Name: Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie die impedanzbasierte Echtzeitanalyse von Neuroprotektion in neuronalen Zelllinien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Second-Messenger-Signalwegen und die Identifizierung neuroprotektiver Verbindungen.

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Finanzielle Unterstützung für die in der Studie vorgestellten Experimente wurde durch das Marie-Heim-Vögtlin-Programm des Schweizerischen Nationalfonds zur Verfügung gestellt.
Wir danken Frau Johanna Nyffeler für die Entwicklung einer Reihe modifizierter MATLAB-Programme für das Screening auf statistisch signifikante Unterschiede in den Daten von Echtzeit-Zellanalysatoren und Dr. Yama Abassi für die hilfreiche Diskussion.

1. Vorbereitung <ol><li> Zeigen Station des Echtzeit-Zellanalysegeräts in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Führen Sie alle Zellkultur Handhabung und pharmakologische Behandlungen in einer Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen. </li><li> HINWEIS: Neuronale Zelllinien im Vergleich zu Standardbedingungen für die Kultur, die unterschiedliche Temperatureinstellungen, sollte entsprechend angepasst werden. Für schwach adhärenten Zelllinien verwenden Überzugsmittel, um die Wechselwirkung von Zellen mit der Goldmikroelektroden in den Boden der Vertiefungen der E-Platte 96 zu erleichtern. </li><li> Bereiten 1,000X Stammlösungen der pharmakologischen Verbindungen für die Zellkultur-Behandlung (neuroprotektive Mittel oder Second-Messenger-Wege-Inhibitoren in dem entsprechenden Lösungsmittel - Dimethylsulfoxid oder sterilem Wasser) und im Kühlschrank bei -20 ° C. Verwenden Sie in den folgenden Behandlungen das Lösungsmittel als Fahrzeug. </li><li> Kultur menschlicher Neuroblastomzellen SK-N-SH-Zellen in DMEM / F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Proliferationsmedium) in Zellkulturflaschen, ergänzt mit 175 cm 2 Oberfläche, um die Dichte von ca. 75%. Halten Zellpassage Zahl in einem Bereich (von etwa 10 Passagen), um die Konsistenz zwischen den Experimenten in Bezug auf Zellproliferationsrate und das Ansprechen auf die Zytotoxizität zu bestimmen. Niedergang Nummern werden bevorzugt. </li><li> Mit PBS waschen Die adhärenten SK-N-SH-Zellschicht und trypsinize mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen bei 170 × g für 5 min auf Trypsin zu entfernen. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Medium Proliferation. Zählen Sie die Zellen mit Scepter Zellzähler und stellen Sie die Zellzahl auf 300.000 Zellen / ml durch Verdünnung Zellen mit Proliferationsmedium. </li></ol> 2. Überzug und die Proliferation von SK-N-SH-Zellen <ol><li> 100 l Proliferationsmedium in jede Vertiefung der E-Plate 96 und lassen Sie es für 30 Minuten in der Gewebekultur Haube bei RT ins Gleichgewicht. Legen Sie die E-PlaTE 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation in dem CO 2-Inkubator bei 37 ° C aufweist. </li><li> Starten des Echtzeit-Zellanalysesoftware. Auf der Seite Layout auswählen die Brunnen im Experiment enthalten und geben Sie in die Eingabefelder die Informationen über Zelltyp, Zellzahl, Namen und Konzentrationen von chemischen Verbindungen für die Zellbehandlung eingesetzt. HINWEIS: Für die Zwecke dieses Protokolls mindestens 4 Wiederholungsversuche für jede Behandlung empfohlen. </li><li> Auf dem Spielplan Software Seite bestimmen &quot;Steps&quot; enthalten in dem Experiment, indem Sie die Anzahl der Durchläufe Messzelle Index und das Intervall zwischen den Durchläufen für jeden Schritt. Seit Schritt 1 ist für die Hintergrundmessung vorgegeben, wählen Sie &quot;einen Schritt&quot; und stellen Sie Schritt 2, um die Zelle Index alle 15 min für 96 Stunden messen. HINWEIS: Für Behandlungen, in denen Effekte mit schnellen Kinetik zu erwarten sind, eingestellt Sweeps in kürzeren Abständen. </li><li> Klicken Sie auf Start, um die automatisch vorgegebenen Schritt einzuleiten 1und messen Sie den Hintergrund Impedanz der Medien. Dieser Wert wird automatisch durch die Software an jedem Datenpunkt abgezogen, sobald die Zellen in die Vertiefungen gegeben. </li><li> Verwenden Sie den zuvor in Schritt 1.5) hergestellten Zellsuspension von 300.000 Zellen / ml in Proliferationsmedium. 30.000 Zellen / Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 15.000 Zellen / Well für die Zellproliferation Studien. Nehmen Sie die E-Plate und 100 l Zellsuspension pro Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 50 ul Zellsuspension und 50 ul Proliferationsmedium pro Vertiefung für die Zellproliferation Studien. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung plattiert muss für jede Zelllinie empirisch optimiert werden. </li><li> Vorsichtig schwenken, die E-Plate 96 für noch Plattierung der Zellen. Verlassen Sie die E-Plate 96 für 30 min in der Gewebekultur Haube bei RT, damit sich die Zellen absetzen gleichmäßig auf den Boden der Vertiefungen. </li><li> Legen Sie die E-Platte 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation und starten Sie Schritt 2 auf dem Spielplan S.Alter. Überwachungszelle Indexwerte während des Experiments, indem Sie die Zelle Kurven auf der Profilseite und der Ausgangszell Index-Daten auf dem Handy Index Seite der Software. </li></ol> 3. Serumentzug <ol><li> 24 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen, Pause das Experiment, und entfernen Sie die E-Plate 96 von der Echtzeit-Zellanalysestation. Verdünnen second messenger-Inhibitoren aus 1,000X Aktien mit DMEM / F12 Serum-freien Medium - bis 200 × Endkonzentration. Gönnen Zellen mit 1 ul Inhibitoren der zweiten Botenwege, um für ihre Beteiligung an der Neurotoxizität / Neuroprotektion 30 min vor Beginn der Zytotoxizität getestet werden, um die jeweiligen Signalwege hemmen. Bringen Sie die E-Plate 96 bis zum Bahnhof und wieder experimentelle Zellindex-Messungen. </li><li> Nach 30 Minuten Pause, das Experiment wieder. Proliferationsmedium sorgfältig vollständig zu entfernen aus der E-Plate 96 Brunnen mit einer Pipette (oder Multi-Kanal-Pipette), kümmert sich nicht um die adhärenten Zellschicht störenindem der Rand der Pipettenspitze an der Ecke des Bohrloches. Nach Zugabe von 200 ul / Vertiefung serumfreies DMEM / F12-Medium (Medium Serumentzug). Sicherzustellen, schnellen Austausch von Zellkulturmedium zur mechanischen Bewegung der Zellen zu minimieren. </li><li> Verdünnen Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung von 1,000X Lager mit Serum-freiem DMEM / F12-Medium und 200 × Endkonzentration getestet werden. 1 ul Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung und 1 ul Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade in den einzelnen Vertiefungen nach dem Versuchsplan getestet werden. </li><li> In Zellen, die für die Proliferation Studien Medium nicht zu ändern. Verdünnen Verbindungen von 1,000X Lager auf 200 × Endkonzentration in Proliferationsmedium getestet werden, behandeln mit 1 ul pro Well und weiter zu Kultur in Proliferationsmedium. </li><li> Wieder aufnehmen, das Experiment mit Zellindex-Messungen alle 15 min für 96 Stunden weiter wie vorher eingestellt wurde. </li></ol> 4. Daten Analyse <ol><li> Für Neurotoxizität / Neuroprotektion Daten normalisieren Zell Index bis zum letzten Zeitpunkt vor pharmakologische Behandlung oder mittlere Veränderung der Variation zwischen den Experimenten durch Auswahl von &quot;normalisierten Zell Index&quot; auf der Profilseite zu reduzieren und &quot;normalisieren Zeit&quot;. </li><li> Markieren Sie die Brunnen auf dem Grundstück Seite für den Versuchsbedingungen von Interesse und klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, um die normierten Zell Index-Kurven zeichnen. Beobachten der Kinetik der neurotoxischen / neuroprotektive Wirkung oder der zweiten Boten-Hemmung als normierte Zellenindex-Kurven als eine Funktion der Zeit. </li><li> Beachten Sie die Zellenindex-Kurven für die getesteten medikamentöse Behandlungen in Proliferationsmedium als Funktion der Zeit zu beurteilen, ob ein Effekt auf die Proliferation in der neuroprotektive / neurotoxische Wirkung beteiligt. </li><li> Exportieren Sie die Informationen für alle experimentellen Zell Index Zeitpunkten aus der Zelle Index Software Seite in eine Excel-Datei, um die statistische Auswertung der Ergebnisse zu initiieren <br/&gt; Hinweis: Als ein erster Schritt in der statistischen Analyse eine Reihe von MATLAB-Programme geändert, dass die Welch-t-Test zu verwenden, mit dem p-Wert aufgetragen halblogarithmisch, nutzen umgekehrte Achse gegen die Zeitskala (als Zusatzcode-Dateien zur Verfügung gestellt). Diese Programme erlauben, den p-Werte über den Zeitverlauf eines gesamten Echtzeit-Zellanalyseexperiment und somit helfen die Auswahl der Zeitpunkte für weitere detaillierte statistische Analyse. Siehe die Zusatzmaterial für die detaillierte Informationen zu den Programmen. </li><li> Für die statistische Analyse der Unterschiede in der Zellindexwerte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten, markieren Sie die Zelle Indexwerte an den jeweiligen Zeitpunkten aus der exportierten Excel-Datei. Analysieren Sie die Handy-Index-Werte für die ausgewählten Zeitpunkten mit One-Way-oder Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einer post-hoc-Test unter Verwendung statistischer Software. </li></ol>

