Ein kleines Volumen Verfahren für Viral Konzentration von Wasser
3. Februar 2015
Es wurde ein Ansatz entwickelt, um optimale Viruskonzentrationsbedingungen für Wasserproben mit kleinem Volumen unter Verwendung von Spikes des humanen Adenovirus zu identifizieren. Die hier beschriebenen Techniken werden verwendet, um Konzentrationsparameter für andere virale Ziele zu identifizieren, und werden auf groß angelegte Experimente zur Viruskonzentration angewendet.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Virusrückgewinnung aus Wasser mithilfe einer ursprünglich zur Optimierung der Virusanreicherung entwickelten Methode im kleinen Maßstab zu verbessern. Ein Glas-Cellulose-Filter erwies sich als der beste elektropositive Filter zur Anreicherung von Adenoviren aus Wasser. Als sekundäre Elutionsmethode erwies sich die Konzentration mit Celite als am besten geeignet, um Adenoviren von den Filteroberflächen zu eluieren. Die resultierende Methode ermöglicht die Rückgewinnung der höchsten Menge an Adenoviren aus Leitungswasser, basierend auf den höchsten prozentualen Rückgewinnungsraten im Vergleich zu allen getesteten Kombinationen aus Filtern und Elutionsverfahren.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der großtechnischen Volumenkonzentration besteht darin, dass sie geringere Probenvolumina nutzt und es ermöglicht, eine Vielzahl von Konzentrationsvariablen schnell und einfach zu bewerten.
Stellen Sie vor Beginn dieses Protokolls sicher, dass alle benötigten Lösungen bereitstehen, einschließlich der über einen 0,22-Mikron-Filter sterilisierten Viruslösung mit einer Konzentration von 10 bis 100.000 MPN pro Milliliter.
Messen Sie zunächst einen Liter sterilem Leitungswasser ab und geben Sie es in einen Zwei-Liter-Becher mit einem Magnetrührstab. Während das Wasser gerührt wird, fügen Sie 0,7 Gramm Natriumthiosulfat hinzu und lassen es vollständig auflösen. Danach stellen Sie den pH-Wert durch tropfenweises Zugabe von einmolarer Säure- oder Basen-Stammlösung auf einen Wert zwischen 7 und 7,5 ein. Anschließend versetzen Sie das Wasser mit dem Virus, indem Sie einen vollen Milliliter der hergestellten Viruslösung hinzufügen. Bedecken Sie den Becher mit einer sterilen Abdeckfolie und lassen Sie das Virus 10 Minuten lang in das Wasser einmischen.
In der Zwischenzeit bereiten Sie den Millipore-Filter vor. Nehmen Sie ihn zunächst aus der Verpackung und stellen Sie sicher, dass er fest zwischen der oberen Schale und dem unteren Sieb sitzt. Prüfen Sie anschließend, ob das Korkmaterial des Filters gut auf den Rand eines einliterigen Seitenhalskolbens passt. Entfernen Sie nun die obere Schale des Filters und legen Sie mit einer Pinzette eine 47 Millimeter große elektropositive Filtermembran genau mittig auf das Filtersieb. Danach setzen Sie die Schale wieder auf und befestigen sie durch eine Drehung gegen den Uhrzeigersinn.
Messen Sie 100 Milliliter des belasteten Leitungswassers mit einem sterilen Zylinder ab. Überführen Sie das Wasser anschließend in das vorbereitete Filtergehäuse auf dem Zwei-Liter-Kolben. Die elektropositive Scheibe im Filter kann aus gefalteter Glas-Cellulose oder nanoaluminierten Glasfasern bestehen. Ein sanfter Unterdruck kann verwendet werden, um das restliche Wasser durch den Filter zu leiten.
Versetzen Sie nun das Filtergehäuse in einen 250-Milliliter-Kolben mit Seitenhals. Geben Sie 100 Milliliter Rinderextrakt ab und gießen Sie ihn langsam auf den Filter. Lassen Sie den Extrakt langsam durchlaufen und verwenden Sie ein sanftes Vakuum, um den Rest durchzuziehen.
Danach mit einer der beiden sekundären Konzentrationsoptionen fortfahren.
Um das Virus mithilfe von Celite zu konzentrieren, überführen Sie den Inhalt des 250-Milliliter-Kolbens, der das Virus enthält, auf einen Rührer. Erzeugen Sie mit einem Rührstab einen kleinen Wirbel. Geben Sie anschließend 0,1 Gramm Celite-Pulver zu 100 Milliliter Rinderextrakt hinzu. Lassen Sie das Celite dispergieren und bereiten Sie sich darauf vor, den pH-Wert der Lösung anzupassen. Durch tropfenweise Zugabe von 0,1-molarer Salzsäure senken Sie den pH-Wert auf 4,0 ab.
Dann die Lösung 10 Minuten lang mischen lassen. Währenddessen den 47-Milliliter-Vorfilter an einem Zwei-Liter-Kolben befestigen. Nun 100 Milliliter der Rinderextrakt-Celite-Mischung durch den Vorfilter gießen. Ein leichtes Vakuum kann zur Fertigstellung verwendet werden.
