Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine impedanzbasierte Technik zu verwenden, um den Echtzeit-Zytoschutz einer neuronalen Zelllinie zu verfolgen und die Beteiligung von Second-Messenger-Signalwegen am Schutzprozess abzugrenzen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine neuronale Zelllinie unter proliferativen Bedingungen in einem impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysator kultiviert wird. Im zweiten Schritt möglicherweise relevant.

Second-Messenger-Signalwege werden pharmakologisch gehemmt, bevor die Zelllinie neuroprotektiven Behandlungen unterzogen wird. Anschließend wird der Status der neuronalen Zelllinie mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysators unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen verfolgt. Letztendlich kann die statistische Analyse verwendet werden, um die Echtzeitbeteiligung von Second-Messenger-Signalwegen am Zytoschutz der neuronalen Zellen zu bewerten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Endpunkt-Neurotoxizitätsassays besteht darin, dass sie es ermöglicht, den Tito-Schutz und die Tito-Toxizität in neuronalen Zelllinien in Echtzeit und unter markierungsfreien Bedingungen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, schnelle Fragen im Bereich der molekularen Neurobiologie zu beantworten, indem sie zu einer besseren Hochdurchsatzbewertung potenzieller neuroprotektiver Verbindungen in vitro beiträgt und Einblicke in die molekularen Mechanismen gibt, die an der Neuroprotektion beteiligt sind. Beginnen Sie mit dem Waschen einer adhärenten neuronalen Zelllinienschicht. Hier werden zum Beispiel humane Neuroblastom-S-K-N-S-H-Zellen mit PBS verwendet und dann die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Trypsin versorgt.

Entfernen Sie das Trypsin durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen dann in 10 Millilitern Proliferationsmedium. Nach dem Zählen der Zellen verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von dreimal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter mit mehr Proliferationsmedium und äquilibrieren dann jede Vertiefung eines EPL 96 mit 100 Mikrolitern Proliferationsmedium in einer Gewebekulturhaube bei Raumtemperatur. Setzen Sie den EPL 96 nach 30 Minuten in eine Echtzeit-Zellanalysestation in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius ein und starten Sie die Echtzeit-Zellanalysesoftware.

Wählen Sie dann auf der Layout-Seite die entsprechenden Vertiefungen für das Experiment aus und geben Sie den Zelltyp, die Zellnummer sowie die Namen und Konzentrationen der chemischen Verbindungen, die Sie interessieren, in die Eingabefelder auf der Seite mit der Zeitplansoftware ein, da der erste Schritt voreingestellt ist. Wählen Sie für die Hintergrundmessung die Option Schritt hinzufügen aus, und legen Sie Schritt zwei fest, um den Zellindex 96 Stunden lang alle 15 Minuten zu messen. Klicken Sie dann auf Start, um den ersten Schritt zu starten und die Hintergrundimpedanz des Mediums zu messen.

Entfernen Sie nun das EPL und fügen Sie 100 Mikroliter der Neuroblastom-Zellsuspension hinzu. Schwenken Sie das EPL 96 vorsichtig zu jeder Versuchsvertiefung, um die Vertiefungen gleichmäßig zu beschichten, und inkubieren Sie dann die Platte bei Raumtemperatur in der Gewebekulturhaube, damit sich die Zellen nach einer halben Stunde absetzen können, laden Sie das EPL 96 zurück in die Echtzeit-Zellanalysestation und beginnen Sie mit Schritt zwei. Um die Zellindexwerte während des gesamten Experiments zu überwachen, zeigen Sie die Zellkurven auf der Diagrammseite und die Rohzellenindexdaten auf der Zellindexseite 24 Stunden

