Name: Kapsel Serotypisierung Streptococcus pneumoniae Durch Latexagglutination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae durch Latexagglutination. Diese schnelle Methode erfordert kein Mikroskop und eignet sich ideal für diagnostische Mikrobiologie-Labore.

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Diese Arbeit war Teil des PneuCarriage-Projekts, das von der Bill and Melinda Gates Foundation mit Beitrag des Operational Infrastructure Support Program der Regierung von Victoria finanziert wurde.

1. Herstellung der in-house Latexreagenzien <ol><li> Herstellung von Glycin-gepufferter Kochsalzlösung (GBS) <ol><li> Fügen 1,5 g Glycin, 11,7 g Natriumchlorid und 100 ml destilliertem Wasser in einen 200-ml-Becherglas. </li><li> Mischen aufzulösen unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> Übertragen Mischung in einen 500 ml Messzylinder geben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 ml zu machen. </li><li> Übertragen Sie die Lösung zurück in die 200-ml-Becher, den pH-Wert und passen auf 8,2 mit 5 M Natriumhydroxid. HINWEIS: Natriumhydroxid ist ätzend, persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Filter sterilisiert die Lösung unter Verwendung von 0,22 um Filter und mehrere 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Speichern bei RT. </li></ol></li><li> Herstellung von GBS mit 0,2% Rinderserumalbumin <ol><li> Mit 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA)-Pulver und 100 ml GBS zu einem 200 ml Becherglas und Mischen zur Auflösung unter Verwendung eines Magnetrührers. </li><li> FilterSterilisieren der Lösung durch 0,22 um-Filter mit mehreren 60 ml-Spritzen in einen 250 ml preautoclaved Schraube verschlossenen Glasflasche. </li><li> Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Latex-Reagenz Vorbereitung <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul geeigneter Pneumokokken-Antiserum für die Latex-Reagenz vorbereitet (dh, Pool, Gruppe, Typ oder Faktor). Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Verdünnte Polystyrollatex-Teilchen 1:10 Zugabe von 120 ul Latex-Teilchen zu 1.080 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung. Hinweis: Dies kann in größeren Mengen hergestellt werden, sollte aber jedes Mal frisch die Latex-Reagenzien hergestellt werden, hergestellt werden. </li><li> Hinzufügen 1.000 ul der 01.10 Latex-Suspension (in Schritt 1.3.3 vorbereitet) an die 1,000 ul 01.40 Antiserum Suspension (in Schritt 1.3.2) hergestellt. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Bei 37 ° C auf einem langsam drehenden Rad (zB 4 rpm für ein Rad von 38,5 cm Durchmesser) für 2 h. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und sanft das Pellet in 2 ml steriler Kochsalzlösung. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1.100 x g. Überstand verwerfen und 1 ml GBS und sanft das Pellet. </li><li> Pipettieren der Latex-Suspension in einem markierten 5 ml Schraubdeckel-Röhrchen. Fügen Sie eine weitere 1 ml GBS. </li><li> 2 ml GBS, die 0,2% BSA (w / v) (pH 8,2) (im Schritt 1.2) hergestellt. Dann werden 40 ul 10% (w / v) Lösung von Natriumazid als Konservierungsmittel. HINWEIS: Natriumazid ist gefährlich, wenn eingeatmet, und ist ein Haut-und Augenreizstoff. Es ist wünschenswert, eine vorbereitete Lösung von 10% nicht zu kaufen, als die Pulverform, da die Inhalationsexposition minimiert. Persönliche Schutzausrüstung (einschließlich Handschuhen einesd Brille) sollten beim Umgang mit diesem Reagenz getragen werden. Weitere Informationen sind dem Sicherheitsdatenblatt für Details. </li><li> Speicher Latex-Reagenzien bei 4 ° C ist. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Negativkontrolle Latexreagenz <ol><li> Beschriften Sie eine 2 ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Rundbodenröhrchen werden verwendet, um das Absetzen der Teilchen, die Antikörper Anlage beeinflussen können, zu minimieren. </li><li> Mit Hilfe eines P1000 Pipette mit steriler Tipps hinzufügen 975 ul von GBS in den Mikrozentrifugenröhrchen, dann fügen Sie 25 ul normalen Kaninchen-Antiserum. Kehren Sie fünf Mal, um zu mischen. </li><li> Gehen Sie wie in den Schritten 1.3.3 bis 1.3.10 oben </li></ol></li></ol> 2. Qualitätskontrolle (QC) von Latex Reagenzien <ol><li> Bringen Latex-Reagenz auf RT. Unmittelbar vor der Verwendung vorsichtig mischen die Latex-Reagenz durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. </li><li> Überprüfen Reagenz für Autoagglutination durch Pipettieren von 15 ul auf einen Glasobjektträger und gehen Sie wie in den Schritten 4.7 und 4.8 unten. Es sollte keine sein eingglutination der Latexteilchen. Das Reagenz sollte erscheinen weiß und glatt. </li><li> Testen Sie das Reagenz gegen eine Reihe von niedrigen Durchgang Pneumokokken-Isolate. Verwenden Sie frisch gewachsenen Kulturen hergestellt, wie in Schritt 3 Das Panel der Isolate sollte Isolate der &quot;Ziel&quot;-Serotyp (der serotypspezifische für das Reagenz getestet) und &quot;Nicht-Ziel&quot;-Serotypen (Isolate von anderen Serotypen, die normalerweise nicht überschreiten sollte auch reagiert mit dem Reagenz). Mindestens ein Isolat von jeder Ziel und Nichtziel-Serotyp für jeden Latex-Reagenz unterzogen QC. Wenn es nur ein Ziel oder Nicht-Ziel-Serotyp Test zwei verschiedene Isolate des speziellen Serotyp. HINWEIS: Die Testplatte sollte mehrere Isolate von jedem Serotyp, von denen einige selten in invasive Erkrankungen und / oder Art Kultursammlungen sind, umfassen. Es ist bevorzugt, umfassen einige Wagen