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<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Publikationskosten für den aktuellen Video-Artikel wurden von &quot;ACEA Biosciences&quot; gesponsert.

Das aktuelle Protokoll stellt den Nutzen eines Echtzeit-Zellanalyse kontinuierlich und unter Label-freien Bedingungen bewerten die neuroprotektive / neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen in neuronalen Zelllinien und einen Einblick in die Second-Messenger-Signalwege in der Wirkung beteiligt zu gewinnen. Obwohl Dienstprogramm des Echtzeit-Zellanalysegerät zur Zytotoxizität und Wirkungen von Arzneimitteln auf die Zellproliferation zu untersuchen ist allgemein bekannt, haben nur wenige Studi...

Neuronale Zelltod spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Gehirn 1-bedingten Erkrankungen. Die Verfügbarkeit von zuverlässigen und Hochdurchsatz in vitro Toxizitätstests ist entscheidend, um einen besseren Einblick in die Mechanismen der Neurotoxizität zu gewinnen und zu helfen, wählen Sie neuroprotektive Moleküle als therapeutische Kandidaten in der Medikamentenentwicklung 2. Allerdings gibt es viele Einschränkungen am häufigsten in vitro Neurotoxizität assays.They verwendet beurteilen Neurotoxizität / Neuroprotektion zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt nicht erlaubt kinetische Auflösung; oft Etikett oder Sonde, die mit den Signalwegen stören können und weitere Studien in der gleichen Zellpopulation zu begrenzen, und sind oft arbeitsintensiv, und in vielen Fällen nicht bieten Einblick in den Mechanismus. In der vorliegenden Studie zeigen wir, den Nutzen eines Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse zu Neurotoxizität und Neuroprotektion in einer neuronalen Zelllinie in Echtzeit und unter bestimmen markierungsfreieBedingungen und um einen Einblick in nachgeschalteten Mechanismen, durch Analyse der sekundären Botenwege in der Wirkung beteiligt ist. Frühere Studien haben die Wirksamkeit der Echtzeit-Zellanalyse bestätigt Zytotoxizität sowie Effekte auf die Zellproliferation in Zelllinien im Vergleich zu Standardtechniken 3,4,5,6 bestimmen. Zum Beispiel wurde eine gute Korrelation zwischen den Ablesungen der Standardzelle Lebensfähigkeit WST-1-Assay und Zellindexwerte zu verschiedenen Zeitpunkten unter basalen Bedingungen und Proliferation nach zwei verschiedenen toxischen Paradigmen in HeLa-Zellen 3 beobachtet. A549 und MDA-MB-231-Zellen-Proliferation und Zytotoxizität der Mikrotubuli-Stabilisator Paclitaxel provoziert zeigten sehr ähnliche Werte, wenn sie von Zellenindex-Messungen bewertet und zur standard Sulforhodamin B (SRB) Test 4. In der neuronalen Zelllinie verewigt Neuronen im Hippocampus wurden HT-22 Zellindex-Messungen für ihre Fähigkeit t validierto detect Zellproliferation, Glutamat-Cytotoxizität und Zellschutz gegen die verbreiteten 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Assay 5. In der gleichen Studie die MTT-Test Ergebnisse und Zellindex-Messungen auch gut in der Messung der neuronalen Vorläuferzellen Proliferation, Zytotoxizität nach Wachstumsfaktoren Not und Rettung der Zytotoxizität von der Pan-Caspase-Inhibitor QVD 5 korreliert. Zytotoxizität in NIH 3T3-Zellen durch Vandetanib (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) induziert zeigte mit Zellenindex-Werte oder Neutralrot-Aufnahmetest gemessen 6 ähnliche Ergebnisse. Wir haben vor kurzem verwendet das Echtzeit-Zellanalysesystems neuroprotektiven Wirkungen des Serotonin-2A beurteilen (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten (±) -2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine Hydrochlorid (DOI) in einer neuronalen Zelllinie ( SK-N-SH-Zellen) und für die Einbeziehung seco gescreentnd messenger Wege durch Überwachen der Wirkung der chemischen Hemmung der beobachteten Neuroprotektion 7. Interessanterweise hat der 5-HT 2A-Rezeptor sowohl halluzinogene und nonhallucinogenic Agonisten (wie DOI und Lisurid, beziehungsweise), die sowohl gemeinsame als auch unterschiedliche Second-Messenger-Signalwege aktivieren kann 8. Die Vorteile der vorgestellten Technik sind, dass sie es ermöglicht, Informationen in Echtzeit auf das Überleben der Zellen im Laufe der Tage zu sammeln, zu beschreiben zweiten Botenwegen beteiligt, um den möglichen Beitrag der Proliferation Effekte auf die Neuroprotektion zu bewerten und eine optimale Zeit wählen für zusätzliche Endpunktstudien auf der gleichen Zellpopulation. Eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs in der Protokoll ist in 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; RTCA SP System-Bundle</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nr: 00380601030</td><td>Bestehend aus RTCA Analyzer, RTCA SP Station und RTCA Control Unit</td></tr><tr><td>E-Plate 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nr: 05232368001</td><td>Zur Kultivierung der Zellen, die in die RTCA SP Station</td></tr><tr><td>eingesetzt werden SK-N-SH Zellen</td><td>ATCC (in Partnerschaft mit LGC Standards)</td><td>HTB-11</td><td>Kann durch eine andere adhärente neuronale Zelllinie von Interesse ersetzt</td></tr><tr><td>werden DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>Ergänzt die Proliferation, aber kein Serumentzugsmedium</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Zur Kultivierung von Zellen, die später auf der E-Plate plattiert werden 96</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Zur Trypsinisierung von Zellen, die in Gewebekulturflaschen kultiviert</td></tr><tr><td>wurden Zepter 2.0 Zellzähler</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Zum Waschen der Zellen</td></tr> <tr><td>(&plusmn;)-DOI-Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A-Agonist für die Zellkulturbehandlung</td></tr><tr><td>LY-294002 Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K Inhibitor für die Zellkulturbehandlung</td></tr><tr><td>Lisuridmaleat</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>Verbindung mit agonistischer 5-HT2A-Aktivität zur Zellkulturbehandlung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Zum Auflösen von LY-294002 und Lisuridmaleat</td></tr></tbody></table>

echtzeit-impedanz-basierte zellanalyse als werkzeug, um molekulare signalwege in neurotoxizität und neuroprotektion in einem neuronalen zelllinie; delineate