Nachdem Sie die Zellen plattiert haben, unterbrechen Sie das Experiment und entfernen Sie die Platte von der Echtzeit-Zellanalysestation. Geben Sie einen Mikroliter der frisch verdünnten Inhibitoren in jede Vertiefung, dann setzen Sie nach dem erneuten Laden des EPL 96 die experimentellen Zellindexmessungen nach 30 Minuten fort, unterbrechen Sie das Experiment erneut und entfernen Sie das Proliferationsmedium schnell, aber vorsichtig aus jeder Vertiefung, wobei Sie den Rand der Pipettenspitze auf die Ecke der Vertiefung richten, um eine Störung der anhaftenden Zellschicht zu vermeiden. Dann geben Sie sofort 200 Mikroliter Serumentzugsmedium in jede Vertiefung, einen Mikroliter der frisch verdünnten neuroprotektiven Verbindungen von Interesse und einen Mikroliter der Inhibitoren des zweiten Botenwegs von Interesse in die entsprechenden Vertiefungen.

Fahren Sie dann mit den Zellindexmessungen alle 15 Minuten für 96 Stunden fort, wie zuvor eingestellt, um die Daten zu analysieren, wählen Sie nun die Funktionen normalisierter Zellindex und normalisierte Zeit auf der Zeichnungsseite aus, um den Zellindex auf den letzten Zeitpunkt vor den Änderungen an der Zellkultur zu normalisieren. Um die Variation zwischen den Experimenten zu reduzieren. Markieren Sie auf der Diagrammseite die Vertiefungen für die gewünschten experimentellen Bedingungen, und klicken Sie auf Hinzufügen, um die normalisierten Zellindexkurven darzustellen.

Exportieren Sie dann die experimentellen Daten für alle Zellindex-Zeitpunkte von der Seite der Zellindex-Software in eine Tabellenkalkulationsdatei, um die Unterschiede in den Zellindexwerten unter den verschiedenen Behandlungsbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten statistisch zu analysieren. Wählen Sie die Indexwerte der Zellen zu den jeweiligen Zeitpunkten in der exportierten Tabellenkalkulationsdatei aus. Analysieren Sie schließlich die Zellindexwerte für die ausgewählten Zeitpunkte mit einer Ein- oder Zwei-Wege-Varianzanalyse, gefolgt von einem Post-hoc-Test. Unter Verwendung statistischer Software führen neurotoxische Reize auf die Zellen zu einer Abnahme der Zellindexwerte, hier zu einer Erhöhung des Zellindexes, wenn die S-K-N-S-H-Zellen in Proliferationsmedium gezüchtet werden, und dem Abfall des Zellindexes, gefolgt von einer Stabilisierung auf den neuen niedrigeren Niveaus nach Die Umstellung der Zellen auf Serumentzugsmedium ist in diesen Grafiken dargestellt.

Die neuroprotektive Wirkung von zwei Serotonin-, zwei a-Rezeptor-Agonisten, fünf Mikromolaren, DOI und 20 Mikromolaren IDE, die hinzugefügt wurden, wenn die Zellen mit Serumentzug, Medium gefüttert wurden, kann beobachtet werden. Eine wichtige Frage in Neuroprotektionsstudien ist, ob ein Effekt auf die Zellproliferation zu dem beobachteten zusammengesetzten Effekt auf das Zellüberleben beiträgt. In dieser Grafik wird gezeigt, dass die Behandlung mit fünf mikromolaren DOI nicht zur SKNS-Zellproliferation beiträgt, was darauf hindeutet, dass die Proliferation nicht zur beobachteten neuroprotektiven Wirkung beiträgt.

In dieser abschließenden Grafik ist die Wirkung der Behandlung mit 10 Mikromolaren des Phosphatidyl-initialen Drei-Kinase-Inhibitors LY 2 9 4 0 0 2 auf das Zellüberleben und die neuroprotektive Wirkung von DOI auf serumentzogene SK-NSH-Zellen zu beobachten. LY 2 9 4 0 0 2 verhinderte die neuroprotektive Wirkung von DOI während der Serumdeprivationsphase, zeigte aber auch eine gewisse toxische Wirkung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den CTO-Schutz in einer neuronalen Zelllinie mit einem Echtzeit-Zellanalysator verfolgen und die Beteiligung von Second-Messenger-Signalwegen am Schutz beschreiben können.