trennt, da sie oft anspruchsvollen Serotyp (Daten nicht gezeigt), wodurch eine weitere Testung des of der Reagenzien und sicherzustellen, dass die Reagenzien wahrscheinlich in der Lage, sowohl invasive Serotypisierung und Wagen isoliert sind. </li><li> Fahren Sie mit dem Testen von Latex-Reagenzien mit Ziel und Nicht-Ziel-Pneumokokken-Isolate nach dem in Schritt 3 und 4 unten beschriebenen Verfahren. </li><li> Qualitätskontrolle Reagenzien bei der Produktion und dann danach mindestens einmal jährlich. HINWEIS: Wenn ein Reagens nicht passieren, QC, muss der Ansatz verworfen und eine neue Vorbereitung gemacht. Im Falle von Wiederholungs QC Ausfall empfehlen wir die Reagenzien mit den in Ortika et al., 2013 8 und in der folgenden Diskussion beschrieben alternativen Verfahren hergestellt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der Pneumokokken-Kulturen für die Serotypisierung <ol><li> Mit einer sterilen Schleife wählen Sie eine Einzelkolonie des Pneumokokken- isolieren und streifen dieses heraus auf eine feste nichtselektiven Blut-Agar, so dass die primäre Inokulum umfasst etwa ein Drittel der Plattenoberfläche. Streak für einzelne Kolonien. HINWEIS: Die Teller aus defibriniertes Pferdeblut hergestellt oder Schafe sind geeignet; aber Blut-Platten mit menschlichem Blut oder Citrat-Tierblut hergestellt sind es nicht. </li><li> Inkubieren Platte O / N bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> Beachten Sie, das Wachstum auf der Platte für Reinheit und beurteilen, dass es ein ausreichendes Wachstum für die Serotypisierung. HINWEIS: Eine Reinkultur des Pneumokokken-Isolat wird für die Serotypisierung erforderlich. Nach unserer Erfahrung konfluent, oder in der Nähe von konfluenten Wachstum rund ein Drittel der Plattenoberfläche ist in der Regel ausreichend, um die Serotypisierung abzuschließen. Wie Pneumokokken-Kulturen können anfällig für Autolyse sein, sollten die Kulturen für die Serotypisierung vorbereitet innerhalb von 24 Stunden von Subkultur getestet werden. Der Kulturplatte Nehmen Sie nicht aus dem Inkubator mehr als 15 bis 20 Minuten, bevor die Serotypisierung beginnt. </li></ol> 4. Durchführung Latexagglutination Serotypisierung <ol><li> Entfernen Sie alle Latex-Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie für ca. RTrungsweise 30 min. Unmittelbar vor Gebrauch vorsichtig umdrehen die Rohre, um die Reagenzien zu mischen. </li><li> Beschriften Sie eine Mikroskop-Objektträger. </li><li> Zeigen 15 ul Negativkontrolle Latex-Reagenz auf den Objektträger. </li><li> Mit einer sterilen Einweg-1 ul-Schleife einen Schwung des Pneumokokken-Kultur, so dass die Schleife ist etwa halb voll. </li><li> Schmieren Sie vorsichtig das Inokulum auf die Oberfläche der Folie in der Nähe der Tropfen Negativkontrolle Latex-Reagenz. Das Inokulum ist auf dem Glasträger sichtbar. </li><li> Schnell und gründlich mischen den Impfstoff in die Negativkontrolle Latex-Reagenz mit der Schleife. Stellen Sie sicher, dass der Rückgang nicht weiter zu verbreiten als die Anfangsgröße. </li><li> Nehmen Sie den Schieber, halten sie an beiden Enden. Rock the slide und zurück für 1 min. Achten Sie darauf, um die Flüssigkeit in Bewegung zu halten langsam, und sicherzustellen, dass die Größe der Tropfen nicht zu. HINWEIS: Alternativ können Sie eine Platte Rocker. </li><li> Beachten makroskopischen Agglutination (dh durchbloßem Auge) und das Clearing der Suspension gegen einen schwarzen Hintergrund. </li><li> Wenn die negative Kontrolle Latex-Reagenz zeigt keine Agglutination oder Clearing weiterhin die Prüfung der Kultur, Austausch der Test Latex-Reagenzien für die Negativkontrolle Latex-Reagenz in Schritten von 4,1 bis 4,8 oben. Eine frische Schleife muss jedes Mal verwendet werden. Fahren Sie mit dem Testen der Latex-Reagenzien, beginnend mit den Pools. </li><li> Testen Sie jede der &quot;Pool&quot; Latex-Reagenzien in Folge, bis ein positiver Test erhalten wird. HINWEIS:. Die Reihenfolge der Prüfung der Pools kann in &quot;Runden&quot; durchgeführt werden, um die lokale Auftreten von bestimmten Serotypen (zB durch die Prüfung für die drei am ehesten Pools auf der ersten Folie zu reflektieren Wenn eine positive Reaktion nicht erhalten wird, dann testen die nächsten drei wahrscheinlichsten der verbleibenden Pools auf dem zweiten Schlitten und so weiter, bis eine positive Reaktion erhalten wird). Dies stellt sicher, dass die häufigsten Serotypen zuerst getestet, minimiert die Zeit und die benötigten Reagenzien. </li><li>Mit den Antiseren Herstellerschlüssel bestimmen, welche einzelnen Antiseren in der positiven Pool vertreten sind. </li><li> Testen Sie jede der in der positiven Pool enthalten individuell an die &quot;Gruppe&quot; oder &quot;Typ&quot; bestimmen Gruppen oder Typen wie in den Schritten 4,1 bis 4,8 oben. </li><li> Bestimmen Sie das Ergebnis anhand der Antiseren Herstellers Taste. Wenn ein &quot;Typ&quot; bestimmt (zB Serotyp 5), so ist keine weitere Prüfung erforderlich ist und dieses Ergebnis wird aufgezeichnet. </li><li> Wenn eine &quot;Gruppe&quot; bestimmt (zB Gruppe 19), dann finden Sie in der wichtigsten Hersteller, um die Faktoren zu bestimmen, getestet werden. Weiterhin Tests mit den einzelnen &#39;Faktor&#39; Latex-Reagenzien und bestimmen die endgültige Serotyp (zB Serotyp 19B). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Latexagglutination ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Pneumokokken-Serotyp. Handels Pneumokokken Latexagglutination Reagenzien sind verfügbar, aber sie derzeit nicht zu differenzieren alle bekannten Serotypen 10,12. Allerdings Latexagglutination Reagenzien können leicht in-house mit gekauft Antiseren gegen spezifische Antigene Pneumokokken-Kapsel angehoben hergestellt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren werden Antikörper passiv an Latexteilchen gebunden, um einen Satz von Latex-Agglutinations-Reagenzien zu machen. Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-spezifische Antikörper an die Latexpartikel gebunden zu befestigen, um Antigene auf den Polysaccharid-Kapsel der Pneumokokken isolieren 18,19. Die Latex-Teilchen an die Antikörper gebunden erlauben die spezifische Antikörper-Antigen-Reaktion ohne Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Latexagglutination ist eine geeignete Methode für die Hochdurchsatzlabor eind auch für ressourcenarmen Umfeld. Hauptvorteile des Verfahrens sind Latex-Agglutination, dass keine Spezialausrüstung erforderlich ist, um den Test durchzuführen, wurden die Reagenzien eine Haltbarkeit von mindestens 2 Jahren bei 4 ° C 8 gespeichert, und daß es kostengünstig, einfach und schnell durchführen soll. Serotypisierung eine Pneumokokken-Isolat von Latex-Agglutination dauert etwa 10 min und bis zu vier Latexreagenzien können parallel auf einer Folie getestet werden. Außerdem, wenn die Häufigkeit der Serotypen für die entsprechende Einstellung epidemiologischen bekannten Tests können in Runden beginnend mit den Pools, die die meisten gemeinsamen Serotypen ähnlich der Quellung Test 17 ​​durchgeführt werden. Dieser Ansatz minimiert die Anzahl von Tests erforderlich, um den Serotyp bestimmen. Das Verfahren ist auch sehr gut reproduzierbar zwischen verschiedenen Betreibern (Daten nicht gezeigt). Ein Nachteil der Latex-Agglutination Serotypisierung ist, dass die Herstellung der Reagenzien ist zeitaufwendig, wobei ca. 4 h; obwohl mehrere reagents leicht parallel hergestellt werden. Darüber hinaus sind einige Antigene über verschiedene Pneumokokken-Serotypen gemeinsamen, was in Kreuzreaktionen mit einigen Antiseren (zB Serotyp 29, 42 und Gruppe 35). Allerdings sind diese Kreuzreaktionen gut charakterisiert, wenn mit kommerziellen Antisera (die in der Regel präabsorbiert ist es, die problematischer kreuzreagierenden Antikörper zu entfernen) und zusätzliche Reaktions Tabellen werden durch den Hersteller, um zu unterscheiden, welche Serotyp vorhanden ist. Latex-Reagenzien können auch überqueren reagieren, wenn die Antikörper nicht richtig auf der Latexpartikel ausgerichtet; diese werden als QC Defekt erkannt. Nach unserer Erfahrung ist streng QC für den Erfolg dieser Methode, auch wenn im Handel erhältlichen Antiseren werden für die Produktion verwendet. QC dauert etwa 15 min pro Reagenz und beruht auf einem Satz von geeigneten QC-Isolate wie oben beschrieben. Die hier beschriebene Methode führt zu Reagenzien, die eine positive Reaktion gut wi gebendünn die Testphase. Nach unserer Erfahrung sind False Positives in der Praxis selten (Daten nicht gezeigt). Gelegentlich falsch negative Reaktionen werden beobachtet; in der Regel handelt es sich dabei um bekannte Probleme mit einem bestimmten Antiserum (zB kann der Serogruppe 6 Isolate nicht mit Pool B-Antiserum reagieren) oder Down-Regulation der Expression durch die Kapsel-Isolat. Verwendung der Serotypisierung algrorithm des Herstellers ist auch wichtig, da in den meisten Fällen eine falsche positive oder negative Reaktion auf einen &quot;blinden Ende&quot; Ergebnis führen. In diesen Fällen und wenn die Reaktionen sind schwer zu interpretieren, empfehlen wir wiederholen-Prüfung und / oder Prüfung durch eine alternative Methode, wie die Quellung Reaktion. Einige Fehlersuche wird gelegentlich benötigt, um zufrieden stellende Latex-Reagenzien zu machen. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Antikörper an Latexteilchen durch passive Adsorption 15,19 befestigt, so dass eine kritische Variable ist die Konzentration des Antikörpers verwendet, der bestimmt, wie gutdie Oberfläche der Latexpartikel bedeckt und die anschließende Ausrichtung der Antikörper aktiven Stellen 15,20. Folglich wird, wenn unzureichende oder überschüssige Antikörper an Latexteilchen gebunden, die Antikörper-Antigen-Reaktionen nicht optimal, und unbefriedigende Reagenzien hergestellt 15,20,21 werden. Als Antikörpertiter variieren zwischen verschiedenen Chargen von Antiseren, kann ein Standard-Set von Verdünnungen Reagenzien, die gut 8 durchführen nicht produzieren. Ein guter Ausgangspunkt ist, um eine Verdünnung von 1:40 von Antiserum zu verwenden, und wenn dies nicht erfolgreich ist, verdünnen das Antiserum weiter. Nach unserer Erfahrung in der Regel löst das Problem 8. In einer kleinen Anzahl von Fällen können Reagenzien schwache Agglutination, die nicht von Clearing der Suspension begleitet wird, wenn getestet mit Ziel isoliert zu zeigen. In diesen Fällen wird die Antiserum verdünnt nicht die Qualität des Reagens verbessern, aber zufriedenstellende Reagenzien üblicherweise durch Auslassen der Zentrifugation hergestellt und Waschschritte 8,22 </sup&gt;. Antikörper beschichtet Latexpartikel werden häufig in der diagnostischen Mikrobiologie zur Erkennung, Identifizierung oder Serotypisierung von vielen verschiedenen Mikroben 15,20 eingesetzt. Als solches kann das hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Herstellung Latex-Reagenzien für andere Zwecke, vorausgesetzt, dass geeignete Antiseren und ausreichend QC-Verfahren übernommen.