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Viele Gehirn-bedingten Erkrankungen haben den Zelltod in ihrer Pathophysiologie beteiligt. In-vitro-Modellen verbessert, um neuroprotektive oder neurotoxischen Wirkungen von Drogen-und nachgelagerten Wegen beteiligt würde helfen, einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Neuroprotektion / Neurotoxizität und Wirkstoffentwicklung könnte potenziell zu erleichtern studieren. Allerdings haben viele der vorhandenen In-vitro-Toxizitätstests wesentliche Einschränkungen - die meisten Neurotoxizität und Neuroprotektion beurteilen an einem einzigen Zeitpunkt, ohne dass sich die Zeit-Verlauf und die Kinetik der Wirkung zu beobachten. Darüber hinaus würde die Möglichkeit, Informationen über nachgeschaltete Signalwege bei der Neuroprotektion in Echtzeit beteiligt sammeln von großer Bedeutung sein. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse neuroprotektive Effekte von Serotonin 2A (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten in einer neuronalen Zelllinie unter markierungsfreie Echtzeit-Condit bestimmenIonen unter Verwendung von Impedanzmessungen. Weiterhin zeigen wir, dass Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade können verwendet werden, um Moleküle der in der neuroprotektiven Wirkung beteiligt abzugrenzen. Wir beschreiben auch die Nützlichkeit dieser Technik zur Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Zellproliferation trägt zu einer beobachteten neuroprotektive Wirkung. Das System nutzt spezielle mikroPlatten als E-Platten, die alternierend Gold enthalten Mikroelektrodenarrays an der Bodenfläche der Vertiefungen als Zell-Sensoren dienen bezeichnet. Die Impedanz wird durch Auslesen der Anzahl der anhaftenden Zellen, Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Adhäsion modifiziert. Ein dimensionsloser Parameter genannt Zellenindex wird aus den elektrischen Impedanzmessungen abgeleitet und wird verwendet, um den Zellstatus repräsentieren. Insgesamt ermöglicht die Echtzeit-Impedanz-basierten Zell-Analysator für Echtzeit-, markierungsfreie Beurteilung der Neuroprotektion und Neurotoxizität, und die Bewertung der zweiten Messenger-Pfade Beteiligung, einen Beitrag zu mehrdetaillierte und hohem Durchsatz Beurteilung potenzieller neuroprotektive Verbindungen in vitro, zum Auswählen therapeutischen Kandidaten.

<html> Serumentzug führt zu einer Zellenindex-Werte, die ständig mit dem Echtzeit-Zellanalysegerät überwacht werden kann, zu verringern Neuro Stimuli zu den Zellen zu einer Abnahme in der Zell-Index-Werte, die in Echtzeit mit den vorgestellte Technik und die Dynamik der abhängig ist von der spezifischen neuro Stimulus und dem Zelltyp sucht überwacht werden können. Abbildung 2 zeigt die Zunahme der Zell Index bei SK-N-SH-Zellen in Proliferationsmedium bis zu e...

Verbesserte in vitro Neurotoxizitätstests würden die Identifizierung neuer neuroprotektiver Verbindungen unterstützen. Der Nutzen eines impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysators zur Bestimmung der Zytotoxizität und Zytoprotektion in neuronalen Zelllinien und zur Abgrenzung der Beteiligung von Second-Messenger-Signalwegen und damit zur Gewinnung eines Einblicks in den Mechanismus der Neuroprotektion wird vorgestellt.

