Sekunden beginnen sich die Milben auf dem Blatt zu verteilen.

Um Pflanzenschäden zu dokumentieren, bedecken Sie die Scanfläche mit einer Transparentfolie, um die Oberfläche des Scanners vor Verunreinigungen zu schützen. Schneiden Sie die gesamte Rosette aus und legen Sie sie auf die Scanfläche.

Die adaxialen Seiten der Blätter zeigen also zum Scanner. Bei vorhandener Lichtquelle und Erfassungselement können mehrere Rosetten gleichzeitig gescannt werden. Alternativ, falls Rosetten zu dicht sind, um einzelne Blätter ohne Überlappung aufzunehmen, dispergieren Sie die Rosette mit feinen Scheren in einzelne Blätter oder Gruppen nicht überlappender Blätter, bevor Sie sie auf den Scanner legen.

Bedecken Sie Rosetten oder Blätter mit einem Stück weißem Papier, um die Anhaftung an und Kontamination der Abdeckung des Scanners zu verhindern. Schließen Sie die Scannerabdeckung und führen Sie einen Scan mit einer Auflösung von 1.200 DPI, einer Helligkeitseinstellung von plus 25 und einem Dateityp mit maximaler JPEG-Qualität durch. Speichern Sie die Bilddateien für die anschließende Schadensanalyse.

Um den Pflanzenschaden zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild der Pflanze mit Photoshop. Erstellen Sie eine neue Ebene. Legen Sie dann das gescannte Bild mit dem Raster aus Punkt 25 Millimeter mal Punkt überlagert an.

25 Millimeter-Einteilungen auf einer überlagerten Ebene. Kennzeichnen Sie beschädigte Blattbereiche mit einem Punkt mithilfe des Bleistiftwerkzeugs. Verwenden Sie einen einzelnen Punkt für jedes Quadrat des unten liegenden Rasters, in dem Schäden mehr als die Hälfte der Rastereinheit bedecken.

Die Größe des. wird in Pixeln definiert. Wenn alle Quadrate des Rasters, die Pflanzenschäden anzeigen, die mindestens die Hälfte der Rastereinheit bedecken, mit einem Punkt markiert sind, wird ein Histogramm-Tool verwendet, um die Anzahl der Pixel auf der Ebene zu bestimmen, die die Anzahl der Punkte und damit die Gesamtanzahl der markierten Quadrate repräsentiert.

Berechnen Sie die Anzahl der Punkte, indem Sie die Gesamtanzahl der Pixel durch die Anzahl der Pixel pro Punkt teilen. Berechnen Sie die Gesamtfläche des Schadens, indem Sie die Anzahl der markierten Punkte auf dem Bild mit der Fläche eines Gitterquadrats multiplizieren, da ein Punkt einem Gitterquadrat entspricht. Dieses Diagramm zeigt die auf drei Wochen alten AANA-Pflanzen gemessene Schadensfläche.

Vier Tage nach der Applikation von 20 weiblichen Spinnmilben. Die Ergebnisse der Pflanzenschädigung sind reproduzierbar, was zeigt, dass die gesammelten Milben einen ähnlichen physiologischen Zustand aufweisen und für Untersuchungen zur Interaktion zwischen Pflanzen und Spinnmilben geeignet sind. Diese Grafik zeigt die Schadensfläche an drei Wochen alten AANA-Pflanzen vier Tage nach der Applikation von 20 weiblichen Spinnmilben.

Als Beispiel für eine experimentelle Anwendung wurde die natürliche Variation und Anfälligkeit gegenüber Spinnmilben, oderry, an drei aana-Sorten untersucht, indem 20 weibliche Spinnmilben pro Pflanze mit einem feuchten Pinsel aufgetragen und der Schaden vier Tage nach der Infektion erfasst wurde. Die Quantifizierung der Schadensdaten kann als Balkendiagramm oder Boxplot dargestellt und mit der geeigneten statistischen Methode analysiert werden. In diesem Beispiel variiert die Anfälligkeit gegenüber Spinnmilben oder bry signifikant zwischen den Versuchsreihen.

Die Isolierung und Infestierung können innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden, abhängig von der Anzahl der Proben und der gewählten Arbeitsabfolge. Es ist wichtig zu beachten, dass die Milben nicht länger als 10 Minuten in der 20er Lösung untergetaucht sein sollten. Das Isolierverfahren mithilfe des Seed-Systems kann verwendet werden, um Fraktionen von Milben in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erhalten, die für eine Vielzahl von Experimenten genutzt werden können, nicht nur im Bereich der Wechselwirkung zwischen Schädlingen und Pflanzen, sondern auch in der Entwicklungsphysiologie und Molekularbiologie.