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Kindern im Alter von unter fünf Jahren weltweit, vor allem in einem ressourcenarmen Umfeld 1,2. Pneumokokken-Erkrankungen reicht von lokalisierten Infektionen zu lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Lungenentzündung, Sepsis und Meningitis 1,2. Mehr als 90 Serotypen von Pneumokokken wurden identifiziert, basierend auf Unterschieden in ihren Kapselpolysaccharid 3. Aktuelle Impfstoffe zielen auf den Kapsel-Polysaccharid und bieten Schutz vor den wichtigsten Serotypen invasive Erkrankungen verursachen 4. Serotypisierung Pneumokokken-Isolate ist wichtig für die Beurteilung der Auswirkungen der Impfung auf Wagen und Krankheit sowie die Bereitstellung umfassendere epidemiologische Informationen 5,6. Die aktuelle &quot;Goldstandard&quot;-Methode für Pneumokokken-Serotypisierung ist die Quellung Test, aber es ist zeitaufwendig und erfordert etwas Geschick, um perform 7. Latexagglutination ist eine Alternative Serotypisierung Verfahren von der Weltgesundheitsorganisation 7 empfohlen. Latexagglutination ist schnell und einfach durchzuführen, und wird weltweit in vielen Labors 8-11 eingesetzt. Wichtig ist, dass Latexagglutination vergleichbarer Genauigkeit auf die Quellung Test für Pneumokokken-Serotypisierung 10,12-14 gezeigt. Insgesamt ist diese Methode ideal für ressourcenarmen Umfeld sowie hohe Durchsatzlabors. Latex-Agglutinations-Reagenzien (&quot;Latex-Reagenzien &#39;) durch die Befestigung der Antikörper an Latexteilchen 15 angelegt. In einer positiven Reaktion agglutinieren diese markierten Teilchen in Gegenwart eines spezifischen Antigens. Kommerziellen Latex-Reagenzien sind für eine begrenzte Anzahl von Serotypen zur Verfügung. Latex-Reagenzien können auch in-house mit kommerziell erhältlichen Antiseren 10 hergestellt werden. Gemische von Antisera (&quot;Pools&quot;) sowie spezifische Antiseren gegen Pneumokokken-serogroups (zB Gruppe 19), einzelnen Serotypen (beispielsweise Serotyp 5) und an spezifische Antigene (&quot;Faktoren&quot;, zB., Faktor 19c erkennen Serotyp 19A) zum weiteren Definieren Serotypen innerhalb der Gruppen sind 16. Diese Handschrift beschreibt die Hauptschritte bei der Herstellung von Latexreagenzien mit passiven Befestigung von im Handel erhältlichen Antiseren gegen Latexpartikel. Die Qualitätskontrolle (QC) Aspekte dieses Verfahrens beschrieben, und ein Protokoll für die Verwendung von Latexreagenzien zur Serotypisierung Pneumokokken enthalten.