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer impedanzbasierten Technik den Echtzeit-Zytoprotektionseffekt an einer neuronalen Zelllinie zu verfolgen, um die Beteiligung von Sekundärbotterstoffwegen an diesem Schutzprozess zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine neuronale Zelllinie unter proliferativen Bedingungen in einem impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysesystem kultiviert wird. Im zweiten Schritt werden potenziell relevante.Zweite Botenstoffwege werden pharmakologisch gehemmt, bevor die Zelllinie neuroprotektiven Behandlungen unterzogen wird. Anschließend wird der Zustand der neuronalen Zelllinie mittels eines Echtzeit-Zellanalysators unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verfolgt. Letztendlich kann eine statistische Analyse verwendet werden, um die Echtzeitbeteiligung von zweiten Botenstoffwegen am Zellschutz der neuronalen Zellen zu bewerten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Endpunkt-Neurotoxizitätsassays besteht darin, dass sie die Beurteilung von Tito-Schutz und Tito-Toxizität in neuronalen Zelllinien in Echtzeit und unter markierungsfreien Bedingungen ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, schnelle Fragestellungen im Bereich der molekularen Neurobiologie zu beantworten, indem sie eine effizientere Hochdurchsatzbewertung potenzieller neuroprotektiver Substanzen in vitro ermöglicht und Einblicke in die molekularen Mechanismen liefert, die an der Neuroprotektion beteiligt sind. Beginnen Sie damit, eine Schicht aus anhaftenden neuronalen Zelllinien zu waschen. Verwenden Sie beispielsweise hier humanen Neuroblastom-S-K-N-S-H-Zellen mit PBS und behandeln Sie die Zellen anschließend fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Trypsin.Entfernen Sie die Trypsinlösung durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 10 Milliliter Proliferationsmedium. Nach der Zellzählung verdünnen Sie die Zellen mit zusätzlichem Proliferationsmedium auf eine Konzentration von drei mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter, und equilibrieren Sie jedes Loch einer EPL-96-Platte mit 100 Mikrolitern Proliferationsmedium in einer Zellkulturbank bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten stellen Sie die EPL-96-Platte in eine Echtzeit-Zellanalysestation, die sich in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius befindet, und starten Sie die Software der Echtzeit-Zellanalyse.Danach auf der Layout-Seite die geeigneten Vertiefungen für das Experiment auswählen und den Zelltyp, die Zellanzahl sowie die Namen und Konzentrationen der interessierenden chemischen Verbindungen in die Eingabefelder auf der Software-Seite für den Ablaufplan eingeben, da Schritt eins voreingestellt ist. Für die Hintergrundmessung „Schritt hinzufügen“ auswählen und Schritt zwei so einstellen, dass alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 96 Stunden der Zellindex gemessen wird. Anschließend auf „Start“ klicken, um Schritt eins zu beginnen und die Hintergrundimpedanz des Mediums zu messen.Entfernen Sie nun das EPL und geben Sie 100 Mikroliter der Neuroblastom-Zellsuspension hinzu. Um jede experimentelle Vertiefung herum schwenken Sie das EPL 96 vorsichtig, um die Vertiefungen gleichmäßig zu beschichten, und inkubieren Sie die Platte anschließend eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube, damit sich die Zellen absetzen können. Danach laden Sie das EPL 96 wieder in die Station des Echtzeit-Zellanalysators ein und beginnen mit Schritt zwei. Um die Zellindexwerte während des gesamten Experiments zu überwachen, betrachten Sie die Zellkurven auf der Diagrammseite und die rohen Zellindexdaten auf