Als Nächstes wird eine Metallrohrklemme an der Ausgussöffnung eines Filtergehäuses befestigt. An die Klemme wird ein steriles 15-Milliliter-Polypropylen-Sammelröhrchen angebracht und anschließend der Filter wieder auf dem Kolben montiert.
Eluieren Sie nun das Virus von den Celite-Partikeln mit fünf Millilitern 1X PBS bei einem pH-Wert von neun. Lassen Sie den größten Teil des PBS durch Schwerkraft in die 15-Milliliter-Röhrchen laufen und ziehen Sie den Rest mit leichtem Vakuum durch. Um das Virus durch organische Flockung zu konzentrieren, überführen Sie den Inhalt des 250-Milliliter-Kolbens, der das Virus enthält, auf eine Rührplatte. Erzeugen Sie mithilfe eines Rührstabs einen kleinen Wirbel. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung durch tropfenweise Zugabe von einmolarer Salzsäure auf 3,5 ein. Lassen Sie die Mischung anschließend eine halbe Stunde lang rühren. Überführen Sie die Lösung danach in ein steriles kegelförmiges 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Lösung mit 2.500 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Achten Sie nach der Zentrifugation darauf, beim Umgang mit den Röhrchen das Pellet nicht aufzuwirbeln. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS mit pH 9. Stellen Sie sicher, dass das Pellet vollständig gelöst ist. Zentrifugieren Sie die erneut suspendierte Probe anschließend mit 4.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie nun den Überstand, der das konzentrierte Virus enthält. Das Pellet kann verworfen werden.
Bei der Optimierung dieses Protokolls wurden drei Arten von Celite verglichen. Gröberes Celite führte zu geringeren Ausbeuten sowohl von ADV 40 als auch von ADV 41.
Die Filterelution wurde bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 12 getestet, um festzustellen, welcher am effektivsten zur Gewinnung von ADV-Partikeln aus den Filtern ist. Die höchste Rückgewinnungsrate wurde mit einem Glas-Cellulose-Filter in Kombination mit Rinderextrakt bei pH 10 und Celite erzielt. Das Ergebnis war identisch mit ADV 40 und ADV 41.
Der Fleischextrakt bei pH 10 erwies sich als überlegen gegenüber der organischen Flockung.
Die optimierte Methode wurde mit der Zugabe von 25 % Trypsin verglichen und zudem mit der Supplementierung des Rinderextrakts mit 0,1 % Natriumpolyphosphat. Keine der Behandlungen verbesserte die ADV-Recovery signifikant.
Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 45 Minuten durchgeführt werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Optimierung der Virusrückgewinnung aus Wasserproben geringer Menge vor, wobei der Fokus speziell auf dem humanen Adenovirus liegt. Der Ansatz nutzt einen Glas-Cellulose-Filter und eine sekundäre Konzentrationstechnik, um die Rückgewinnungsraten zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Umweltwissenschaften
- Wasserqualität
Hintergrund
- Die Virusanreicherung aus Wasserproben ist entscheidend für die Umweltüberwachung.
- Bestehende Methoden erfordern oft große Probenmengen, was ihre Effizienz einschränkt.
- Die Optimierung von Rückgewinnungstechniken kann die Detektion und Analyse viraler Krankheitserreger verbessern.
- Humanes Adenovirus dient als Modell zur Überprüfung von Anreicherungsmethoden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Technik zur Identifizierung optimaler Bedingungen für die Virus-Konzentration.
- Beurteilung verschiedener Kombinationen aus Filtern und Elutionsverfahren zur Adenovirus-Rückgewinnung.
- Beschleunigung der Bewertung von Konzentrationsparametern unter Verwendung geringer Probenvolumina.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Glaszellulosefilters zur Adenoviruskonzentrierung.
- Anwendung einer sekundären Konzentrationsmethode mit Meerwasserlicht zur Elution.
- Vergleich verschiedener Kombinationen aus Filtern und Elutionsverfahren.
- Bewertung der Rückgewinnungsraten aus Proben von Leitungswasser.
Hauptergebnisse
- Der Glaszellulosefilter wies die höchsten Rückgewinnungsraten für Adenovirus auf.
- Die Sekundärkonzentrationstechnik Sea Light elutierte das Virus effektiv.
- Kleine Probenvolumina ermöglichten eine schnelle Bewertung mehrerer Konzentrationsparameter.
- Die Methode übertraf herkömmliche Techniken zur großvolumigen Konzentration.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik bietet eine effizientere Methode zur Gewinnung von Viren aus Wasserproben.
- Sie ermöglicht die schnelle Überprüfung verschiedener Konzentrationsbedingungen.