<table><tbody><tr><td>Mikropartikel auf Basis von Polystyrol, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Oder andere Volumina nach Bedarf</td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Antikörper Australien</td><td>NRS-1ml</td><td>Oder andere Volumina nach Bedarf, vor Gebrauch zur RT bringen</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antiseren</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Verschiedenes</td><td>Vor Gebrauch zur RT bringen <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Steriles Rinderalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Vor Gebrauch auf rRT bringen</td></tr><tr><td>Natriumazid 10%ige (v/v) Lösung&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Achtung: gefährlich bei Einatmen; haut- und augenreizend</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tuben, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Rundboden</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrierte Einweg-Impfösen 1 & Mikro; l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Objektträger 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Achtung: hochkorrosives</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeblut-Agar (HBA) Platten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Vor Gebrauch auf RT bringen <a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td></tr><tr><td>Drehrad</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol mit flachem Boden Schraubverschluss Röhrchen, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Spritzen ohne Nadeln</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Spritzenfiltereinheit, 0,22 &Mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Broschüre über Neufeld-Antiseren</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Schlüssel zur Bestimmung von Serotypen <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Schlüssel zum Pneumokokken-Faktor-Serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>Für die Bestimmung des Serotyps innerhalb der Gruppen <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>*Für die meisten Materialien</td><td></td><td></td><td></td> stehen alternative Quellen zur Verfügung</tr></tbody></table>

