Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung auf die Zellstruktur und die Proteinlokalisation in BE-Zellen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem die auf die Glasdeckgläser gezüchteten BE-Zellen mit einem ausgewählten Medikament unter Standard-Zellkulturbedingungen inkubiert werden. In einem zweiten Schritt werden die behandelten Zellen mit einem Fixiermittel inkubiert, das die Proteinstruktur und -lokalisation bewahrt.

Als nächstes werden fixierte Zellen sequentiell mit primären und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern inkubiert, um Veränderungen im ausgewählten Zielprotein mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, wie die medikamentöse Behandlung von be-Zellen die Proteinlokalisierung und die Zellstruktur auf der Grundlage der Visualisierung der Immunfluoreszenzfärbung verändert. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Barrett-Speiseröhre geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Krebs und normale Zellen angewendet werden. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die 18 Millimeter großen Deckgläser in eine gläserne Petrischale legen und autoklavieren.

Übertragen Sie dann die Deckgläser des Autoklaven mit einer sterilen Glaspipette, die an einem Vakuumröhrchen befestigt ist, in eine 12-Well-Gewebekulturschale. Nach dieser Wäsche wird der Bezug mit sterilem PBS und Medien überzogen. Als nächstes Trypsin.

Die immortalisierten Zellen zählen die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers oder eines Hämozytometers und verdünnen die Zellen anschließend in Kulturmedien auf eine Konzentration von 20.000 bis 40.000 Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann einen Milliliter Zellen in jede Vertiefung mit einem Deckglas. Für eine Gesamtzellzahl von 20.000 bis 40.000 Zellen pro Vertiefung verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um das Deckglas vorsichtig auf den Boden der Vertiefung zu schieben, um sicherzustellen, dass die Zellen an dem Deckglas anhaften.

Um die BE-Zellen zu behandeln, verdünnen Sie das ausgewählte Arzneimittel in 37 Grad Celsius Medium auf die gewünschte Konzentration, mischen Sie es gut, indem Sie das Röhrchen wiederholt umdrehen oder einen Vortex-Mischer verwenden. Beginnen Sie die Behandlung 24 Stunden nach dem ersten Einsetzen der BE-Zellen, um die Zellanheftung auf der Abdeckung zu ermöglichen Schieben Sie jetzt vorbeschriftete Proben aus dem Arzneimittel und dem Vehikel mit einem Laborstift auf, um zwischen Vergleich und Kontrolle zu unterscheiden. Behandeln Sie ein zusätzliches Deckglas von be-Zellen mit 0,1 %Vehikel, das im Kulturmedium verdünnt ist.

Legen Sie die Zellen anschließend in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 98 % Luftfeuchtigkeit. Jetzt, nach der gewünschten Inkubationszeit der medikamentösen Behandlung, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Deckgläser schnell mit einem XPBS bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann das PBS und geben Sie einen Milliliter PBS mit 4 % PFA in jede Vertiefung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Als nächstes aspirieren Sie die 4%P-F-A-P-B-S Waschen Sie die Einbezugsbezüge dreimal fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur. Lagern Sie die Deckgläser auf Wunsch eine Woche lang in PBS und 0,1 % PFA bei vier Grad Celsius. Um die fixierten PFA-Zellen durchlässig zu machen, um dem Antikörper den Zugang zu den intrazellulären Zielen zu ermöglichen, inkubieren Sie die Zellen mit 50 millimolarem Ammoniumchlorid, verdünnt in PBS, für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie sie dann einmal fünf Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur. Dadurch wird der Hintergrund reduziert, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern an die zellulären Proteine zu verhindern. Inkubieren Sie die BE-Zellen 30 Minuten lang in 100 bis 300 Mikrolitern PBS, die 0,1 % Troponin und 0,5 % BSA enthalten.

Bereiten Sie dann eine quadratische Bioassay-Schale vor, indem Sie den Boden der Kammer mit nassen Papiertüchern beschichten und eine Schicht Parfum darauf legen. Markieren Sie das Parfum mit einem Laborstift, um die Deckgläser zu identifizieren. Übertragen Sie die nach oben zeigenden Zellen mit einer Pinzette und einer Spritzennadel vorsichtig auf den Parameter.

Verdünnen Sie nun den Primärantikörper in PBS, der sowohl 0,5 % BSA als auch 0,1 % Saponin enthält, und tupfen Sie die Blockierungslösung vorsichtig ab. Geben Sie mit einem Laborgewebe 100 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag.

Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS mit 0,5 % BSA und 0,1 % Troponin jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie dann den Sekundärantikörper, der mit einem Fluoreszenz-Tag in PBS konjugiert ist, der 0,5 % BSA und 0,1 % Komponente enthält. Geben Sie 100 Mikroliter verdünnten Antikörper auf jedes Deckglas und inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Eindeckeinlagen dreimal jeweils fünf Minuten in PBS, das 0,5 % BSA und 0,1 % Troponin enthält. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie 100 bis 300 Mikroliter PBS auf die Deckgläser. Heben Sie den Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette an und tupfen Sie das PBS mit einem Labortuch oder Papiertuch ab.

Geben Sie dann 15 Mikroliter eines geeigneten Antifa-Eindeckmediums mit DPI auf das Deckglas. Legen Sie den umgekehrten Deckglas mit den Zellen nach unten auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Legen Sie die Objektträger anschließend in einen Objektträgerordner und halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur von direktem Licht fern, damit das Antifa-Medium aushärten kann.

Sobald das Antifa-Medium ausgehärtet ist, können die Dias entweder bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis sie mikroskopisch sichtbar werden. In diesem Schritt entnehmen Sie die Objektträger von minus 20 Grad Celsius oder vier Grad Celsius und lassen sie auf Raumtemperatur erwärmen. Schalten Sie das Mikroskop und die Quecksilberbogenlampe ein.

Legen Sie einen Objektträger mit dem Deckglas in Richtung Objektiv auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie als Nächstes den DAPI-Filter aus und öffnen Sie den Verschluss. Fokussieren Sie das Objektiv, während Sie durch die Okulare schauen, bis das Bild erscheint.

Da alle Zellen mit dpi gefärbt wurden, sollten die Zellkerne leicht beobachtet werden können. Sammeln Sie Bilder mit geeigneter Bildverarbeitungssoftware: In dieser Abbildung wurden Deckblätter mit CPC und CPD mit einem Vehikel oder einem Mikromolar des SRC-Inhibitors behandelt. SKI 6 0 6 für 24 Stunden wurden die Zellen dann fixiert und gefärbt.

Gemäß dem beschriebenen Protokoll wurde das in Grün angezeigte Beta-Catenin unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers und eines Sekundärantikörpers, der an LOR 4 88 gekoppelt war, sichtbar gemacht, während der Zellkern mit der in Blau angezeigten DPI angefärbt wurde. Beachten Sie die Veränderung des Ortes von Beta-Catenin vom Zellkern zur Zellmembran. Nach der Behandlung mit SKI 6 0 6.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Barrett-Ösophagus immunfluoreszierend färbt, um die Proteinlokalisierung oder die Zellstruktur zu untersuchen.