- Der Ansatz kann für andere virale Zielstrukturen über Adenoviren hinaus angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Optimierung der Virusrückgewinnung aus Wasserproben geringer Volumina ermöglicht eine schnelle Überprüfung von Konzentrationsparametern und unterstützt die frühe Entwicklung von Assays in der Umweltvirologie. Die Methode bietet einen skalierbaren und kosteneffizienten Ansatz zur Bewertung von Kombinationen aus Filtern und Elutionsverfahren, wodurch der Ressourcenverbrauch in Workflows zur präklinischen Pathogendetektion reduziert wird. Durch die Identifizierung optimaler Bedingungen für die Adenoviruskonzentration verbessert die Technik die Vorhersagesicherheit bei nachgeschalteten Nachweisverfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Virusrückgewinnungseffizienz bei verschiedenen Filtertypen und Elutionsbedingungen, um die Zielvalidierung bei der Detektion von Umwelt病原体 zu unterstützen.
- Operationaler Wert: Verwendet kleine Probenvolumina (1–10 L, simuliert mit 100 mL), um mehrere Variablen schnell zu testen, und beschleunigt so die Hypothesenbildung zur Optimierung der Virusanreicherung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Wiederfindungsraten (Prozentwiederfindung von AdV40 und AdV41), um die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Nachweisverfahren für Viren zu unterstützen.
- Operativer Wert: Bereitet validierte biologische Systeme (konzentriertes Virus in 5–30 mL) für nachgeschaltete Anwendungen wie Infektiositätsassays oder genomische Analysen vor.
- Strategischer Wert: Fördert die Bereitschaft zur Durchführung von Screening-Verfahren, indem ein schneller Vergleich elektropositiver Filter (Glas/Zellulose vs. Nano-Aluminiumoxid/Glas) sowie sekundärer Anreicherungstechniken (Celite vs. organische Flockung) ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verwendet humanes Adenovirus als krankheitsrelevantes Modell zur Beurteilung der Leistung von Konzentrationsmethoden und unterstützt so die translationale Biomarker-Entwicklung für wasserbürtige Krankheitserreger.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem konzentriertes Virus bereitgestellt wird, das für weitere Charakterisierungen geeignet ist.
- Strategischer Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Filter-Elutions-Kombinationen mit hoher Rückgewinnungsrate identifiziert werden (Glaszellulosefilter mit Rinderextrakt bei pH 10 und Seelicht).
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Hypothesenprüfung bis hin zur Identifizierung von Leitkeimen in der Umweltpathogendetektion ein und ermöglicht eine schnelle Iteration von Konzentrationsvariablen, bevor auf größere Volumina skaliert wird.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Filtrations- und Elutionsparametern, um Mechanismen der Virusfreisetzung von Oberflächen aufzuklären und die Rückgewinnungseffizienz zu optimieren.
- Screening: Liefert assaysbereite Virus-Konzentrate (5–30 mL) mit quantitativen Ergebnissen (Rückgewinnungsrate in Prozent) zum Vergleich von Bedingungen über verschiedene Filtertypen und elutionsfördernde Zusatzstoffe hinweg.
- Analytik: Ermöglicht die Messung abhängiger Variablen (Virusrückgewinnung mittels qPCR oder Infektiosität), um den Einfluss unabhängiger Variablen (Filtertyp, Elutions-pH, Celite-Partikelgröße) statistisch zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem konzentriertes Adenovirus bereitgestellt wird, das für die nachgeschaltete Validierung in Zellkultur oder tierischen Modellen geeignet ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Optimierung der Virus-Konzentration für verschiedene virale Zielstrukturen über Adenovirus hinaus und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Virusanreicherungsmethoden, indem mechanistische Unklarheiten durch systematische Bewertung von Filter- und Elutionsparametern verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Schritte (Elution mit Rinderextrakt, sekundäre Konzentrierung mit Sea Light, pH-Anpassung auf 4,0) und quantifizierbare Endpunkte (Prozentanteil der Rückgewinnung von AdV40 und AdV41).
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der Entwicklung von Pathogen-Nachweismethoden, indem optimale Bedingungen (Glaszellulosefilter, Rinderextrakt bei pH 10, Sea Light) mit der höchsten beobachteten Rückgewinnung identifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Anreicherungsmethoden für Umweltüberwachungsprogramme und verringert späte Ausfälle in Workflows zum Pathogen-Nachweis.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Virologie, Filtrationstechniken und präzisen Flüssigkeitshandhabung für das Anreichern von Viren, die Filtermontage und die Zentrifugationsschritte.
- Benötigt spezielle Geräte wie Vakuumfiltrationssysteme, Rührplatten, pH-Meter, Zentrifugen (mit einer Leistung von 2.500 G und 4.000 G) sowie sterile Schläuche und Sammelröhrchen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung von Lösungen (Rinderextrakt, Celite, HCl, PBS) und bei den Umweltbedingungen (Zentrifugation bei 4 °C, sterilen Bedingungen) voraus, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf verschiedene Virustypen oder Wasserprobenmatrizes angewendet wird, da die Rückgewinnungsrate je nach viralen Eigenschaften (z. B. Adenovirus-Serotyp) und Probenzusammensetzung (Leitungswasser gegenüber Umweltquellen) variieren kann.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit aseptischer Techniken beim Umgang mit Viren sowie mögliche Variabilität der Filterleistung von Charge zu Charge, was die Konsistenz der Elution beeinträchtigen kann.