kapsel serotypisierung<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; durch latexagglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex-Agglutinationsreagenzien werden häufig in der mikrobiellen Diagnose, Identifizierung und Serotypisierung verwendet. Streptococcus pneumoniae (der Pneumokokken) ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Die derzeitigen Impfstoffe zielen auf die Pneumokokken-Kapsel ab, und es gibt über 90 Kapselserotypen. Die Serotypisierung von Pneumokokken-Isolaten ist daher wichtig für die Abschätzung der Auswirkungen von Impfprogrammen und für epidemiologische Zwecke. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Latexagglutination als alternative Methode zum "Goldstandard" Quellungstest für die Serotypisierung von Pneumokokken empfohlen. Die Latexagglutination ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode; und eignet sich daher sowohl für ressourcenarme Umgebungen als auch für Labore mit hoher Arbeitsbelastung. Latexagglutinationsreagenzien können im eigenen Haus unter Verwendung von Antikörpern aus kommerziell gewonnenen Quellen hergestellt werden, die passiv an Latexpartikel gebunden sind. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Herstellung und Qualitätskontrolle von Latexagglutinationsreagenzien und beschreibt einen sequentiellen Testansatz, der zeit- und kosteneffizient ist. 
Diese Methode der Produktions- und Qualitätskontrolle kann auch für andere Testzwecke geeignet sein.

Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-Typ-spezifischen Antikörpers an die Latexpartikel gebunden bindet an die Kapsel des Pneumokokkus, und die Agglutination der Partikel erfolgt Antikörper markiert 15. 1A zeigt eine positive Reaktion, die durch Agglutination und Löschen des Hinter gekennzeichnet Aufhängung. Eine negative Reaktion wird durch die verbleibenden glatt und weiß (1B) Latex-Agglutinations-Reagens-Suspension ist. Die Reagenzien werden so optimiert, dass eine positive Reaktion vor Ende des einen min-Zeitintervall (in der Regel in ca. 20 sec nachweisbar) beobachtet werden. Wir empfehlen nicht, liest Reaktionen nach der 1 min Zeitintervall. Sehr selten, zeigen Reaktionen schwache Agglutination um den Rand des Tropfens, die nicht durch das Löschen des Hinter Suspension begleitet wird, oder erscheint &quot;faserig&quot; ohne Hintergrund Clearing (Daten nicht gezeigt). Dies sind die meisten wie<html> ly negative Reaktionen. In solchen Fällen empfehlen wir die Wiederholung der Prüfung und / oder eine weitere Untersuchung mit einem anderen Serotyp Verfahren (zum Beispiel der Quellung Reaktion 17). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Positive und negative Reaktionen Latexagglutination. Zubereitungen von der Pneumokokken-Isolat mit Latex Agglutinationsreagenz zeigt eine positive Reaktion (A) oder eine negative Reaktion (B) gemischt. Agglutination begleitet von Räumung der Hintergrund ist in der positiven Reaktion (A) gesehen .There keine sichtbare Agglutination mit der Negativkontrolle Latexreagenz oder in einem negativen Testreaktion (B). Fotos 8 mit Genehmigung verwendet.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Isolate von Streptococcus pneumoniae mittels Antiseren, die an Latexpartikel gebunden sind, serologisch zu typisieren. Der erste Schritt der S-Serotypisierung eines pneumokokkalen Isolats ist der Test mit dem Latex-Reagenz der Negativkontrolle. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das pneumokokkale Isolat mit den Latex-Pool-Reagenzien zu testen, bis eine positive Reaktion beobachtet wird.Der dritte Schritt besteht darin, das Isolat mit den in dem positiven Pool enthaltenen Gruppen und Typen zu testen, wobei der vom Hersteller der Antiseren bereitgestellte Schlüssel verwendet wird, um die geeigneten Reagenzien für den Test auszuwählen. Der letzte Schritt ist der Test des Isolats mit allen erforderlichen Faktor-Latex-Reagenzien und anschließend die Interpretation der Ergebnisse mithilfe des vom Hersteller der Antiseren bereitgestellten Schlüssels, um den endgültigen Serotyp zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie dem Que-Test liegt darin, dass kein Mikroskop benötigt wird und sie relativ einfach und schnell durchzuführen ist.Beispielhaft führt dieses Verfahren Belinda, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor, durch. Beschriften Sie zunächst ein zwei Milliliter fassendes Mikrozentrifugenröhrchen. Wählen Sie ein Röhrchen mit rundem Boden, um zu verhindern, dass sich Partikel während der Antikörper-Bindungsphase absetzen.Unter Verwendung einer 1000-Mikroliter-Pipette 975 Mikroliter Glycin-gepufferte Salzlösung in das Röhrchen geben. Anschließend 25 Mikroliter des für das vorzubereitende Latexreagenz benötigten pneumokokkenhaltigen Antiserums hinzufügen. Fünfmal umstülpen, um zu mischen. Danach 120 Mikroliter Polystyrol-Latex-Partikel in 1080 Mikroliter steriler physiologischer Salzlösung verdünnen.Stellen Sie dies fünfmal auf den Kopf, um 1000 Mikroliter der Latexsuspension in 1000 Mikroliter Antiserumlösung pipettiert zu mischen. Stellen Sie dies fünfmal auf den Kopf, um es zu mischen, und überführen Sie es dann in einen 37 °C warmen Inkubator und platzieren Sie es auf ein langsam rotierendes Rad. Lassen Sie die Mischung zwei Stunden inkubieren; nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Partikel bei 1.100 ×g für 15 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1000-Mikroliter-Pipette. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter steriler Kochsalzlösung. Zentrifugieren Sie die Mischung erneut, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in einem Milliliter Glycin-gepufferter Kochsalzlösung.Überführen Sie die Suspension in ein 5-mL-Schraubverschlussgefäß und geben Sie einen weiteren Milliliter Glycin-gepufferte Salzlösung hinzu. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter Glycin-gepufferte Salzlösung mit 0,2 % BSA hinzu. Geben Sie dann 40 µL 10 %iger Natriumazid hinzu.Als Konservierungsmittel unbedingt die Sicherheitsdatenblätter beachten. Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit Natriumazid. Konsultieren Sie anschließend den Leitfaden des Antikörperherstellers, um die geeigneten Qualitätskontrollisolaten zur Prüfung gegenüber dem Reagenz zu bestimmen.Testen Sie dann das Reagenz unter Verwendung dieser positiven und negativen Kontrollstämme der Serotypen. Die Qualitätskontrolle ist sehr wichtig. Dieser Prozess stellt sicher, dass ein korrekt reagierendes Reagenz hergestellt wurde, was einen entscheidenden Kontrollschritt darstellt. Lagern Sie die Reagenzien, die die Qualitätskontrolle bestanden haben, bei vier Grad Celsius.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Kulturen. Wählen Sie mit einer sterilen Öse eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie ein Drittel einer nichtselektiven Blutagarplatte an. Streichen Sie anschließend die Platte, um Einzelkolonien zu erhalten.Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag, bevor SYP beginnt, nehmen Sie die Latexreagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur kommen.Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. Die Kultur muss rein sein und das Wachstum muss konfluent oder nahezu konfluent sein. Über ein Drittel der Platte hinaus mehrmals den Latex-Reagenz des negativen Kontrollansatzes umdrehen.Entnehmen Sie 15 Mikroliter und pipettieren Sie sie auf einen beschrifteten Objektträger. Nehmen Sie dann mit einer sterilen Ein-Mikroliter-Schleife eine Probe aus der Kultur, bis die Mitte der Schleife etwa halb gefüllt ist. Verteilen Sie den Inhalt der beladenen Schleife vorsichtig auf dem Objektträger in der Nähe des Tropfens mit negativem Kontrollreagenz. Das Inokulum sollte auf dem Glas sichtbar sein. Anschließend das Inokulum mit dem Öse in den Latex-Reagenstropfen einmischen. Dabei versuchen, den Tropfen nicht über den Objektträger zu verteilen.Heben Sie die Folie an beiden Enden an und schaukeln Sie sie sanft hin und her. Halten Sie die Flüssigkeit langsam in Bewegung und versuchen Sie, zu verhindern, dass der Tropfen sich auf dem Objektträger ausbreitet. Fahren Sie ein Minute lang mit dem Schaukeln fort und lesen Sie anschließend das Ergebnis ab.Die Ergebnisse erscheinen rot vor dunklem Hintergrund. Der Tropfen der Negativkontrollreagenzien sollte unverändert bleiben, ohne Agglutination oder Klärung. Sobald bestätigt ist, dass keine Reaktion mit dem Negativkontrollreagenz eintritt, beginnen Sie mit der Prüfung jedes Pool-Latexreagenz, bis eine positive Reaktion erzielt wird.Verwenden Sie für jeden Reagenz das gleiche Verfahren und eine neue sterile Öse. Normalerweise werden drei Proben pro Objektträger getestet. Schwenken Sie den Objektträger eine Minute lang, bevor Sie eine Reaktion beurteilen.Eine positive Latex-Reaktion tritt auf, wenn spezifische Antikörper, die an die Latex-Partikel gebunden sind, an die Kapsel des Pneumokokkus binden und es zur Agglutination markierter Partikel kommt. Dies geht in der Regel mit einer gewissen Klärung der Hintergrundsus­pension einher. Eine negative Reaktion zeichnet sich dadurch aus, dass die Latex-Reagenz-Sus­pension glatt und weiß bleibt, ohne dass Agglutination oder Klärung auftritt.Gelegentlich zeigen einige wahrscheinliche negative Reaktionen eine schwächere Agglutination am Rand des Tropfens, ohne dass eine Klärung der Hintergrundsus pension eintritt. Andere wahrscheinliche negative Reaktionen erscheinen fadenförmig, ohne Hintergrundklärung in beiden dieser zweifelhaften Fälle. Wiederholen Sie den Test oder versuchen Sie eine andere stereotypisierende Methode.Wenn eine positive Reaktion erzielt wurde, verwenden Sie den vom Hersteller bereitgestellten Schlüssel, um zu bestimmen, welche Gruppen oder Typen in diesem Poolgemisch enthalten sind. Anschließend testen Sie die Gruppen oder Typen, aus denen dieser Pool besteht, mit dem Isolat, bis eine positive Reaktion beobachtet wird. Wenn ein Typ identifiziert wurde, ist keine weitere Untersuchung erforderlich.Wenn jedoch eine Gruppe identifiziert wurde, konsultieren Sie den Schlüssel des Herstellers, um herauszufinden, welche Faktoren getestet werden müssen, um den Serotyp zu bestimmen. Sobald die Ergebnisse der Faktor-Tests vorliegen, konsultieren Sie erneut den Schlüssel, um den endgültigen Serotyp zu ermitteln. Wenn man diese einfache und kostengünstige Technik beherrscht, kann sie zur Serotypisierung verwendet werden.Ein Pneumokokkenisolat wird in 10 Minuten erreicht, wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Wir führen dieses Verfahren durch. Es ist wichtig, stets frische sterile Schleifen und Pipettenspitzen für jeden der Tests zu verwenden, um weder Ihre Proben noch Ihre Reagenzien gegenseitig zu kontaminieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Latex-Reagenzien zur Serotypisierung des Pneumokokkus herstellt und verwendet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine ​​zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.

Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine

Dieses Video zeigt einen Opsono-Adhärenz-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen opsonisierten Bakterien und Immunzellen. Fluoreszenzmarkierte Bakterien, die mit Testserum behandelt werden, das Anti-Kapsel-Antikörper enthält, werden mit Makrophagen inkubiert. Nach der Färbung der Makrophagen mit Fluoreszenz werden die auf der Makrophagenoberfläche anhaftenden Bakterien zur Visualisierung unter einem Mikroskop betrachtet.

Ein Opsono-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Opsonisierung von verkapselten Bakterien durch Anti-Kapsel-Antikörper

Experimentelle menschlichen Pneumokokken Wagen bietet ein natürliches Vorbild des Wagens und ein mögliches Modell für den Einsatz in der Entwicklung von Impfstoffen. Diese Technik ist wertvoll und doch komplex und beinhaltet klinisches Risiko durch die Einführung eines Erregers in einem Menschen. Wir haben ein detailliertes Protokoll entwickelt.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Die Quellung Reaktion ist der Gold-Standard-Technik für Serotypisierung Streptococcus pneumoniae. Diese Technik nutzt ein Mikroskop und Pneumokokken-spezifische Antiseren und wird häufig in Referenz-und Forschungslaboren weltweit eingesetzt.

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Der Opsono-Adhärenz-Assay ist eine alternative Methode zum opsono-phagozytischen Tötungstest zur Bewertung der Opsonic-Funktionen von Antikörpern in der Impfstoffentwicklung.

Opsono-Adherence Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Pathogene

Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Bei einer Infektion mit Mycoplasma pneumoniae können serologische Tests gute Ergebnisse liefern, jedoch aufgrund einer immunologischen Kreuzreaktion mit geringer Spezifität. Der hauseigene Antigen-Capture-ELISA, der in diesem Artikel beschrieben wird, garantiert eine hohe Speziesspezifität und hat sich als zuverlässiger Screening-Test für die genaue Diagnose von M. pneumoniae erwiesen.

Antigen-Capture Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum spezifischen Nachweis von Mycoplasma pneumoniae

Ein Dreikanal-Dual-Reporter-Fluoreszenz-Flussanalysesystem wurde verwendet, um einen Bead-basierten Multiplex-Immunoassay zu entwickeln, der gleichzeitig Serumproben auf IgG und IgM auswertet, die gegen mehrere Antigene verschiedener Borrelienspezies extrahiert wurden, die die Lyme-Borreliose in Europa und Nordamerika verursachen.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Lernen Sie die Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae durch Latexagglutination. Diese schnelle Methode erfordert kein Mikroskop und eignet sich ideal für diagnostische Mikrobiologie-Labore.

Kapsel Serotypisierung

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