der Zellindexseite nach 24 Stunden.Nach dem Ausplattieren der Zellen das Experiment anhalten und die Platte vom Echtzeit-Zellanalysesystem entfernen. Ein Mikroliter der frisch verdünnten Inhibitoren der gewünschten Substanz wird in jedes Loch pipettiert. Nach dem erneuten Einlegen der EPL 96 die Messungen des Zellindex nach 30 Minuten fortsetzen, das Experiment erneut anhalten und anschließend das Proliferationsmedium vorsichtig, aber zügig, aus jedem Loch entfernen, wobei die Pipettenspitze in die Ecke des Lochs gerichtet wird, um die anhaftende Zellschicht nicht zu stören. Unmittelbar danach 200 Mikroliter Serum-Entzugsmedium, einen Mikroliter der frisch verdünnten neuroprotektiven Verbindungen der gewünschten Substanz und einen Mikroliter der Inhibitoren der zweiten Botenstoff-Signalwege der gewünschten Substanz in die entsprechenden Löcher geben.Danach die Messungen des Zellindex im Abstand von jeweils 15 Minuten über einen Zeitraum von 96 Stunden fortsetzen, wie zuvor festgelegt, um die Daten zu analysieren. Wählen Sie nun auf der Diagrammseite die Funktionen für den normalisierten Zellindex und die normalisierte Zeit, um den Zellindex auf den letzten Zeitpunkt vor den Modifikationen der Zellkultur zu normieren, um die Variabilität zwischen den Experimenten zu verringern. Markieren Sie auf der Diagrammseite die Vertiefungen für die gewünschten experimentellen Bedingungen und klicken Sie auf „Hinzufügen“, um die Kurven des normalisierten Zellindex darzustellen.Exportieren Sie anschließend die experimentellen Daten für alle Zeitpunkte des Zellindex aus der Softwareseite für den Zellindex in eine Tabellenkalkulationsdatei, um die Unterschiede der Zellindexwerte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten statistisch zu analysieren. Wählen Sie im exportierten Tabellendokument die Zellindexwerte zu den jeweiligen Zeitpunkten aus. Analysieren Sie abschließend die Zellindexwerte für die ausgewählten Zeitpunkte mittels einfacher oder zweifacher Varianzanalyse, gefolgt von einem Post-hoc-Test. Mithilfe statistischer Software wird gezeigt, dass neurotoxische Stimuli zu einer Abnahme der Zellindexwerte führen; hier ist eine Zunahme des Zellindex zu erkennen, wenn die S-K-N-S-H-Zellen in Proliferationsmedium kultiviert werden, sowie ein Abfallen des Zellindex, gefolgt von einer Stabilisierung auf dem neuen, niedrigeren Niveau, nachdem die Zellen auf serumfreies Medium umgestellt wurden. Diese Entwicklungen sind in den vorliegenden Grafiken dargestellt.Der neuroprotektive Effekt von zwei Serotonin-2A-Rezeptor-Agonisten, 5 µM DOI und 20 µM IDE, die hinzugegeben wurden, als die Zellen mit serumfreiem Medium versorgt wurden, ist erkennbar. Eine wichtige Fragestellung in neuroprotektiven Studien ist, ob ein Effekt auf die Zellproliferation zur beobachteten Wirkung der Substanz auf das Zellüberleben beiträgt. In diesem Diagramm wird die fehlende Wirkung einer Behandlung mit 5 µM DOI auf die Proliferation von SKNS-Zellen gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Proliferation nicht zu dem beobachteten neuroprotektiven Effekt beiträgt.In diesem letzten Diagramm ist der Effekt der Behandlung mit 10 µM des Phosphatidylinositol-3-Kinase-Inhibitors LY 294002 auf das Zellüberleben sowie der neuroprotektive Effekt von DOI an serumverarmten SK-N-SH-Zellen zu erkennen. LY 294002 verhinderte den neuroprotektiven Effekt von DOI während der Serumverarmungsphase, zeigte aber auch eine eigene toxische Wirkung. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den CTO-Schutz in einer neuronalen Zelllinie mittels eines Echtzeit-Zellanalysators verfolgt und die Beteiligung von Sekundärbotterstoffwegen an diesem Schutz aufklärt.

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In diesem Video demonstrieren wir den Prozess der Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse, einschließlich der Proliferation adhärenter Zellen, über einen zellulären Impedanzassay. Dabei wirken die adhärenten Zellen als Isolatoren, die den Stromfluss zwischen den Elektroden begrenzen und die Impedanz erhöhen.

Zelluläre impedanzbasierte Analyse zur Überwachung zellulärer Prozesse in Echtzeit

Quelle: Mudduluru, G., et. al. Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Migration und Invasion von Krebszellen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt einen impedanzbasierten Assay zur Messung der Invasion und Migration von Glioblastom-Zellen. Die Zellen bauen die extrazelluläre Matrix ab, bewegen sich durch mikroporöse Membranen und haften an Elektroden, wodurch eine Impedanz erzeugt wird. Diese Echtzeitanalyse spiegelt ihr invasives Potenzial für Anwendungen in der Krebsforschung wider.

Impedanzbasierte Messungen der Invasion von Hirntumorzellen

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Dieses Manuskript beschreibt, wie fluidische Biochips mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen für den Einsatz in einem tragbaren elektrischen Zellsubstrat-Impedanzsensor für das Feld vorbereitet werden können.  Auch das Protokoll für die Durchführung eines Trinkwasser-Toxizitäts-Schnelltests mit dem Sensor wird beschrieben.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Hier demonstrieren wir die Verwendung der zellbasierten elektrischen Impedanz (CEI) als eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, um die Infektion und Replikation des Zika-Virus in menschlichen Zellen in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus ist der CEI-Assay nützlich für die Bewertung antiviraler Verbindungen.

Zellbasierte elektrische Impedanzplattform zur Evaluierung von Zika-Virus-Inhibitoren in Echtzeit

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Messung von Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns mit zwei impedanzbasierten Biosensoren als Reaktion auf Krebszellen und Zytokine

Wir haben ein Computer-Programm, um neuronale Morphologie Analyse entwickelt. In Kombination mit zwei bestehenden Open-Source-Analyse-Tools, führt unser Programm Sholl Analyse und bestimmt die Anzahl der Neuriten, Verzweigungspunkte, und Neuriten Tipps. Die Analysen werden, so dass lokale Änderungen in Neuriten Morphologie beobachtet werden durchgeführt.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Erfahren Sie die impedanzbasierte Echtzeitanalyse von Neuroprotektion in neuronalen Zelllinien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Second-Messenger-Signalwegen und die Identifizierung neuroprotektiver Verbindungen.

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate (Video) | JoVE Journal

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

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